הדור של מח עצם נגזר תאים דנדריטים Murine לשימוש 2-פוטון הדמיה

Summary

מצגת Antigen באיברים הלימפה משני על ידי התאים הדנדריטים הוא קריטי עבור ייזום של תא T בתיווך תגובה חיסונית אדפטיבית. כאן אנו מדגימים את התרבות של מוח העצם נגזר תאים דנדריטים Murine, הפעלה, וסימון עבור הדמיה 2-פוטון.

Abstract

כמה שיטות להכנת תאים דנדריטים Murine ניתן למצוא בספרות. כאן, אנו מציגים שיטה המייצרת יותר מ 85% תאים דנדריטים CD11c גבוה תרבות הביתה הצומת לימפה ניקוז לאחר הזרקה תת עורית ו אנטיגן ספציפי לערמונית להציג לתאי T (ראה וידאו). בנוסף, אנו משתמשים מכשירים אסן Incucyte לעקוב אחר ההבשלה תאים דנדריטים, שם, ב 10 יום, את המורפולוגיה של תאים בתרבית אופייני של תא בוגר הדנדריטים <85% של תאים CD11chigh. המחקר של המצגת אנטיגן בבלוטות הלימפה הפריפריה על ידי 2-פוטון הדמיה עולה כי ישנם שלושה שלבים ברורים של תאים דנדריטים ואינטראקציה תא T ^{1, 2.} שלב I מורכב הקשר בין ניעתי סדרתי קצר מאוד ספציפי אנטיגן בתאי T אנטיגן נושאת תאים דנדריטים ^{1, 2.} השלב השני מתאפיין מגעים ממושכים בין תא-T ו אנטיגן ספציפי אנטיגן נושאות תאים דנדריטים ^{1, 2.} ולבסוף, בשלב השלישי מאופיין בתאי T ניתוק מן התאים הדנדריטים, החזרת תנועתיות ומתחיל לחלק ^{1, 2.} זוהי דוגמה אחת לסוג של אנטיגן ספציפי לערמונית אינטראקציות כי ניתן לנתח על ידי הדמיה שני הפוטונים של אנטיגן טעון תא גשש צבען שכותרתו תאים דנדריטים.

Protocol

1) הסר את שתי עצמות הירך של העכבר one

1. השתמש במספריים לנתיחה כדי לחתוך שרירים לחשוף את עצם הירך מעל ומתחת המפרקים (הברך הירך). אחוז במרכז של עצם הירך עם פינצטה לנתיחה לחתוך מעל ומתחת המפרקים לעזוב כמה שיותר epiphysis ללא פגע ככל האפשר.
2. נקו את כמו שריר רבה ככל האפשר באמצעות מספריים קטנים לנתיחה. מעבירים את עצם הירך לתוך צלחת של RPMI.
3. כל הנהלים צריכים להתבצע בשכונה מנקודה זו ואילך, רק באמצעות התקשורת סטרילית, מכשירים, טיפים פיפטה ומנות תרבות.

2) לעקר עצמות עצם הירך:

1. ב למכסה המנוע, העברת עצמות מן RPMI לצלחת התרבות קטן מלא אתנול 70% על הקרח.
2. אפשר לספוג עצמות באתנול במשך 5 דקות על הקרח.

3) איסוף מוח העצם בתנאים סטריליים:

1. העברת עצמות לצלחת תרבות קטן המכיל סטרילי התקשורת סינון ראשוני DC תרבות.
2. עם פינצטה סטרילי, להחזיק את העצם מעל צלחת להשליך או צינור, ואת במספריים סטריליות, לחתוך כל epiphesis (קצות העצם) לדרך. לחתוך צריך לחשוף את מח העצם שהוא אדום בהיר במרכז העצם.
3. עם מזרק סטרילי (26-28 מחט מד), להתחנף כ 100-200 מ"ל של התקשורת סטרילית.
4. החזק את העצם עם פינצטה סטרילי מעל צלחת מתוקים של התקשורת סטרילי ולהכניס את המחט בצד אחד של העצם. מקם את קצה המחט ליד החלק העליון של עצם לאט לשטוף את העצם החוצה עם התקשורת סטרילית. אם אתה במרכז העצם, המחט צריכה להחליק בקלות.
5. מח העצם שוטף החוצה, לא חתיכות קטנות או מקשה אחת. זה צריך להיות סמוקות מתוך העצם לתוך כלי התקשורת סטרילית.
6. חזור על פעולה זו כנדרש לחלוטין לשטוף את מוח מתוך העצם.
7. כאשר העצם הוא נקי, זה יהיה לבן שקוף.
8. חזור על נוהל זה עם עצם הירך אחרים. מחק כל עצם הירך לאחר שהוא נקי.

4) Re-Spin ו להשעות את מוח העצם:

1. העברת התאים צינור בז סטרילית.
2. אם מח עדיין לא נפגעו, בעדינות רבה פיפטה התקשורת מעלה ומטה בצלחת, כדי לשבור את מח לתוך ההשעיה תא בודד. זה עלול לקחת כמה דקות צריך להיעשות לאט, כדי למנוע הרג תאים על ידי כוח מוחלט.
3. צנטריפוגה תאים כמו כל בתאי יונקים אחרים.

5) Cell תמוגה:

1. הוצא את הצינור מתוך צנטריפוגה לאחר הספין נעשה ויוצקים את התקשורת (למזוג) לתוך פסולת קטן (50 מ"ל צינור בז) בשכונה.
2. Resuspend גלולה ידי מצליף בעדינות את החלק התחתון של הצינור.
3. שימוש במים מסוננים סטרילית DPBS 10x 10x או PBS, לבצע תמוגה מים כדי להסיר את כדוריות הדם האדומות (RBCs) באמצעות הכרכים הבאים:
   • 900 מ"ל מים מסוננים סטרילית
   • 100 מ"ל או DPBS 10x 10x PBS
4. מוסיפים 100 מ"ל של 10x PBS 5-10 שניות לאחר הוספת המים. חשוב מאוד לעשות את זה מיד, כך שרק RBCs הם lysed. זה רעיון טוב שיש pipettes שניהם מלאים ומוכנים.
5. הוסף 5 מ"ל - 10 מ"ל של התקשורת DC סטרילי בסיסיים.

6) ספירת תאים:

1. ב למכסה המנוע, לערבב 6-11 מ"ל של תאים במח העצם על ידי בעדינות מתערבל הצינור עם היפוך קל, הטיה של 45 מעלות (לא כל כך שהתקשורת נוגע בחלק העליון של הצינור)
2. הסרה של 10 מ"ל של מדיה לתוך צינור סטרילי עבור לספור.
3. Re-מכסה את התאים צנטריפוגות שוב.

7) תאים דנדריטים ציפוי:

1. תאים צריכים להיות מצופה בצפיפות של 1 x 106/mL.
2. הסרת תאים בצנטריפוגה, מדיה למזוג מחדש תאים להשעות את הסכום המתאים של ראשי מדיה DC עבור ציפוי.
3. מקום ברקמת התרבות בחממה.

8) טיפוח תרבות והתבגרות:

תמיד לבדוק את התרבויות לפני הוספת התקשורת יותר או שימוש בניסויים כלשהו. בדוק את הבריאות הכללית של תאים לחפש זיהום פוטנציאליים.

יום 0: תאים דנדריטים מצופה.

יום 3: הסרת 75% של התקשורת ולא adherant תאים ולהוסיף ראשי חזרה מדיה DC.

יום 6: לאחר ציפוי תא ראשוני: Re-צלחת התאים באמצעות ההליך הבא:

1. הסר מדיה, אשר יכילו כמה אי - adherant DCs בנקודה זו, ומניחים צינור סטרילי בז 50 מ"ל, עוזב צלחות מאוד רטוב מעט (אתה לא רוצה את התאים חסיד להתייבש)
2. הוסף 3 mM EDTA ב PBS על כל צלחת ולאפשר לשבת במשך 5 דקות.
3. החזיקו את הצלחת בזווית של 45 מעלות בעדינות פיפטה התקשורת מעלה ומטה כנגד בתחתית הצלחת בעדינות כדי לסלק אי - adherant תאים.
4. EDTA / PBS צריך להיות תאים המעידים עבה נמצאים שנאספו בתחתיתצלחת.
5. לאחר כמה דקות של זה, תערובת תאים ניתן להעביר את הצינור 50 בז מ"ל.
6. ספין כל התאים לאחר ביצוע הליך זה עבור כל צלחת.
7. הרוזן צלחת התאים בצפיפות של 1 x 10 ^ 6 לכל צלחת משני מדיה ב-DC החדש סטרילי 10 מנות תרבות ס"מ. חזור תאים לרקמות תרבות חממה.

יום 10-11

DCs בוגר מוכן להעמסה גירוי / אנטיגן.

9) גירוי תאים דנדריטים:

1. השתמש LPS (lipopolyscaccharide) בשילוב עם הפפטיד הרצוי עבור הפעלה וטעינה פפטיד. בהתאם המקור של LPS, תנאי גירוי שונים יכולים לתת תוצאות טובות יותר. בנוסף, כמות הרצויה של הפפטיד להצגה DC צריך להיות מותאם. התנאים גירוי בפרוטוקול זה היו 100 נ"ג / מ"ל ​​ו - 100 LPS UG / mL OVA (ovalbumin).
2. אנטיגן טען / לטפל עם LPS עבור 18-24 שעות לפני הקציר / להשתמש.

מדיה תאים דנדריטים: מסנן סטרילי אחרי הכל נוספה

נא עיין בסעיף דיון לבדיקה של תנאים שונים התרבות תאים דנדריטים את הפנוטיפ הנובע תאים דנדריטים. תנאים אלה נועדו תרבות לייצר תאים דנדריטים בשלים כי במהירות הביתה ניקוז בלוטות הלימפה, 18-24 שעות לאחר ההזרקה תת עורית אנטיגן הנוכחית וביעילות.

ראשי DC מדיה: מסנן סטרילי אחרי הכל נוספה

• 500 מ"ל IMDM (להסיר 55-60 מ"ל עבור נפח סופי 500ml)
• 50 מ"ל חום מומת FBS
• 5 מ"ל של 200 מ"מ L-Gln, הריכוז הסופי של 2 מ"מ
• 100 IU / mL פניצילין ו 100 מ"ג / מ"ל ​​סטרפטומיצין (5 מ"ל של פן IU / mL 10,000 ו -10,000 מ"ג / מ"ל ​​מניות סטרפטוקוקוס)
• 50 UM B-Me (14.3 M B-Me המניות, לדלל 1:100 במנדף כימי, להשתמש ul 35 לכל 100 מ"ל מדיה ריכוז 50 מיקרו)
• 20-30 ng / mL GM-CSF
• 100-400 IU / mL IL-4 בערך 10-40 ng / mL

התקשורת SecondaryDC עבור * התבגרות

100 ng / mL TNF-אלפא (להוסיף ראשי מדיה DC)

* הערה: GM-CSF + IL-4 צריך לייצר תאים דנדריטים בשלים. באמצעות GM-CSF + IL4 (400 IU / ul) + TNF-אלפא (100 UG / mL) ייצרו תאים הדומים לתאים בוגרים מונוציטים הדנדריטים נגזר. תאים דנדריטיים בוגרים ידועים לא לקחת את אנטיגן בצורה יעילה ככל תאים דנדריטים בשלים ותרבויות ייתכן אנדוגני TNF-שפורסם מתאי סטרומה ^4.

Discussion

התאים הדנדריטים הם המתווכים העיקריים של התגובה החיסונית הסתגלות התא אנטיגן היעילה ביותר להציג מאופיינת עד כה. שיטות אדם העכבר תרבית תאים דנדריטים בספרות נבדלות בסוג של ציטוקינים להשתמש כדי להשפיע על התפתחות סוגים שונים של תאים דנדריטים. יש לציין, GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-alpha ו - IFN-gamma משמשות בשילובים שונים כדי לייצר בוגרת, בשלה, דלקתיות היציב כמו מח עצם Murine נגזר תאים דנדריטים במבחנה ^3-7. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לייצור תאים דנדריטים Murine בוגרים המסוגלים ביות כדי ניקוז בלוטות הלימפה לאחר הזרקה תת עורית, הצגת אנטיגן והפעלת na יש ותאי T. התא והתוצאה היא בדרך כלל האוכלוסייה הדנדריטים> CD11chigh 85% עם הבעה של CD80/86 ועין מתנהלת על הפעלת LPS. תוספת של TNF- לתרבות ביום 7 הוא אופציונלי מייצרת phenotype8 יותר בוגרת. תחזוקה של במבחנה לנגרהנס בתרביות תאים דנדריטיים, TNF-אלפא הוא גורם חשוב בהישרדות, אבל לא לגרות את התאים להבשיל ^9. יצוין כי TNF-alpha ממקורות אנדוגני (תאים סטרומה סביר) דווחה להיות נוכחים בתרבות התקשורת ^7. שיטות הדמיה אחרות מוצלח התאים הדנדריטים מוזרקים תת עורית כוללת מבחר חיובית CD11c + תאים מן הטחול וכן תיוג הפעלה מקבילה של התא הדנדריטי אנדוגני population1, ^{2, 10.} הפקה של תאים דנדריטים CD11chigh ממח העצם היא שיטה חזקים באופן עקבי מייצרת כמויות גדולות של תאים דנדריטים מסוגלים מצגת אנטיגן in vivo, חשוב הדמיה התהליך של הפעלת המערכת החיסונית אדפטיבית ^{11, 12.}