Summary
वृक्ष के समान कोशिकाओं द्वारा माध्यमिक lymphoid अंगों में एंटीजन प्रस्तुति टी सेल अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मध्यस्थता की दीक्षा के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम अस्थि मज्जा की संस्कृति व्युत्पन्न murine वृक्ष के समान कोशिकाओं, सक्रियण, और 2-photon इमेजिंग के लिए लेबलिंग का प्रदर्शन.
Abstract
Murine वृक्ष के समान कोशिकाओं की तैयारी के लिए कई तरीकों साहित्य में पाया जा सकता है. यहाँ, हम एक तरीका है कि संस्कृति में अधिक से अधिक 85% CD11c उच्च वृक्ष के समान कोशिकाओं का उत्पादन मौजूद है कि उपचर्म इंजेक्शन और प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं (वीडियो देखें) के लिए उपस्थित प्रतिजन के बाद से draining लिम्फ नोड के लिए घर है. इसके अतिरिक्त, हम एसेन उपकरण का उपयोग Incucyte वृक्ष के समान सेल परिपक्वता है, जहां 10 दिन में, संवर्धित कोशिकाओं की आकारिकी एक परिपक्व वृक्ष के समान सेल और <कोशिकाओं के 85% CD11chigh हैं के विशिष्ट है ट्रैक. 2-photon इमेजिंग द्वारा परिधीय लिम्फ नोड्स में प्रतिजन प्रस्तुति के अध्ययन से पता चला है कि वृक्ष के समान सेल और टी सेल एक बातचीत, 2 के तीन अलग - अलग चरणों रहे हैं . चरण मैं अत्यधिक गतिशील प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं और प्रतिजन ले जाने के वृक्ष के समान कोशिकाओं 1, 2 के बीच संक्षिप्त धारावाहिक संपर्कों के होते हैं . दो चरण प्रतिजन विशेष टी सेल और प्रतिजन असर वृक्ष के समान कोशिकाओं 1, 2 के बीच लंबे समय तक संपर्क द्वारा चिह्नित है. अंत में, चरण III वृक्ष के समान कोशिकाओं से detaching, गतिशीलता और फिर 1, 2 विभाजित शुरुआत टी कोशिकाओं द्वारा विशेषता है. यह प्रतिजन विशेष बातचीत है कि प्रतिजन लोड सेल tracker डाई लेबल वृक्ष के समान कोशिकाओं के दो photon इमेजिंग द्वारा विश्लेषण किया जा सकता प्रकार का एक उदाहरण है.
Protocol
1) एक माउस से दोनों फीमर हड्डियों निकालें
- विच्छेदन कैंची का प्रयोग को दूर मांसपेशियों में कटौती और ऊपर और जोड़ों के नीचे (घुटने और कूल्हे) फीमर हड्डी का पर्दाफाश. विच्छेदन चिमटी के साथ फीमर के बीच समझ और कटौती ऊपर और जोड़ों के नीचे छोड़ के रूप में संभव के रूप में बरकरार epiphysis की में ज्यादा.
- छोटे विच्छेदन कैंची का उपयोग संभव के रूप में अधिक मांसपेशियों के रूप में साफ. RPMI के एक डिश में फीमर स्थानांतरण.
- हुड में सभी प्रक्रियाओं बाहर किया जाना चाहिए इस बिंदु पर से, केवल बाँझ मीडिया, यंत्र, विंदुक युक्तियाँ और संस्कृति व्यंजन का उपयोग.
2) जांध की हड्डी हड्डियों जीवाणुरहित:
- हुड में, RPMI से बर्फ पर 70% इथेनॉल के साथ भरा एक छोटा सा संस्कृति पकवान हड्डियों हस्तांतरण.
- हड्डियों इथेनॉल में बर्फ पर 5 मिनट के लिए सोख करने की अनुमति दें.
3) बाँझ शर्तों के तहत अस्थि मज्जा लीजिए:
- एक छोटी सी संस्कृति बाँझ फ़िल्टर प्राथमिक डीसी संस्कृति मीडिया वाले पकवान हड्डियों स्थानांतरण.
- बाँझ चिमटी के साथ, एक त्यागें डिश या ट्यूब पर हड्डी पकड़, और बाँझ कैंची के साथ, प्रत्येक epiphesis कटौती (हड्डी के सिरों) बंद. कटौती अस्थि मज्जा है जो हड्डी के केंद्र में लाल उज्ज्वल है बेनकाब चाहिए.
- एक बाँझ सिरिंज (26-28 गेज सुई), बाँझ मीडिया के बारे में 100-200 एमएल चूसना.
- पकड़ो बाँझ मीडिया के एक ताजा पकवान पर बाँझ चिमटी के साथ हड्डी और हड्डी के एक पक्ष में सुई सम्मिलित. हड्डी के शीर्ष के निकट सुई की नोक स्थिति और धीरे बाँझ मीडिया के साथ हड्डी बाहर धोने. यदि आप हड्डी के केंद्र में हैं, सुई में आसानी से स्लाइड चाहिए.
- अस्थि मज्जा या तो छोटे - छोटे टुकड़ों में या एक टुकड़ा के रूप में, washes. यह हड्डी और बाँझ मीडिया की डिश में बाहर flushed चाहिए.
- दोहराएँ इस कदम के रूप में के लिए पूरी तरह से हड्डी की मज्जा बाहर धोने की जरूरत है.
- जब हड्डी साफ है, यह सफेद और पारदर्शी हो जाएगा.
- अन्य फीमर हड्डी के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएँ. प्रत्येक फीमर हड्डी त्यागें एक बार यह साफ है.
4) पुनः निलंबित और नीचे अस्थि मज्जा कोशिकाओं स्पिन:
- एक बाँझ बाज़ ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण.
- यदि मज्जा अब भी बरकरार है है, बहुत धीरे मीडिया विंदुक ऊपर और नीचे पकवान में, एक एकल कक्ष निलंबन में मज्जा तोड़ने. यह कई मिनट ले और धीरे से किया जाना चाहिए सरासर बल द्वारा कोशिकाओं को मारने से बचने कर सकते हैं.
- अपकेंद्रित्र के रूप में आप किसी भी अन्य स्तनधारी कोशिकाओं कोशिकाओं.
5) सेल lysis:
- अपकेंद्रित्र से ट्यूब निकालें बाद स्पिन किया जाता है और हुड में एक छोटे से बेकार (50 एमएल बाज़ ट्यूब) में बंद मीडिया (निथारना) डालना.
- धीरे से ट्यूब के नीचे flicking द्वारा गोली Resuspend.
- बाँझ फ़िल्टर्ड पानी और 10x DPBS या 10x पीबीएस का प्रयोग, बाहर एक पानी lysis ले जाने के लिए लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) की निम्नलिखित संस्करणों का उपयोग कर हटा दें:
- 900 एमएल बाँझ फ़िल्टर्ड पानी
- 100 एमएल 10x DPBS या 10x पीबीएस
- 10x पीबीएस 5-10 सेकंड के 100 एमएल पानी जोड़ने के बाद जोड़ें. यह बहुत महत्वपूर्ण है इस के तुरंत इतना है कि केवल लाल रक्त कोशिकाओं lysed. दोनों pipettes भरा और तैयार यह एक अच्छा विचार है.
- बाँझ डीसी बुनियादी मीडिया के 10 एमएल - 5 एमएल जोड़ें.
6) प्रकोष्ठों गणना:
- हुड में, धीरे से एक मामूली उलटा, एक 45 डिग्री के झुकाव (मीडिया ऐसा नहीं छू ट्यूब के ऊपर) के साथ ट्यूब घूमता द्वारा अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के 6 से 11 एमएल मिश्रण
- गिनती के लिए एक बाँझ ट्यूब में मीडिया के 10 एमएल निकालें.
- पुनः टोपी कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र फिर.
7) चढ़ाना वृक्ष के समान कोशिकाओं:
- कक्ष x 1 106/mL के घनत्व पर चढ़ाया जाना चाहिए.
- चढ़ाना के लिए प्राथमिक डीसी मीडिया के उचित मात्रा में अपकेंद्रित्र, छानना मीडिया से कोशिकाओं और फिर निलंबित कोशिकाओं निकालें.
- टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रखें.
8) संस्कृति देखभाल और परिपक्वता:
हमेशा अधिक मीडिया जोड़ने या किसी भी प्रयोगों में उपयोग करने से पहले संस्कृतियों की जाँच करें. कोशिकाओं के सामान्य स्वास्थ्य की जाँच करें और संभावित प्रदूषण के लिए देखो.
0 दिवस: वृक्ष के समान कोशिकाओं चढ़ाया.
दिवस 3: मीडिया और गैर - adherant कोशिकाओं का 75% निकालें और वापस प्राथमिक डीसी मीडिया जोड़ें.
दिवस 6: प्रारंभिक सेल चढ़ाना के बाद पुन प्लेट निम्न कार्यविधि का उपयोग कोशिकाओं:
- मीडिया, जो एक बाँझ 50 एमएल बाज़ ट्यूब में इस बिंदु पर कुछ गैर adherant DCs और जगह होते हैं, प्लेटें छोड़ने के बहुत थोड़ा गीला (आप पक्षपाती कोशिकाओं को बाहर शुष्क करने की नहीं करना चाहता) निकालें
- प्रत्येक थाली में पीबीएस में 3 मिमी EDTA जोड़ें और 5 मिनट के लिए बैठने की अनुमति.
- एक 45 डिग्री के कोण पर थाली पकड़ो और धीरे मीडिया विंदुक ऊपर और नीचे धीरे गैर adherant कोशिकाओं को बेदखल की थाली के नीचे के खिलाफ.
- / EDTA पीबीएस मोटा संकेत कोशिकाओं के नीचे से एकत्र कर रहे हैं किया जा रहा हो जाना चाहिएथाली.
- इस के कई मिनट के बाद, सेल मिश्रण 50 एमएल बाज़ ट्यूब को हस्तांतरित किया जा सकता है.
- प्रत्येक प्लेट के लिए इस प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के बाद सभी कोशिकाओं स्पिन.
- 1 के एक घनत्व गणना और प्लेट कोशिकाओं x 10 ^ 6 नए बाँझ 10 सेमी संस्कृति बर्तन में माध्यमिक डीसी मीडिया में प्रति प्लेट. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर कोशिकाओं लौटें.
10-11 दिवस
परिपक्व DCs उत्तेजना / प्रतिजन लोड हो रहा है के लिए तैयार है.
9) वृक्ष के समान सेल उत्तेजना:
- सक्रियण और पेप्टाइड लोडिंग के लिए वांछित पेप्टाइड के साथ संयोजन में LPS (lipopolyscaccharide) का उपयोग करें. LPS के अपने स्रोत पर निर्भर करता है, विभिन्न उत्तेजना की स्थिति बेहतर परिणाम दे सकता है. इसके अतिरिक्त, डीसी प्रस्तुति के लिए पेप्टाइड के वांछित राशि को अनुकूलित किया जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल में उत्तेजना की स्थिति में 100 एनजी / एमएल LPS और 100 ओवीए / एमएल स्नातकीय (ovalbumin) थे.
- लोड प्रतिजन / फसल से पहले 18-24 घंटे के लिए LPS के साथ इलाज / का उपयोग करें.
वृक्ष के समान सेल मीडिया: सब कुछ के बाद बाँझ फिल्टर जोड़ दिया गया है
अलग वृक्ष के समान सेल संस्कृति शर्तों की समीक्षा के लिए और जिसके परिणामस्वरूप वृक्ष के समान सेल phenotype के लिए चर्चा अनुभाग देखें. ये संस्कृति शर्तों के परिपक्व वृक्ष के समान कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं कि तेजी से draining लिम्फ नोड्स, उपचर्म इंजेक्शन और वर्तमान प्रतिजन कुशलता के बाद 18-24 घंटे के लिए घर है.
प्राथमिक डीसी मीडिया: सब कुछ के बाद बाँझ फिल्टर जोड़ दिया गया है
- 500 एमएल IMDM (500ml अंतिम मात्रा के लिए 55-60 एमएल निकालने)
- 50 एमएल गर्मी निष्क्रिय FBS
- 200 मिमी एल GLN, 2 मिमी के अंतिम एकाग्रता की 5 एमएल
- 100 IU / एमएल पेनिसिलीन और 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (सौ सौ पेन / एमएल आइयू और 10,000 मिलीग्राम / एमएल Strep शेयर के 5 एमएल)
- 50 उम बी मुझे (14.3 एम बी मुझे शेयर, रासायनिक हुड में 1:100 पतला, 50 micromolar एकाग्रता के लिए 100 एमएल मीडिया प्रति 35 उल का उपयोग)
- 20-30 एनजी / एमएल जीएम-CSF
- 100-400 आइयू / एमएल आईएल 4 मोटे तौर पर 10 - 40 एनजी / एमएल
परिपक्वता * के लिए SecondaryDC मीडिया
100 एनजी / एमएल TNF-अल्फा (प्राथमिक डीसी मीडिया को जोड़ने)
* नोट: जीएम-CSF + आईएल-4 अपरिपक्व वृक्ष के समान कोशिकाओं का उत्पादन करना चाहिए. जीएम-CSF का उपयोग IL4 + (400 आइयू / उल) + TNF अल्फा (100 स्नातकीय / एमएल) कोशिकाओं है कि परिपक्व monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं सदृश बनाएगा. परिपक्व वृक्ष के समान कोशिकाओं को नहीं ले प्रतिजन के रूप में कुशलतापूर्वक के रूप में अपरिपक्व वृक्ष के समान कोशिकाओं और संस्कृतियों अंतर्जात TNF-stromal कोशिकाओं से जारी 4 हो सकता है जाना जाता है.
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Discussion
वृक्ष के समान कोशिकाओं अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और सबसे कुशल प्रतिजन पेश तिथि करने के लिए विशेषता सेल के प्रमुख मध्यस्थों हैं. माउस वृक्ष के समान सेल संस्कृति साहित्य में मानव के लिए तरीके अलग वृक्ष के समान सेल प्रकार के विकास को प्रभावित करने के लिए प्रयोग किया जाता साइटोकिन्स के प्रकार में अलग हैं. विशेष रूप से, जीएम-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-अल्फा और IFN गामा विभिन्न संयोजन में उपयोग किया जाता है murine अस्थि मज्जा 3-7 इन विट्रो में वृक्ष के समान कोशिकाओं व्युत्पन्न तरह परिपक्व, अपरिपक्व, सूजन और स्थिर राज्य उत्पादन. यहाँ, हम परिपक्व murine वृक्ष के समान कोशिकाओं है कि करने में सक्षम हैं के उत्पादन के लिए एक सरल तरीका मौजूद घर वापस आना उपचर्म इंजेक्शन के बाद लिम्फ नोड्स draining, प्रतिजन और सक्रिय टी कोशिकाओं ve ना पेश. वृक्ष के समान सेल आबादी परिणामस्वरूप आम तौर पर> LPS सक्रियण पर CD80/86 की inducible अभिव्यक्ति के साथ 85% CD11chigh है. TNF- 7 दिन संस्कृति के अलावा वैकल्पिक है और एक अधिक परिपक्व phenotype8 उत्पादन. TNF-अल्फा, इन विट्रो Langerhans वृक्ष के समान सेल संस्कृतियों के रखरखाव में एक महत्वपूर्ण कारक अस्तित्व है, लेकिन 9 परिपक्व कोशिकाओं को उत्तेजित नहीं करता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अंतर्जात स्रोतों से TNF-अल्फा (संभावना stromal कोशिकाओं) संस्कृति 7 मीडिया में उपस्थित होना करने के लिए सूचित किया गया है. इमेजिंग के लिए अन्य सफल तरीकों subcutaneously इंजेक्शन वृक्ष के समान कोशिकाओं CD11c तिल्ली से + कोशिकाओं के लिए सकारात्मक चयन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समवर्ती लेबलिंग और अंतर्जात वृक्ष के समान सेल के सक्रियण population1, 2, 10 में शामिल हैं. अस्थि मज्जा से CD11chigh वृक्ष के समान कोशिकाओं का उत्पादन एक मजबूत तरीका है कि लगातार वृक्ष के समान कोशिकाओं vivo में प्रतिजन प्रस्तुति में सक्षम, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली सक्रियण 11, 12 की प्रक्रिया इमेजिंग में महत्वपूर्ण के बड़ी संख्या है.
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Acknowledgments
स्वास्थ्य Kirchstein फैलोशिप predoctoral फेलोशिप (mpm) एअर इंडिया 64,128, जीएम - 41,514 (एमडीसी), जीएम ४८,०७१ (आईपी) के राष्ट्रीय संस्थान
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