Kultur av myeloisk dendritiska celler från benmärg prekursorer

Summary

Denna video demonstrerar förfarandet för att skilja myeloisk dendritiska celler från benmärg från mus. Isolering av mus skenbenet och lårbenet, och bearbetning av benmärg demonstreras. Bilder visar cellmorfologin före och efter differentiering och figurer föreställande cell fenotyp och IL-12 produktionen efter mognad med CpG visas.

Abstract

Myeloisk dendritiska celler (DC) används ofta för att studera samspelet mellan medfödda och adaptiva immunförsvaret mekanismer och de tidiga svar på infektion. Eftersom dessa är de mest potenta antigenpresenterande celler, är DC alltmer används som ett vaccin vektor att studera induktion av antigen-specifika immunsvar. I denna video visar vi förfarandet för skörd skenben och lårben från en donator mus, bearbetning benmärgen och differentierande utvecklingsländernas in vitro. Egenskaperna hos utvecklingsländernas förändring efter stimulering: omogna dendritiska celler är potenta fagocyter, medan mogna Utvecklingsländerna kan antigen presentation och interaktion med CD4 + och CD8 + T-celler. Denna förändring i funktionell aktivitet motsvarar det uppreglering av markörer cellytan och cytokin produktion. Många agenter kan användas för att mogna utvecklingsländerna, inklusive cytokiner och Toll-like ligander receptorn. I denna video visar vi flödescytometrisk jämförelser av uttrycket av två co-stimulerande molekyler, CD86 och CD40, och cytokin, IL-12, efter natten stimulering med CpG eller modeller behandling. Efter differentiering kan utvecklingsländernas ytterligare manipuleras för att användas som ett vaccin vektor eller för att generera antigenspecifika immunsvar genom in vitro pulserande använda peptider och proteiner, eller transduced med rekombinanta, virala vektorer.

Protocol

Detta protokoll är en anpassning av Lutz et al. ¹

Skörd och bearbetning av benmärg

1. Isolering av skenbenet och lårbenet: euthanize givaren musen och spraya benen med 70% etanol. Fatta det första vristen ordentligt med trubbig pincett och börjar skära bort huden och underliggande muskulatur att exponera skenbenet. För att undvika skador på ben, skära långsamt och parallellt med skenbenet och lämnar knäleden intakt.
   
   För att rengöra lårbenet, immobilisera knäleden genom att fatta tag med trubbig pincett. Rensa bort muskulaturen med ett par vassa saxar och böjda pincett. Fortsätt uppåt tills höftleden är utsatt och sax kan placeras mellan huvudet på lårbenet och höftleden. Ta bort benen genom att skära mellan lårbenet och höftleden och placera i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på is.
2. Borttagning av benmärg: Renlighet kvarvarande muskulatur från benen med hjälp av sax och böjda pincett. Skär av epifyser av varje ben och hitta centrum hålighet. Använd en 10ml-spruta laddad med PBS och en 25G0.5 "nål, spola benmärgen till en icke-vävnad belagda petriskål.
3. Handläggning av benmärg: Använd gummi änden av kolven från en 1 ml spruta att skilja benmärgen i en encelliga fjädring (använd ett upp och ner, inte skrapa rörelse). Samla benmärg i en konisk falk rör och skölj kvarvarande benmärg med PBS.

Kultur av dendritiska celler

1. Resuspendera cellerna i DC-medier och räkna DC prekursorer på ett hemocytometer (Figur 1). Du kommer att se celler av varierande storlek, DC prekursorer är de största och ljusaste. Differentiellt räknas bara dessa celler. Från två lårben och två skenben av en vild-typ C57BL / 6 mus (6-8 veckor) bör du räkna med mellan 25-40 x 10 ⁶ totalt DC prekursorer.
   
   
   
   Figur 1
   
   
2. Kultur celler vid en densitet på 2 x 10 ⁵ DC prekursorer / ml i DC media kompletteras med 40 ng / ml rekombinant murin GM-CSF. Plate celler i icke-vävnads-plåt polystyren Petri.

Lägg till media (dag 3)

Om du vill uppdatera media, lägg hälften av den totala volymen färska media kompletteras med 40 ng / mL GM-CSF.

Byt ut en tredjedel av media (dag 6) och mognad

Om du vill uppdatera media försiktigt bort en tredjedel av den totala volymen av media och ersätta denna volym med färska DC media kompletteras med 40 ng / mL GM-CSF på dag 6 av kultur.

Om så önskas kan dendritiska celler stimuleras till mognad med cytokiner eller Toll-like ligander receptorn. I videon var DC mognat genom natten stimulering med 5 ng / mL CpG.

Skörd av dendritiska celler

DC-kulturen är klar (Figur 2). Cellerna kommer att vara både i suspension och löst anslutit sig till plattan. Följas celler kan tas bort genom att skrapa skålen med en vävnadsodling skrapa och sköljning med PBS. Det totala antalet celler som kommer att öka 5-8 gånger under den veckolånga kultur och differentiering period, därför förvänta sig att skörda 1-1,6 x 10 ⁶ celler / ml.

Figur 2

Reagenser

1. DC-media
   1. RPMI-1640 medier, kompletteras med:
   2. 10% fetalt bovint serum
   3. 100 IE / ml penicillin
   4. 100 mikrogram / ml streptomycin
   5. 1% L-glutamin
   6. 0,1% 2-merkaptoetanol
   7. 1X icke-essentiella aminosyror
   8. 1X natrium pyruvat
      
2. Rekombinant murina GM-CSF
   1. rmgm-CSF (Peprotech Inc, New Jersey, katalog nr. 315-03)

Discussion

Utvecklingsländerna är användbara för studier av medfödda och adaptiva immunförsvaret interaktioner, och kan användas som ett vaccin vektor. I den här filmen har vi visat att åtgärder för att isolera benmärg och differentiera myeloisk dendritiska celler in vitro. Efter kultur perioden, kan dessa celler kan visualiseras i mikroskop både som anhängare celler, som ofta har dendriter, och icke-häftande celler runt. DCS kan ytterligare manipuleras för antigen-presentation av pulserar med antigen eller stimuleras vid cytokin produktion och co-stimulerande molekyler uppreglering med cytokiner och / eller Toll-like ligander receptor (för översikt se Gilboa, 2008 (2)).

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
recombinant murine GM-CSF	Reagent	Peptrotech	315-03