Summary
このビデオでは、胚から卵黄嚢と大動脈 - 生殖腺 - 中腎領域をマイクロ細かく分析し、造血幹細胞をソートするには、フローサイトメトリーを使用する方法を示します。
Abstract
マウス胚では、初期の造血は卵黄嚢と大動脈性腺中腎領域を含む複数の臓器に同時に発生します。これらの領域は、胚の血液系の確立に極めて重要であり、胎児の肝臓及びその後bonemarrowにおける成体幹細胞の開発に幹細胞の最終的な動きにつながる。初期の造血幹細胞はこれらの器官から、より純粋な集団を得るために、フローサイトメトリー選別が続く胚の顕微解剖によって単離することができる。これらの幹細胞集団は、胎児および成体幹細胞のプールに貢献する方法、それは不明なままである。また、私たちの研究室では、初期の幹細胞が機能的に胎児と成人の造血幹細胞からどのように異なるか調査する。さらに、私たちの研究室をソート造血幹細胞の異なる集団と遺伝的モデルのさまざまな文脈でそれらの機能的役割をテストします。コロニーアッセイと骨髄移植：このビデオでは、我々は我々が一般的に使用し、また、これらの貴重な個体群を隔離typical FACSのplotfterの結果を示す顕微解剖の手順を紹介する、それが含む機能的アッセイのさまざまな実行することが可能です。
Protocol
マウス卵黄嚢と大動脈 - 生殖腺 - 中腎領域からの初期の造血幹細胞の解離と分離
- 開始する前に、手続に必要なすべての試薬とツールを持つことが重要です。
- はさみ
- 鉗子、サイズ4、および外科グレードの曲がった先端鉗子、サイズ5 / 45（オプション）
- シリンジと30ゲージの針
- 35mmと100ミリメートルペトリ皿
- 10％、20％ウシ胎児血清を含むPBS
- そして最後に、コラゲナーゼ
- 解剖を開始するには、我々は、10.5日後に懐妊した時に妊娠中の女性から子宮角を収穫する必要があります。
- 動物は、承認された手順に従って安楽死させる。我々は、頸椎脱臼に続く二酸化炭素の窒息を、使用してください。
- 女性の腹部にはエタノールを用いてウェットであり、皮膚をはさみで開かれます。
- ピンセットで皮膚を押し、追加のカットは、腹膜を開くように作られています。
- 腹部が開かれ、子宮角を可視化することができる。子宮角を保持するための鉗子を用いて、それぞれの遠位端と消費税の両方の角をに中心をカット。
- 子宮角をして子宮組織を削除するには、10％FBSを冷PBSを含むペトリ皿に配置されます。
- サイズ4鉗子を使用して、顕微鏡の下で働いて、静かに胎盤ではない穿刺に注意して、各胚の受胎前後から子宮内膜組織を除去。
- 一度削除された、胚を冷PBSと10％FBSと新鮮な皿に置かれます。
- 慎重に胚がその時点で胎盤から胎児の箱に入った卵黄嚢をカットするために鉗子を使用して卵黄嚢に包まれて明らかにするために胎盤組織を削除します。卵黄動脈、および臍帯の一部を含む卵黄嚢が、静かに胚から離れてからかったと解離し、氷上で積み立てることができます。
- 胚は、10％FBSを含むPBSの最小限のレベルの小さなペトリ皿に移されている - だけで十分な胚を湿らせるだけではないが多すぎる。プレートがゆっくりと攪拌しながら、最適なレベルでは、解剖時に所定の位置にしっかり胚を保ち、胚が静止してください。
- 前肢の上と後肢下切断することによって胚の上部と下部を除去するために使用される30ゲージの針、に切り替えます。最先端の楽器として針を使用してに精通することはある程度の慣れがかかる場合があります。針を交配することによって繰り返される小さなカットを使用しての方法は、非利き手で開催されている針のためのカッティングガイドとして機能するように利き手で開催された針で、組織を細かく分析します。
- 胚の背側の部分を削除します。これは、体節が含まれている組織です。どんなニックスを防ぐために、大動脈（赤線）から十分な距離を保ちながら優しく背ほとんどの組織を切り取る。大動脈を切断すると、血液の損失と、簡単にその場所を可視化することができないことになります。もう一度、針で小さな切り傷を作ることは、正確な切断位置を維持するために不可欠です。
- 視界が遮られて離れて余分な組織を押して、再度knickingすることなく可能な限り大動脈の近くにカット、腹側組織を切断するために胚を好転させる。カットに最適な場所から離れすぎて作られたがAGMが分離されれば除去することができる、存在している腹部の組織になるでしょう。
- プレートと下にその背側またはそのバックで胚を置きます。ゆっくりと両側を一度押し下げ、性腺尾根の位置を視覚化することによって胚が開いているスプレー。これらは、わずかに中心から外れて大動脈の両側にチューブ状の構造として配置されています。
- 以前と同じ最先端技術を使用して過剰側の組織を除去することによって解剖を完了します。胚の側の組織が削除されると、その後、胚は、残りの側の組織を除去するために上下逆さまになっています。
- この時点で、AGMは、大動脈や生殖腺に損傷することなく針で容易に除去できる余分な組織のために検査されます。我々が精製のための少数の細胞表面マーカーに依存しているため、幹細胞集団のよりよい分離の可能性が結果として非常に過剰に除去する。
- 曲がった先端鉗子を使用して、静かに解離するための準備が整うまで、10％FBSを冷PBSで各AGMと場所をすくい上げる。
解離およびFACS分析
- 組織の関連付けを解除するには、別々のチューブに最初の場所の卵黄嚢と年次総会。
- ペレットの組織に簡単にスピンし、10％FBSを含むPBSを捨てます。
- 十分に組織をカバーするのに十分なボリュームで、20％FBSを含むPBS中0.25％コラゲナーゼで組織を再懸濁します。
- 37℃で組織をインキュベートする。卵黄嚢のための年次総会および35 - 40分のための25 - 30分。
- インキュベーションの終わりに、静かに単一の細胞懸濁液に解離するために上下の組織をピペット。
- 過剰PBSウィスコンシン州で組織を洗う目10％FBS、ペレット10％FBSと新鮮な滅菌PBSで細胞を再懸濁します。
- FACS分析のために、細胞は、製造業者の推奨に従って染色される。我々は、フローサイトメトリーを実行するためにBD Biosciences社からFACSAriaを使用してください。胚細胞の大きさと脆さのために、並べ替え、絞り値は、我々はまた、実験室で勉強成人造血細胞に対するよりも大径に調整されます。同様に、圧力が成人造血細胞で必要とされる条件よりも小さくなるように調整されます。例えば、FACSAriaにソート、ノズルのサイズが100ミクロンになるとソートの圧力は30 psiのだろう。
- 幹細胞の分析のために、マーカーのcKit、CD34、およびCD41を発現している三重陽性細胞が単離され、卵黄嚢と二重陽性（cKit、CD34）からソートをFACSを介してAGMから分離されています。典型的なプロットは次のようになります。cKit陽性細胞は、CD34と同時または個別にCD41で解析されます。通常、細胞は正の集団のサブセットとして見られる幹細胞集団で、各マーカーの陽性のグラデーションが表示されます。これらのプロットは、我々は卵黄嚢と当たりAGM当たり100〜300細胞との良好な細胞収率を達成しているということを示しています。
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