Summary
Deze video toont de procedure voor de differentiatie van myeloïde dendritische cellen van de muis beenmerg. Isolatie van de muis scheenbeen en dijbeen, en verwerking van het beenmerg worden aangetoond. Foto's tonen celmorfologie voor en na de differentiatie, en figuren afbeelden cel fenotype en IL-12 productie na rijping met behulp van CpG worden weergegeven.
Abstract
Myeloïde dendritische cellen (DC's) worden vaak gebruikt om de interacties tussen de aangeboren en adaptieve immuun mechanismen en het begin van de reactie op de infectie te bestuderen. Omdat dit de meest potente antigeen presenterende cellen, worden DCs steeds meer gebruikt als vaccin vector voor de inductie van antigeen-specifieke immuunrespons te bestuderen. In deze video, tonen we de procedure voor het oogsten dij-en bovenbenen van een donor muis, de verwerking van het beenmerg en differentiëren DC's in vitro. De eigenschappen van DCs te veranderen na stimulatie: onrijpe dendritische cellen zijn krachtige fagocyten, terwijl de rijpe DCs zijn in staat om antigeen presentatie en interactie met CD4 + en CD8 + T-cellen. Deze verandering in functionele activiteit komt overeen met de opregulatie van celoppervlaktemerkers en cytokine productie. Veel agenten kunnen gebruikt worden om te rijpen DC's, zoals cytokines en toll-like receptor liganden. In deze video, tonen we flowcytometrische vergelijkingen van de expressie van twee co-stimulerende moleculen, CD86 en CD40, en de cytokine, IL-12, na 's nachts stimulatie met CpG of modellen behandeling. Na de differentiatie, kan DCs verder worden gemanipuleerd voor gebruik als een vaccin vector of om antigeen-specifieke immuunrespons te genereren door in vitro pulserende met behulp van peptiden of eiwitten, of met behulp van recombinante getransduceerde virale vectoren.
Protocol
Dit protocol is een aangepaste versie van Lutz et al. 1.
Oogst en verwerking van het beenmerg
- Isolatie van het scheenbeen en dijbeen: euthanaseren de donor muis en spuit de benen met 70% ethanol. Stevig vastpakken de eerste enkel met stompe tang en begint weg te snijden van de huid en de onderliggende spieren aan het scheenbeen bloot te leggen. Om te voorkomen dat schade aan het bot, langzaam en parallel gesneden om de tibia, waardoor het kniegewricht intact.
Voor het reinigen van het dijbeen, immobiliseren het kniegewricht door vast te pakken met stompe tang. Reinig de spieren weg met een scherpe schaar en gebogen pincet. Ga verder naar boven tot aan het heupgewricht wordt blootgesteld en een schaar kan worden geplaatst tussen de kop van het dijbeen en het heupgewricht. Verwijder de botten door te snijden tussen femur en heup en plaats in de fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs. - Verwijderen van het beenmerg: Schoon overgebleven spieren van de botten met een schaar en gebogen pincet. Snijd de epifysen van elk bot en zoek het midden holte. Met behulp van een 10 ml spuit vol met PBS en een 25G0.5 "naald, spoelt het beenmerg in een niet-gecoate weefsel petrischaal.
- Verwerking van het beenmerg: Gebruik de rubberen uiteinde van de zuiger van een 1 ml spuit om het beenmerg dissociëren in een single-celsuspensie (gebruik een op en neer, niet schrapen beweging). Verzamel beenmerg in een conische falcon buis, en spoel resterende beenmerg met PBS.
Cultuur van dendritische cellen
- Resuspendeer cellen in DC media en tel DC voorlopers op een hemocytometer (figuur 1). U ziet de cellen van verschillende grootte, de DC-precursoren zijn de grootste en helderste. Differentieel tellen alleen deze cellen. Van twee dijbeen en twee dij van een wild-type C57Bl / 6 muis (6-8 weken oud), kunt u verwachten tussen de 25 tot 40 x 10 6 in totaal DC-precursoren.
Figuur 1
- Cultuur-cellen bij een dichtheid van 2 x 10 5 DC voorlopers / ml in DC media aangevuld met 40 ng / ml recombinant muizen GM-CSF. Plaat cellen in niet-weefsel-gecoate polystyreen petri platen.
Voeg media (dag 3)
Op te frissen de media, voeg de helft van het totale volume van vers medium aangevuld met 40 ng / mL GM-CSF.
Vervang een derde van de media (dag 6) en rijping
Op te frissen de media, verwijder voorzichtig een derde van het totale volume van de media en vervang dit volume met verse DC media aangevuld met 40 ng / mL GM-CSF op dag 6 van de cultuur.
Indien gewenst, kan dendritische cellen worden gestimuleerd om te rijpen gebruik van cytokines of toll-like receptor liganden. In de video, kregen ontwikkelingslanden gerijpt door 's nachts stimulatie met 5 ng / mL CpG.
Oogst van dendritische cellen
DC cultuur is voltooid (figuur 2). Cellen worden zowel in suspensie en losjes gehandeld op grond van de plaat. Aangehouden cellen kunnen worden verwijderd door schrapen de schotel met een weefselkweek schraper en spoelen met PBS. Het totale aantal cellen zullen 5-8 voudige toename in de week-lange cultuur en differentiatie periode, daarom verwachten dat 1 tot 1,6 x 10 6 cellen / ml oogst. 
Figuur 2
Reagentia
- DC media
- RPMI-1640 media, aangevuld met:
- 10% foetaal runderserum
- 100 IU / ml penicilline
- 100 ug / ml streptomycine
- 1% L-glutamine
- 0,1% 2-mercapto-ethanol
- 1X niet-essentiële aminozuren
- 1X natriumpyruvaat
- Recombinant muizen GM-CSF
- rmGM-CSF (Peprotech inc, New Jersey, catalogus zonder. 315-03)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DC's zijn nuttig voor studies van aangeboren en adaptieve immuunsysteem interacties, en kan worden gebruikt als vaccin vector. In deze video, hebben we aangetoond dat de stappen om beenmerg te isoleren en te differentiëren myeloïde dendritische cellen in vitro. Na de cultuur periode kunnen deze cellen microscopisch gevisualiseerd worden zowel als hechtende cellen, die vaak beschikken over dendrieten, en niet-klevende ronde cellen. De DCS kan verder worden gemanipuleerd voor antigeen presentatie door pulseren met een antigeen of gestimuleerd om cytokine productie en costimulatoire molecuul up-regulatie met behulp van cytokines en / of toll-like receptor liganden (voor overzicht, zie Gilboa, 2008 (2)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
JB wordt ondersteund door studiebeurzen van het Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC). Steun voor dit project is verstrekt door de Canadese Institutes of Health Research, Grant MOP-67066.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| recombinant murine GM-CSF | Reagent | Peptrotech | 315-03 |
References
- Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
- Gilboa, E.
