Isolamento delle prime cellule staminali emopoietiche da murini sacco vitellino e AGM

Summary

Questo video mostra come micro-sezionare il sacco vitellino e aorta-gonadi-mesonefro regione da embrioni e l'uso di citometria a flusso per ordinare le cellule staminali ematopoietiche.

Abstract

Nell'embrione del mouse, ematopoiesi precoce si verifica contemporaneamente in più organi, che comprende il sacco vitellino e aorta-gonadi-mesonefro regione. Queste regioni sono fondamentali per stabilire il sistema sanguigno negli embrioni e conduce al movimento finale di cellule staminali nel fegato fetale e poi lo sviluppo delle cellule staminali adulte nel bonemarrow. Prime cellule staminali ematopoietiche possono essere isolate da questi organi attraverso microdissezione dell'embrione seguita da ordinamento citometria a flusso per ottenere una popolazione più pura. Non è ancora chiaro come queste popolazioni di cellule staminali contribuiscono alla piscina staminali fetali e adulte cellulare. Inoltre, il nostro laboratorio indaga su come le cellule staminali primi funzionalmente diversa da fetali e cellule staminali emopoietiche. Inoltre, i nostri tipi di laboratorio diverse popolazioni di cellule staminali ematopoietiche e testare il loro ruolo funzionale nel contesto di una varietà di modelli genetici. In questo video, dimostriamo il micro-dissezione procedura usiamo comunemente e mostrano anche i risultati di un tipico plotfter FACS isolare queste popolazioni rara, è possibile eseguire una serie di test funzionali, tra cui: saggi di colonia e di trapianti di midollo osseo.

Protocol

Dissezione e isolamento delle prime cellule staminali ematopoietiche di topo sacco vitellino e aorta-gonadi-mesonefro regione

1. Prima di iniziare, è importante avere tutti i reagenti e gli strumenti necessari per la procedura:
   
   • Forbici
   • Pinze, misura 4, e chirurgici grado piegate a punta pinze, misura 5 / 45 (opzionale)
   • 30 aghi di calibro con siringa
   • Piastre di Petri da 35 mm e 100 millimetri
   • PBS con il 10% e 20% siero fetale bovino
   • e, infine, Collagenasi
2. Per iniziare la dissezione, abbiamo bisogno di raccogliere le corna uterine da una donna incinta a 10,5 dopo il concepimento giorni.
3. Gli animali sono l'eutanasia secondo procedure approvate. Noi usiamo asfissia anidride carbonica, seguita da dislocazione cervicale.
4. Addome della femmina è bagnato con etanolo e la pelle è aperto con le forbici.
5. Tenendo la pelle con una pinza, ulteriori tagli sono fatti per aprire il peritoneo.
6. L'addome viene aperto e le corna uterine possono essere visualizzati. Uso di pinze per tenere le corna uterine, tagliare ogni estremità distale e il centro di entrambe le accise corna.
7. Corna uterine vengono poi poste in una piastra di Petri contenente PBS freddo con il 10% FBS per rimuovere i tessuti uterino.
8. Utilizzando taglia 4 pinze e lavorare al microscopio, rimuovere delicatamente il tessuto endometriale di tutto ogni embrione concepito, facendo attenzione a non forare la placenta.
9. Una volta rimosso, gli embrioni sono posti in un piatto fresco con PBS freddo e il 10% FBS.
10. Rimuovere con attenzione il tessuto placentare per rivelare l'embrione racchiuso nel sacco vitellino, utilizzando le pinze per tagliare l'embrione-incassato sacco vitellino lontano dalla placenta a loro frangente. Il sacco vitellino contiene arterie vitellina, e una parte del cordone ombelicale, possono essere delicatamente preso in giro dalla dell'embrione e mettere da parte in ghiaccio per dissociazione.
11. L'embrione viene spostato in una piccola scatola di Petri con livelli minimi di PBS con 10% FBS - quel tanto che basta per bagnare l'embrione ma non troppo. Livelli ottimali mantenere l'embrione fermo mentre la piastra è agitato lentamente, mantenendo l'embrione saldamente in posizione durante la dissezione.
12. Passare al 30 aghi calibro, che sono usati per rimuovere la parte superiore e inferiore dell'embrione, tagliando al di sopra della arti anteriori e sotto le zampe posteriori. Acquisire familiarità con l'utilizzo degli aghi come strumenti da taglio può richiedere una certa pratica. Un metodo di utilizzo ripetuto piccoli tagli attraversando gli aghi si sezionare il tessuto, con l'ago nella mano dominante di fungere da guida di taglio per l'ago che si tiene nella mano non dominante.
13. Rimuovere la parte dorsale dell'embrione. Questo è il tessuto che contiene i somiti. Delicatamente tagliare via la dorsale più a tessuto, pur rimanendo una distanza sufficiente dalla aorta (linea rossa) per evitare qualsiasi Knicks. Taglio l'aorta si tradurrebbe in perdita di sangue e l'impossibilità di visualizzare facilmente la sua posizione. Ancora una volta, facendo piccoli tagli con gli aghi è fondamentale per mantenere una posizione precisa di taglio.
14. Spingere il tessuto più lontano dalla vista e girare l'embrione attorno a tagliare il tessuto ventrale, ancora una volta il taglio il più vicino all'aorta possibile senza knicking esso. Tagli troppo lontano dalla posizione ottimale si tradurrebbe in tessuti addominali essere presente, che può essere rimosso una volta che l'assemblea è isolato.
15. Posizionare l'embrione con il suo lato dorsale verso il basso o la schiena contro la piastra. Splay delicatamente l'embrione aperto premendo ai lati verso il basso e visualizzare la posizione delle creste delle gonadi. Questi si trovano leggermente fuori centro come tubo strutture simili su entrambi i lati dell'aorta.
16. Completa la dissezione rimuovendo i tessuti in eccesso lato utilizzando le tecniche di taglio come prima. Una volta che il tessuto lato dell'embrione viene rimosso, allora l'embrione è capovolto per rimuovere il tessuto rimanente lato.
17. A questo punto, l'assemblea è ispezionato per qualsiasi tessuto in eccesso che può essere rimosso facilmente con gli aghi senza danno per l'aorta o gonadi. Rimozione come eccesso più risultati possibili in una migliore isolamento della popolazione di cellule staminali in quanto possiamo contare solo su alcuni marcatori di superficie cellulare per la purificazione.
18. Utilizzando la punta piegata pinze, dolcemente raccogliere ogni AGM e il luogo in PBS freddo con il 10% FBS fino al momento dissociazione.

Dissociazione e analisi FACS

1. Dissociare l', il tessuto primo posto sacchi di tuorlo e assemblee in tubi separati.
2. Spin brevemente ai tessuti pellet e scartare PBS con 10% FBS.
3. Risospendere tessuti 0,25% collagenasi in PBS con il 20% FBS, con volume sufficiente a coprire adeguatamente i tessuti.
4. Incubare i tessuti a 37 gradi. 25-30min per assemblee e 35-40min per sacchi di tuorlo.
5. Al termine della incubazione, pipettare delicatamente i tessuti su e giù per dissociazione in sospensioni singola cella.
6. Lavare i tessuti in eccesso con PBS wi° 10% FBS, pellet e risospendere le cellule in PBS sterile fresca con il 10% FBS.
7. Per l'analisi FACS, le cellule sono colorate in base alle raccomandazioni del fabbricante. Usiamo un FACSAria da BD Biosciences per eseguire citometria a flusso. A causa delle dimensioni e la fragilità delle cellule embrionali, l'apertura ordinamento è regolato per un diametro maggiore rispetto per l'adulto cellule ematopoietiche, che abbiamo anche lo studio in laboratorio. Allo stesso modo, la pressione viene regolata da meno le condizioni richieste dalla adulto cellule ematopoietiche. Ad esempio, ordinare sul FACSAria, la dimensione dell'ugello sarebbe di 100 micron e la pressione di ordinamento sarebbe 30 psi.
8. Per le analisi delle cellule staminali, triple cellule positive che esprimono la cKit marcatori, CD34, CD41 e sono isolati e ordinati dal sacco vitellino e positivi doppio (cKit, CD34) sono isolati dal AGM tramite FACS. Una trama tipica sarebbe simile a questa: cKit cellule positive sono analizzati per CD34 e CD41 simultaneamente o singolarmente. Di solito le cellule visualizzare una gradazione di positività per ciascun marcatore con la popolazione di cellule staminali che si trovano come un sottoinsieme della popolazione positivo. Questi grafici ci indicano che abbiamo raggiunto un buon rendimento cella con 100-300 cellule per sacco vitellino e per AGM.