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Biology

Generación de médula ósea procedentes de células murinas dendríticas para su uso en dos fotones de imágenes

doi: 10.3791/773 Published: July 9, 2008

Summary

La presentación de antígenos en los órganos linfoides secundarios por las células dendríticas es fundamental para el inicio de la célula T mediada por la respuesta inmune adaptativa. Aquí se demuestra la cultura de la médula ósea procedentes de células dendríticas murinas, la activación, y el etiquetado de dos fotones de imágenes.

Abstract

Existen varios métodos para la preparación de las células dendríticas murinas se puede encontrar en la literatura. A continuación, presentamos un método que produce más del 85% CD11c células dendríticas de alta en la cultura de que el hogar de los ganglios linfáticos que drenan después de la inyección subcutánea, y presentan el antígeno a las células T antígeno específicas (ver video). Además, utilizamos instrumentos Essen Incucyte para realizar un seguimiento de maduración de células dendríticas, donde, el día 10, la morfología de las células en cultivo es típico de una célula madura dendríticas y <85% de las células son CD11chigh. El estudio de la presentación de antígenos en los ganglios linfáticos periféricos de dos fotones de imagen reveló que hay tres fases distintas de las células dendríticas y la interacción de las células T 1, 2. La Fase I se compone de breves contactos en serie entre las células T antígeno específicas muy móviles y el antígeno de llevar a las células dendríticas 1, 2. La segunda fase está marcada por los contactos prolongados entre los antígenos específicos de células T y células dendríticas antígeno teniendo 1, 2. Por último, la fase III se caracteriza por células T desprenderse de las células dendríticas, la recuperación de la motilidad y comienza a dividir 1, 2. Este es un ejemplo del tipo de antígeno específico de las interacciones que pueden ser analizados por dos fotones de imágenes de antígenos de células cargadas de seguimiento marcado tinte células dendríticas.

Protocol

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1) Retire los dos huesos de fémur de un ratón

  1. Use las tijeras para cortar la disección muscular y exponer el hueso del fémur por encima y por debajo de las articulaciones (rodilla y cadera). Sujete el centro del fémur con unas pinzas de disección y corte por encima y por debajo de las articulaciones de dejar la mayor cantidad de la epífisis intacto como sea posible.
  2. Limpie tanto músculo como sea posible con unas tijeras pequeñas disección. Transferencia del fémur en un plato de RPMI.
  3. Todos los procedimientos deben llevarse a cabo en el barrio a partir de ahora, sólo con medio estéril, instrumentos, puntas de las pipetas y placas de cultivo.

2) Esterilizar los huesos del fémur:

  1. En la capilla, la transferencia de los huesos de la RPMI a una placa de cultivo de pequeña llena de etanol al 70% en el hielo.
  2. Permita que los huesos en remojo en etanol durante 5 minutos en hielo.

3) Recoger la médula ósea bajo condiciones estériles:

  1. La transferencia de los huesos a un plato de cultivo que contienen pequeñas filtrado estéril de medios Primaria cultura DC.
  2. Con pinzas estériles, sostener el hueso en un plato de descartar o tubo, y con unas tijeras estériles, cortar cada epiphesis (extremos de los huesos) fuera. El corte se debe exponer la médula ósea, que es de color rojo brillante en el centro del hueso.
  3. Con una jeringa (aguja de calibre 26-28), absorben alrededor de 100-200 ml de medio estéril.
  4. Mantener el hueso con la pinza estéril sobre un plato fresco de medio estéril e inserte la aguja en un lado del hueso. La posición de la punta de la aguja en la parte superior del hueso y poco a poco lavar el hueso con los medios de comunicación estéril. Si usted está en el centro del hueso, la aguja debe deslizarse fácilmente.
  5. La médula ósea hace desaparecer, ya sea en pequeños trozos o en una sola pieza. Debe ser purgada de los huesos y en el plato de los medios de comunicación estéril.
  6. Repita este paso según sea necesario lavar completamente el tuétano de los huesos.
  7. Cuando el hueso se limpia, será blanco y translúcido.
  8. Repita este procedimiento con el hueso del fémur otros. Desechar cada hueso del fémur, una vez que esté limpio.

4) Vuelva a suspender y girar las células de la médula ósea:

  1. La transferencia de células a un tubo estéril halcón.
  2. Si la médula ósea está intacta, con mucho cuidado la pipeta los medios de comunicación de arriba a abajo en el plato, para romper la médula en una suspensión de células individuales. Esto puede tardar varios minutos y se debe hacer lentamente para evitar la muerte de las células por la fuerza.
  3. Centrifugar las células como lo haría con cualquier otra células de mamíferos.

5) lisis celular:

  1. Retire el tubo de la centrífuga después de la vuelta se hace y se vierte fuera de los medios de comunicación (decantación) en una pérdida pequeña (50 ml tubo Falcon) en la campana.
  2. Resuspender pellet suavemente agitando el fondo del tubo.
  3. El uso de agua estéril, filtrada y DPBS 10x o 10x PBS, llevar a cabo una lisis de agua para eliminar los glóbulos rojos (GR) con los siguientes volúmenes:
    • 900 ml de agua estéril, filtrada
    • 100 ml de DPBS 10x o 10x PBS
  4. Añadir 100 ml de PBS 10x segundo 50-10 después de añadir el agua. Es muy importante hacer esto de inmediato para que sólo los glóbulos rojos son lisadas. Es una buena idea tener dos pipetas de lleno y listo.
  5. Añadir 5 ml - 10 ml de agua estéril DC medios de comunicación básicas.

6) contar las células:

  1. En la capilla, la mezcla de 6 a 11 ml de células de médula ósea girando suavemente el tubo con una inversión pequeña, una inclinación de 45 grados (no para que los medios de comunicación toca la parte superior del tubo)
  2. Quitar 10 ml de los medios de comunicación en un tubo estéril para contar.
  3. Vuelva a tapar las células y se centrifuga de nuevo.

7) Las células dendríticas Revestimiento:

  1. Las células deben ser plateado con una densidad de 1 x 106/ml.
  2. Eliminar las células de la centrífuga, los medios de decantación y las células de una nueva suspensión en la cantidad adecuada de Primaria los medios de comunicación de CC para la siembra.
  3. Lugar en el cultivo de tejidos incubadora.

8) Cuidado de la Cultura y de maduración:

Siempre revise los cultivos antes de añadir más medios de comunicación o utilizar en cualquier experimento. Comprobar el estado general de salud de las células y buscar una posible contaminación.

DÍA 0: Las células dendríticas plateado.

DIA 3: Retire el 75% de los medios de comunicación y las células no adherant y añadir de nuevo los medios de comunicación de CC primaria.

DIA 6: después de la siembra inicial de la célula: la placa de Re-las células mediante el siguiente procedimiento:

  1. Eliminar los medios de comunicación, que debe contener algunos países en desarrollo no adherant en este punto, y colocar en un tubo estéril de 50 ml halcón, dejando las placas ligeramente húmeda (no quiere las células adherentes se seque)
  2. Añadir 3 mM EDTA en PBS a cada placa y dejar reposar durante 5 minutos.
  3. Mantener la placa en un ángulo de 45 grados y suavemente pipeta los medios de comunicación hacia arriba y abajo contra la parte inferior de la placa suavemente para desalojar no adherant células.
  4. EDTA / PBS debe ser más gruesa que indica las células son recogidas de la parte inferior de laplato.
  5. Después de varios minutos de esto, mezcla de células se pueden transferir al tubo Falcon de 50 ml.
  6. Girar todas las células después de realizar este procedimiento para cada plato.
  7. Conde y la placa de las células a una densidad de 1 x 10 ^ 6 por placa en la secundaria los medios de comunicación de CC en los nuevos platos de 10 cm estéril cultura. Volver a las células de cultivo de tejidos incubadora.

DÍA 11.10

Los países en desarrollo maduro listo para la carga de estimulación / antígeno.

9) la estimulación de células dendríticas:

  1. Use LPS (lipopolyscaccharide) en combinación con el péptido deseado para la activación y la carga de péptidos. Dependiendo de su fuente de LPS, diferentes condiciones de estimulación puede dar mejores resultados. Además, la cantidad deseada de péptido para la presentación de DC debe ser optimizado. Condiciones de estimulación en este protocolo fueron de 100 ng / mL de LPS y 100 ug / mL OVA (ovoalbúmina).
  2. Antígeno de carga / tratamiento con LPS durante 18-24 horas antes de la cosecha / uso.

Los medios de comunicación las células dendríticas: filtro estéril después de todo ha sido añadido

Por favor, consulte la sección de discusión para la revisión de las diferentes condiciones de células dendríticas y la cultura para el fenotipo de células dendríticas resultante. Estas condiciones de cultivo están diseñadas para producir células dendríticas maduras que rápidamente se casa a los ganglios linfáticos de drenaje, 18-24 horas después de la inyección subcutánea y antígeno presente de manera eficiente.

Primaria DC medios de comunicación: filtro estéril después de todo lo que se ha añadido

  • 500 ml IMDM (quitar 55-60 ml de volumen final de 500 ml)
  • 50 ml de FBS inactivado por calor
  • 5 ml de 200 mM L-Gln, la concentración final de 2 mM
  • 100 UI / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina (5 ml de 10.000 UI / ml Pen y 10000 mg / ml de caldo de estreptococo)
  • 50 uM B-Me (14,3 M B-Me acciones, diluir 1:100 en campana química, utilizar 35 ul por cada 100 ml de medio por 50 la concentración micromolar)
  • 20-30 ng / ml de GM-CSF
  • 100-400 UI / mL de IL-4 o menos 10 a 40 ng / mL

Los medios de comunicación SecondaryDC para la maduración *

100 ng / ml de TNF-alfa (añadir a los medios de comunicación primaria DC)

* Nota: GM-CSF + IL-4 debe producir células dendríticas inmaduras. El uso de GM-CSF + IL-4 (400 IU / ul) + TNF-alfa (100 ug / ml), se crean células que se asemejan a madurar células dendríticas derivadas de monocitos. Las células dendríticas maduras se sabe que no ocupan antígeno tan eficientemente como células dendríticas inmaduras y las culturas pueden tener endógeno TNF-a liberados de las células del estroma 4.

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Discussion

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Las células dendríticas son los principales mediadores de la respuesta inmune adaptativa y el antígeno de células más eficientes presentar caracterizado hasta la fecha. Métodos para el consumo humano y la cultura del ratón de células dendríticas en la literatura difieren en el tipo de citoquinas para influir en el desarrollo de diferentes tipos de células dendríticas. En particular, el GM-CSF, Flt3L, IL4, IL13, TNF-alfa e IFN-gamma se utilizan en diferentes combinaciones para producir maduro, inmaduro, inflamatoria y de estado estacionario, como la médula ósea murina células dendríticas derivadas in vitro 3-7. A continuación, presentamos un método sencillo para la producción de las células dendríticas maduras murino que son capaces de recalada de ganglios linfáticos de drenaje después de la inyección subcutánea, presentadoras de antígeno y la activación de células T na ve. La población de células dendríticas que resulta es típicamente CD11chigh> 85% con expresión inducible de CD80/86 sobre la activación LPS. La adición de TNF- a la cultura en el día 7 es opcional y se produce una mayor madurez phenotype8. El mantenimiento de las culturas in vitro de células de Langerhans dendríticas, TNF-alfa es un factor importante de la supervivencia, pero no estimulan a las células para madurar 9. Cabe señalar que el TNF-alfa a partir de fuentes endógenas (probablemente las células del estroma) ha informado que estará presente en la cultura de los medios de comunicación 7. Otros métodos para obtener imágenes de éxito inyectada por vía subcutánea células dendríticas son una selección positiva de células CD11c + en el bazo, así como el etiquetado y la activación simultánea de las células dendríticas endógenas población1, 2, 10. Producción de las células dendríticas CD11chigh de la médula ósea es un método robusto que produce constantemente un gran número de células dendríticas capaces de presentación de antígenos en vivo, importante en la imagen del proceso de activación del sistema inmune adaptativo 11, 12.

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Acknowledgments

Institutos Nacionales de Salud Kirchstein beca beca predoctoral AI-64128 (MPM), GM-41.514 (MDC), GM-48071 (IP)

References

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P. Matheu, M., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging. J. Vis. Exp. (17), e773, doi:10.3791/773 (2008).More

P. Matheu, M., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging. J. Vis. Exp. (17), e773, doi:10.3791/773 (2008).

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