Summary
Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.
Abstract
Mielóide células dendríticas (DCs) são frequentemente usados para estudar as interações entre inata e adaptativa mecanismos imunológicos e da resposta inicial à infecção. Porque estes são os antígenos mais potentes células apresentadoras, as DCs são cada vez mais usado como um vetor de vacina para estudar a indução do antígeno específico respostas imunes. Neste vídeo, demonstramos o procedimento para a colheita tíbias e fêmures de um camundongo doador, o processamento da medula óssea e diferenciando DCs in vitro. As propriedades de mudança DCs após a estimulação: células dendríticas imaturas são fagócitos potente, enquanto DCs maduras são capazes de apresentação de antígenos e interação com CD4 + e CD8 + T. Essa mudança na atividade funcional corresponde à regulação alta de marcadores de superfície celular e produção de citocinas. Muitos agentes podem ser usados para DCs maduras, incluindo citocinas e ligantes toll-like receptor. Neste vídeo, demonstramos comparações de citometria de fluxo da expressão de duas moléculas co-estimulatórias, CD86 e CD40, e citocinas, IL-12, após a estimulação durante a noite com o tratamento CpG ou mock. Depois de diferenciação, DCs pode ser ainda mais manipulado para uso como um vetor de vacina ou para gerar antígeno-específicos respostas imunológicas in vitro por pulsos utilizando peptídeos ou proteínas, ou transduzidas utilizando vetores virais recombinantes.
Protocol
Este protocolo foi adaptado de Lutz et al 1.
Colheita e processamento de medula óssea
- Isolamento da tíbia e fêmur: Euthanize o mouse doador e pulverizar as pernas com etanol 70%. Segure o tornozelo primeiro firmemente com uma pinça sem corte e começar a cortar a pele e musculatura subjacente para expor a tíbia. Para evitar danos ao osso, cortados de forma lenta e paralelamente à tíbia, deixando intacta a articulação do joelho.
Para limpar o fêmur, imobilizar a articulação do joelho, segurando com uma pinça sem corte. Limpe a musculatura com um par de tesouras e pinças curvas. Continue para cima até que a articulação do quadril é exposto e tesoura pode ser colocado entre a cabeça do fêmur e do quadril. Retire os ossos, cortando entre o fêmur ea articulação do quadril e coloque em tampão fosfato salino (PBS) no gelo. - Remoção de medula óssea: Limpe musculatura restantes dos ossos usando tesouras e pinças curvas. Cortar as epífises de cada osso e localizar a cavidade central. Usando uma seringa de 10 ml carregado com PBS e uma 25G0.5 agulha ", lave a medula óssea em uma placa de Petri não-tecido revestido.
- Processamento de medula óssea: Use a ponta de borracha do êmbolo de uma seringa de 1ml para dissociar a medula óssea em uma suspensão de uma única célula (use um para cima e para baixo, não raspagem de movimento). Colete de medula óssea em um tubo falcon cônica, e enxágüe da medula óssea residual com PBS.
Cultura de células dendríticas
- Ressuspender as células em DC mídia e precursores contar DC em um hemocitômetro (Figura 1). Você vai ver as células de tamanhos variados; os precursores DC são as maiores e mais brilhantes. Diferencialmente contar apenas essas células. A partir de dois fêmures e duas tíbias de um tipo selvagem C57BL / 6 mouse (6-8 semanas de idade), você deve esperar entre 25-40 x 10 6 precursores DC total.
Figura 1
- Células de cultura a uma densidade de 2 x 10 5 precursores DC / DC mL em meio suplementado com 40 ng / mL recombinante murino GM-CSF. Células em placa não-tecido revestido placas de Petri de poliestireno.
Adicionar mídia (dia 3)
Para atualizar os meios de comunicação, adicione metade do volume total de mídia fresco suplementado com 40 ng / mL GM-CSF.
Substituir um terço dos meios de comunicação (dia 6) e maturação
Para atualizar os meios de comunicação, remova cuidadosamente um terço do volume total dos meios de comunicação e substituir esse volume com a mídia fresco DC suplementado com 40 ng / mL GM-CSF no dia 6 de cultura.
Se desejar, células dendríticas podem ser estimuladas para a maturação usando citocinas ou ligantes toll-like receptor. No vídeo, DCs foram maturados por estimulação durante a noite com 5 ng / mL CpG.
Colheita de células dendríticas
Cultura DC está completo (Figura 2). Células serão tanto em suspensão e frouxamente aderido à placa. Células aderidas pode ser removido raspando o prato com um raspador de cultura de tecidos e lavagem com PBS. O número total de células aumenta 5-8 vezes durante a semana de cultura e período de diferenciação, portanto, esperar para colher 1-1,6 x 10 6 células / mL. 
Figura 2
Reagentes
- DC media
- RPMI-1640 mídia, suplementado com:
- 10% de soro fetal bovino
- 100 UI / mL de penicilina
- Estreptomicina 100 mg / mL
- 1% L-glutamina
- 0,1% 2-mercaptoetanol
- 1X não-aminoácidos essenciais
- 1X piruvato de sódio
- Recombinante murino GM-CSF
- rmGM-CSF (Peprotech inc, New Jersey, nenhum catálogo. 315-03)
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Discussion
DCs são úteis para estudos de interações inata e adaptativa imune, e pode ser utilizado como um vetor de vacina. Neste vídeo, demonstramos os passos para isolar medula óssea e mielóide diferenciar células dendríticas in vitro. Após o período de cultura, essas células podem ser visualizados ao microscópio ambas as células como aderentes, que muitas vezes possuem dendrites, e células não-aderentes rodada. Os DCs pode ser ainda mais manipulados para apresentação de antígenos por pulsando com antígeno ou estimulados para a produção de citocinas e moléculas co-estimulatórias upregulation usando citocinas e / ou ligantes toll-like receptor (para revisão, ver Gilboa, 2008 (2)).
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Acknowledgments
JB é apoiada por bolseiros das Ciências Naturais e Engenharia do Conselho (NSERC). Apoio para este projeto foi fornecido pela Canadian Institutes of Health Research, Grant MOP-67066.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| recombinant murine GM-CSF | Reagent | Peptrotech | 315-03 |
References
- Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
- Gilboa, E.
