Summary
هذا الفيديو يوضح الإجراء للتمييز بين الخلايا الجذعية من نخاع العظم النخاعي الماوس. وأظهرت عزلة الماوس الساق وعظم الفخذ ، ومعالجة نخاع العظم. وتظهر الصور يتظاهرون مورفولوجية الخلية قبل وبعد التمايز ، والشخصيات التي تصور النمط الظاهري الخلية ونضوج IL - 12 الإنتاج التالية باستخدام CPG.
Abstract
وكثيرا ما تستخدم الخلايا الجذعية النخاعي (DCS) لدراسة التفاعلات بين آليات المناعة الفطرية والتكيف والاستجابة المبكرة للعدوى. لأن هذه هي أقوى مستضد تقديم الخلايا ، ويجري البلدان النامية تستخدم بشكل متزايد كناقل لقاح لدراسة تحريض مستضد محددة الاستجابات المناعية. في هذا الفيديو ، نبدي الداخلي للحصاد وtibias femurs ماوس من المانحين ، ومعالجة نخاع العظم والتفريق البلدان النامية في المختبر. تغيير خصائص البلدان النامية التحفيز التالية : الخلايا الجذعية غير الناضجة هي البالعات قوية ، في حين أن البلدان النامية قادرة على تنضج العرض والتفاعل مع مستضد CD4 + و + CD8 خلايا تي. هذا التغيير في النشاط الوظيفي يتوافق مع upregulation من علامات سطح الخلية والإنتاج خلوى. ويمكن استخدام العديد من وكلاء للبلدان النامية ناضجة ، بما في ذلك السيتوكينات وعدد يغاندس مستقبلات شبيهة. في هذا الفيديو ، ونظهر مقارنات تدفق cytometric للتعبير عن جزيئات تنشيطية شارك في اثنين ، و CD86 CD40 ، وخلوى و، IL - 12 ، في أعقاب التحفيز بين عشية وضحاها مع العلاج CPG أو وهمية. بعد التمايز ، ويمكن التلاعب بها البلدان النامية مزيد من استخدام كناقل لقاح أو لتوليد مستضد محددة الاستجابات المناعية التي ينبض في المختبر باستخدام الببتيدات أو بروتينات أو transduced باستخدام ناقلات فيروسية المؤتلف.
Protocol
وقد تم تكييف هذا البروتوكول من لوتز وآخرون 1
الحصاد ومعالجة نخاع العظم
- العزل من الساق والفخذ : الموت ببطء الماوس المانحة ورذاذ الأرجل مع الايثانول 70 ٪. فهم الكاحل first بحزم مع ملقط كليلة والبدء في قطع الجلد والعضلات الكامنة لفضح الساق. لتجنب إتلاف العظام ، وببطء وخفض مواز في الساق ، وترك سليمة مفصل الركبة.
لتنظيف عظم الفخذ ، لشل حركة مفصل الركبة بواسطة ملقط مع استيعاب حادة. نظيفة بعيدا عن الجهاز العضلي مع زوج من مقص حاد ملقط والمنحنية. تواصل التصاعدي حتى يتم كشف مفصل الورك ويمكن وضعها المقص بين رأس عظم الفخذ ومفصل الورك. إزالة العظام من خلال خفض مشتركة بين عظم الفخذ والورك ومكان في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) على الجليد. - إزالة نخاع العظم : تنظيف الجهاز العضلي المتبقي من العظام باستخدام مقص وملقط منحنية. قطع المشاش كل العظام وتحديد موقع مركز التجويف. استخدام حقنة 10ML محملة PBS و25G0.5 إبرة "، تدفق نخاع العظم في طبق بتري الأنسجة غير المغلفة.
- معالجة نخاع العظم : استخدام المطاط في نهاية المكبس من المحاقن 1mL أن تنأى نخاع العظم في تعليق وحيد الخلية (استخدام صعودا وهبوطا ، وليس إلغاء الحركة). جمع نخاع العظم في أنبوب الصقر المخروطية ، وشطف بقايا نخاع العظم مع برنامج تلفزيوني.
ثقافة من الخلايا الجذعية
- Resuspend الخلايا في وسائل الاعلام والسلائف العاصمة العد العاصمة على عدادة الكريات (الشكل 1). سترى خلايا ذات أحجام مختلفة ، والسلائف العاصمة هي أكبر وألمع. عد تفاضلي فقط هذه الخلايا. femurs من اثنين واثنين من tibias C57Bl البرية من نوع / 6 الماوس (6-8 أسابيع من العمر) ، يجب أن تتوقع ما بين 25-40 × 10 6 مجموع السلائف العاصمة.
الشكل 1
- ثقافة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 السلائف DC / 5 مل في وسائل الإعلام العاصمة تستكمل مع 40 نانوغرام / مل الفئران المعدلة وراثيا المؤتلف CSF. لوحة الخلايا في الأنسجة غير المغلفة لوحات بتري البوليسترين.
إضافة الوسائط (اليوم 3)
لتحديث وسائل الإعلام ، إضافة نصف الحجم الكلي للسائل الاعلام جديدة تستكمل مع 40 نانوغرام / مل GM - CSF.
استبدال ثلث وسائل الإعلام (يوم 6) ، والنضج
لتحديث وسائل الإعلام ، وإزالة بعناية ثلث إجمالي حجم وسائل الإعلام واستبدالها هذا الحجم مع وسائل الاعلام DC جديدة تستكمل مع 40 نانوغرام / مل GM - CSF في يوم 6 من الثقافة.
إذا رغبت في ذلك ، يمكن أن تحفز الخلايا الجذعية لنضوج باستخدام السيتوكينات أو مستقبلات يغاندس حصيلة شبيهة. في الفيديو ، كانت البلدان النامية التي نضجت التحفيز بين عشية وضحاها مع 5 نانوغرام / مل CPG.
حصاد الخلايا الجذعية
DC ثقافة كاملة (الشكل 2). وسوف تكون الخلايا في كل من التعليق وانضمت إلى لوحة فضفاضة. ويمكن إزالة الخلايا الالتزام عن طريق كشط الطبق بمنديل مكشطة الثقافة والشطف مع برنامج تلفزيوني. العدد الكلي للخلايا ستزيد 5-8 مرات خلال الثقافة لمدة أسبوع وفترة التمايز ، ولذلك ، نتوقع أن الحصاد 1-1،6 × 10 6 خلية / مل. 
الشكل 2
الكواشف
- العاصمة وسائل الإعلام
- RPMI - 1640 وسائل الإعلام ، على أن تستكمل مع :
- 10 ٪ مصل بقري جنيني
- 100 وحدة دولية / مل من البنسلين
- 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين
- 1 ٪ L - الجلوتامين
- 0.1 ٪ 2 - المركابتويثانول
- 1X غير الأحماض الأمينية الأساسية
- 1X الصوديوم البيروفات
- الفئران المعدلة وراثيا المؤتلف - CSF
- rmGM - CSF (Peprotech المؤتمر الوطني العراقي ، ونيو جيرسي ، أي الكتالوج. 315-03)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البلدان النامية هي مفيدة لدراسات التفاعلات المناعية الفطرية والتكيفية ، ويمكن استخدامها كناقل اللقاح. في هذا الفيديو ، وقد برهنا على خطوات لعزل النخاع العظمي والخلايا الجذعية التفريق النخاعي في المختبر. بعد فترة الثقافة ، ويمكن تصور هذه الخلايا مجهريا كل من الخلايا الملتصقة والتي غالبا ما تمتلك التشعبات وخلايا مستديرة غير ملتصقة. ويمكن للبلدان النامية لمزيد من التلاعب العرض مستضد التي ينبض مع مستضد أو تحفيز للإنتاج خلوى وcostimulatory upregulation جزيء باستخدام السيتوكينات و / أو مستقبلات يغاندس حصيلة مثل (للمراجعة ، انظر جلبوع ، 2008 (2)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
معتمد من قبل JB منحة دراسية من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث (NSERC). تم تقديم الدعم لهذا المشروع من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة والمنح MOP - 67066.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| recombinant murine GM-CSF | Reagent | Peptrotech | 315-03 |
References
- Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
- Gilboa, E.
