Primaire Dissocié cultures Mésencéphale dopamine cellulaire du nouveau-né contre les rongeurs

Summary

Primaire dissocié des cultures de cellules dopaminergiques du mésencéphale permettre l'étude des caractéristiques des neurones à dopamine présynaptique. Ils peuvent être utilisés pour surveiller en temps réel des cinétiques de libération de dopamine et de la protéine / ARNm niveaux de régulation de l'exocytose de dopamine. Ici, nous vous montrons comment générer ces cultures du nouveau-né contre les rongeurs.

Abstract

La capacité à créer des cultures de cellules primaires de neurones à dopamine permet l'étude des caractéristiques présynaptique des neurones dopaminergiques dans l'isolement de l'entrée systémique d'ailleurs dans le cerveau. Dans notre laboratoire, nous utilisons ces neurones pour évaluer la cinétique de libération de dopamine en utilisant l'ampérométrie en fibre de carbone, ainsi que les niveaux d'expression des gènes liés dopamine et de protéines en utilisant la PCR quantitative et immunocytochimie. Dans cette vidéo, nous vous montrons comment nous générons ces cultures du nouveau-né contre les rongeurs.

Le processus comporte plusieurs étapes, y compris le placage de corticale astrocytes gliales, le conditionnement des milieux de culture cellulaire neuronale par le substrat gliales, la dissection du mésencéphale chez les nouveaux nés, la digestion, l'extraction et le placage des neurones à dopamine et l'ajout de facteurs neurotrophiques pour d'assurer la survie cellulaire.

Les applications appropriées pour une telle préparation comprennent l'électrophysiologie, l'immunocytochimie, PCR quantitative, la microscopie vidéo (ie, de la fusion vésiculaire en temps réel avec la membrane plasmique), des dosages de la viabilité cellulaire et d'autres tests de dépistage toxicologique.

Protocol

Préparation de la culture précédente

Note: Les cellules gliales ** doit être plaqué à l'avance afin qu'ils aient le temps de proliférer et de couvrir le fond de la vaisselle. Pour les souris avec le fond génétique atypique ou expérimentale, assurez-vous réunir les cultures gliales et neurones en termes de génotype.

Note: ** 1-7 jours avant la dissection, préparer fraîches moyennes neuronales et remplacer le milieu gliales dans les plats avec 2ml.

Note: ** Le jour avant la dissection, les éléments suivants doivent être laissés sous la lumière UV durant la nuit:

• 4 plaques de dissection
• 2 flacons de dissociation avec un barreau de micro-magnétiques
• 2 bouchons des flacons (avec 2 petits trous fourré dans le top)
• Etalez anneaux diapositives (et manteau dans EtOH à 70%) - laisser la boîte ouverte aussi
• AU MOINS 2 boîtes pleines de trucs jaunes (10-200 pl) pipettes
• 1 boîte de bleu (100-1000μl) pipette

Journée de la Culture

Note: * être sûr de ne rien toucher qui restait OUT POUR LA NUIT UV!

Maintenir un environnement stérile sous le capot est très important.

1) Set Up:

Note: ** Mettez de côté tous les ingrédients congelés pour préparer une solution papaïne.

1. Nettoyez-le avec une pince EtOH à 70%. Couvrir chaque extrémité avec une pointe de pipette jaune stérile. Utilisez pour placer les anneaux glisser stériles dans leur boîte.
2. Plaque de cuisson:
   1. Placer une plaque mini-magnetic/hot sous le capot avec un gobelet rempli à 1000ml 500-600ml dH ₂ O et un barreau magnétique important.
   2. Placer un disque de styromousse dans le bécher juste au-dessus du niveau d'eau.
   3. Faites glisser le thermomètre dans un petit trou dans le disque de styromousse. Composer de chaleur doit être légèrement supérieur à 2 (pour une température de 34 ° C) et mélanger le cadran doit être ~ 5-6.
3. PBS:
   1. Préparer PBS stérile et de remplir les tubes stériles 15 15ml avec 4-6 ml (veillez à maintenir stériles
      technique).
   2. Placer les tubes et les bouteilles de stock sur la glace à côté du capot.
4. Carbogen:
   1. Break a Stripette 5ml de moitié et le pousser à travers un bouchon de caoutchouc, de sorte que le bout de la Stripette est collé sur l'extrémité large du bouchon.
   2. Placez le bouchon dans un flacon de 500ml avec 400-500ml O dH ₂ (extrémité cassée d'Stripette devrait être dans le O DH _2).
   3. Connectez un tube sur l'ouverture latérale du ballon.
   4. Couper le bout hors d'une pipette jaune et le raccorder à l'extrémité du tube (avec le côté coupé vers l'extérieur).
      
      Raccorder le réservoir carbogène à la pointe de l'Stripette 5ml.
      
      
5. Préparer la papaïne sol'n:
   1. * Utilisez minutieuse technique stérile.
   2. Mélanger dans un tube 50ml stérile.
6. Filtre papaïne sol'n dans le flacon de dissociation:
   1. Utiliser une unité de filtration Steriflip et transfert à la dissociation flacon de 25ml par Stripette (ou placer un filtre seringue 0,2 um nouvelles sur la pointe d'un piston de la seringue de 20 ml,
      retirer le piston et d'utiliser un Stripette (25 ml) de transférer toutes les sol'n papaïne dans la seringue.
   2. Filtre dans le flacon de dissociation).
   3. Boucher le flacon, insérer une seringue stérile à travers le trou dans le bouchon et fixez un filtre seringue stérile 0,2 um à la base de la seringue.
   4. Branchez le carbogène au filtre et parafilm cet endroit en. Placer le flacon dans le styromousse disque / support.
      
      * La barre de mélanger les micro-magnétique doit être en mouvement.
      * Le gaz doit être en faire le flacon.
      * La température doit se stabiliser à 34 ° C.
      
      
7. Dissection de préparation:
   1. Apportez le microscope de dissection sous le capot.
   2. Disposer tous les instruments de dissection sur le papier d'aluminium, de pulvérisation avec de l'EtOH 70%, verser l'excédent et laisser sous le capot pour sécher.
8. Préparer le milieu neuronale:
   1. Laisser 30ml de milieu neuronal frais dans l'incubateur.
9. Étalez une grand carré de papier d'aluminium et de 12 petits carrés. Laisser les ciseaux avec la décapitation du papier d'aluminium. Remplir une petite boîte en polystyrène avec de l'eau glacée et laisser tous en dehors de la hotte.
10. Préparation de l'anesthésie (0.075ml kétamine et 0.075ml xzylazine).
11. Obtenir au moins 12 chiots (P0-P2) pour 100 plaques. Pour les souris, assurez-vous il ya un match génotype pour toute la portée. Si le génotype est inconnu, cellules de la plaque de chaque chiot sur un plat à part, tenir des registres précis de numéros de souris et les jumeler avec des boîtes de culture cellulaire et s'assurer que le fond génétique du substrat gliales est uniforme à travers les cultures cellulaires.

2) Dissection

1. Anesthésier les animaux d'abord avec une injection intrapéritonéale. Lorsque des animaux montre la sédation et ne répond pas à tail-flick test; le mettre dans la glace pendant 30 secondes (jusqu'à hypothermie). Rincer une petite feuille d'aluminium carrée, DecapCiseaux itation, et la tête avec de l'EtOH 70%.
2. Décapiter, permettent à la tête carrée tomber sur du papier d'aluminium et passer sous le capot. Retirer délicatement le cerveau dans un tube de 15ml de PBS glacé. Placer le tube de retour sur la glace tout en retirant le cerveau prochaine.
3. Répétez ces premières étapes jusqu'à ce qu'il ya 3 cerveaux sur la glace. Verser tous les trois cerveaux et PBS sur le plat de première dissection sous microscope. Retirez la section appropriée du cerveau (VTA) et l'utilisation d'une pipette de transfert de mettre les segments dans la papaïne sol'n. Démarrer une minuterie lorsque les segments d'abord aller po
4. Répétez les étapes précédentes jusqu'à ce que tous trois cerveaux sont digérés dans la papaïne. Le temps moyen pour la digestion devrait être de 2 heures. Les premiers segments aura été en 1 heure environ au moment où les derniers vont po
   
   Essayez de diviser la différence.
   
   
5. * Lors de la digestion:
   1. Assurez-vous que la température dans la salle de bain est de 34 ° C.
   2. Segments peut coller à la barre de mélanger au début, mais devrait s'étendre à mesure que le temps passe. S'ils ne le font pas, appuyez sur le fond du flacon.

3) La trituration:

1. En utilisant une pipette de transfert, le transfert des segments du cerveau dans un tube stérile de 15 ml (essayez d'éviter les excès papaïne sol'n) et les laver 3 fois avec 2ml de milieu gliales réchauffé de l'incubateur. Après avoir mis les médias gliales dans le tube, permettent de régler les segments puis retirez soigneusement que sol'n autant que possible sans déranger les segments. Changer les pipettes pour éviter toute contamination!
   
   ** Ne gardez pas l'sol'n qui est supprimé.
   
   
2. En utilisant une pipette de transfert frais commencent triturations dans 2ml de médias gliales. Triturer 25 fois (éviter de laisser de bulles d'air) et de laisser le tube reposer pendant 3 minutes jusqu'à ce que les segments non dissocié s'installer. Utiliser une pipette de transfert pour supprimer et de GARDER sol'n autant que possible sans déranger les segments au fond. Gardez le surnageant dans un nouveau (stérile) tube de 15m.
3. Répétez l'étape précédente à l'aide d'une pipette 1000μl et la pipette 200 pl jusqu'au complètement dissociés.
4. Triturer 10 fois avec une pipette de transfert, ou jusqu'à ce que les cellules sont complètement remises en suspension dans sol'n.

Cellules placage 4)

1. En utilisant une pipette stérile, jaune, couvrant chaque extrémité de la pince, soigneusement déposer une bague coulissante comme centré sur le verre aussi bien que possible à l'intérieur de chaque plat.
2. Mettez 10 ul de la solution de la cellule sur la hématimètre et compter. (Exclure les masses junk).
3. Multiplier le nombre de cellules par 10. C'est le nombre de cellules / ul. Diviser 1,000,000-1,500,000 (ou la densité désirée) par ce numéro. C'est le nombre de pi à ajouter par plat.
4. Utilisez la pipette pour glisser les anneaux sur le centre-bien de chaque plat que vous ajoutez ul appropriée / plat. Leur plaque délicatement et passer des conseils pour chaque plat.
5. Ajouter 100 ul (dilué d') sol'n GDNF l'intérieur de la bague coulissante de chaque plat.
6. A ce moment, le lieu des plateaux dans l'incubateur et apporter le support neuronal dans la chambre froide.
7. Laisser les cellules sédimenter pendant la nuit.
8. Le lendemain: retirer les anneaux (en utilisant de nouveaux embouts de pipette stérile, couvrant les conseils pince pour chaque plat)
   

Inhibition de la mitose 5): le lendemain

1. Diluer aliquotes FDU des stocks 1:10 1000X en ajoutant 200 pl stocks FDU à 1,8 ml MEM stérile.
2. Ajouter 20 pi diluée FDU sol'n à l'anneau extérieur de chaque plat. Changement des embouts de pipette souvent. Couvrir et retourner à l'incubateur.
   
   * Déranger les plats aussi peu que possible pour les prochains jours 7-10. Vérifiez pour des plats infectés et supprimer tous les plats infectés dès les premiers signes d'infection. Les cultures sont prêts pour les tests dans les 3 semaines.

MÉDIAS / SOLUTIONS

Medium neuronale

(Pour 200 ml)

** Mieux si conditionnée glie des flacons de nuit avant de l'utiliser pour le lavage / la trituration

Ingrédient	Montant	Remarques
BSA 5%	0,5 g	Fraction V
Liquides MEM	94,0 ml	Sigma
Liquide DMEM	80,0 ml	Sigma
F-12 de liquide	20,0 ml	Sigma
Glucose liquide 45%	1,50 ml	Sigma solution
La glutamine 200 mM	0,5 ml	Aliquotes solution Sigma
Diporzio Conc.	2,0 ml	Sigma solution
Liquid catalase	0,1 ml
L'acide Kynurenic 0.5M	200 pl	En NaOH 1N
HCL 5N	50 ul

1. Mélanger les ingrédients (BSA va derniers) dans un 250mbouteille en plastique L.
2. Filtre, l'étiquette, et réfrigérer.

Acide Kynurenic
(FW = 189,2)
0.5M = 94.6mg/ml
Faire des stocks 8ml: 756.8mgKA/8ml NaOH 1N et une pipette en aliquots de 200 ul STÉRILE

DiPorzio médias

A) DiPorzio Conc. Stocks:

BESOIN			Combinent			Alliquot
Additifs	Solvant	Tube	Montant	ml	ml / tube	Conc.	Montant	# Aliq.
Insuline	20mM HCL (1)	en plastique	Bouteille de 250mg	10	1	25mg/ml	25mg	10
La transferrine	Hank		Bouteille de 500mg	5	1	100mg/ml	100mg	5
SOD	Hank		Bouteille de 70mg	14	1	5mg/ml	5mg	14
Putrescine	Hank		50mg	3	0,12	20mg/ml	2.4mg	21
Na 2 SeO 3	Hank		0.104mg	10	0.5	10μg/ml	5.2μg	20
T3	10 mM de NaOH		2mg	10	0.1	0.20mg/ml	0mg	100
La progestérone	100% EtOH	Verre	12.5mg	10	0,05	1.25mg/ml	Utiliser une pipette
Le cortisol	100% EtOH	Verre	20mg	10	0,02	2.00MG / ml	Utiliser une pipette

1. 20 mM HCl = 41.5μl conc. HCl/25ml.
2. Faire des stocks et ajouter 104μl 1mg/ml à 10ml.

B) DiPorzio Média:

Additifs	Montant (ml)	Montant (ml) X2	Conc final. pg / ml	Conc final. Molarité
La progestérone	0,05	0.1	0,06	200nm
Le cortisol	0,02	0,04	0,04	125nM
Hank BSS	6,21	12,42
Insuline	1	2	25
Na 2 SeO 3	0.5	1	0,01	30 nM
T3	0.1	0.2	0,02	30 nM
SOD	1	2	5
Putrescine	0,12	0,24	2.4	15nm
La transferrine	1	2	100

1. Utiliser un tube de polypropylène de 15 ml stériles pour ajouter la progestérone et le cortisol. Utiliser une pipette d'aspiration et de vide à la vitesse d'évaporation d'EtOH: (utilisez un Stripette 5ml cassée en deux et placez à mi-chemin vers le bas dans le tube étant très attentif à ne pas aspirer le liquide EtOH Tenir la pipette solidement en place avec Kimwipes puis amener la pointe. vers le bas pour la marque 500μl situé sur le côté du tube.
2. Ajouter les aliquotes ultérieure dans l'ordre où ils apparaissent sur le graphique ci-dessus.
3. Après l'ajout d'insuline, ce qui rend le trouble sol'n, ajouter 20 pi de NaOH 1N pour neutraliser le pH. Sol'n devrait aller du jaune au rose et immédiatement claire. En outre, après l'ajout de la transferrine, ajouter immédiatement 20 pi de NaOH 1N, pour neutraliser le pH et empêcher la formation de précipités.
4. Dresser 10ml dans une pipette sérologique et la diviser en cinq parties aliquotes (un lot).
5. Boutique @ -20 ° C.
6. Peut faire 2 lots à la fois.

La dissociation des médias

A. La papaïne (pour 1 flacon):

** Préparer jour de placage à droite avant la dissection.

Ingrédient	Montant </ Strong>	(Notes) Conc final.
Eau cystéine	7.8mL	Cystéine 1 mM
La papaïne	Variable (* 190μl pour la bouteille de 44.0mg/ml)	20 unités / ml (400 unités au total pour une valeur de 20 ml de sol'n)
H & B conc.	2mL
Carbogen	95% O2 + 5% de CO2
HCl 5N	10 ul
0,5% de rouge de phénol	20 pi	0,001%
Kynurenate 0.5M	10 ul	(En NaOH 1N) 0,5 mM

1. Ajouter la papaïne à l'eau de la cystéine FIRST.
2. Ajouter le concentré de H & B., Kynurenate, HCl, et le rouge de phénol.
3. Filtre dans le flacon de dissociation (comme décrit dans les directives de configuration) et se connecter au carbogène.
   

B. H & B concentré (100 ml de 5X):

Ingrédients	MW	Powder/50ml H 2 O	Conc. (M)	Combinez (ml)	Conc final. (MM)
NaCl	58,44	11,699 g	4	14,5	116
KCl	74,56	3,728 g	1	2.7	5.4
NaHCO 3	84,01	4,2 g	1	13	26
NaH 2 PO 4 * H 2 O	137,99	6,90 g	1	1	2
MgSO 4	120,38	6,019 g	1	0.5	1
EDTA (ED2-SS)	292	Sigma 5% (faire 5g/100ml stock)	0,134	0,3722	0.5
Le glucose	180	Sigma 45%	2.5	5	25
TC H 2 O				62,93

1. Mélanger des quantités de solutions de stock.
2. Diviser en parties aliquotes 4ml.
3. Ajouter aliquote à l'eau après l'ajout de cystéine papaïne.
   

Eau cystéine C (157.5ml de 1X):

Ingrédients	MW	Composants Poudre (mg)	H 2 O (ml)	Stock Conc. (MM)	Combinez (ml)	Conc final. (MM)
CaCl 2	147,2	736	10	500	0.6	1.9mm
La cystéine	121,7	(1.5)	24	20mm (0,02 M)	10	1,27 (0.88)
L'eau TC					146,9

1. Faire et conserver un stock de sol'n CaCl2 0,5 M à 4 ° C
2. Faites une sol'n une utilisation de la cystéine et de combiner avec d'autres ingrédients
3. Diviser en 10 aliquotes de 15,75 ml et conserver à 4 ° C
   

Préparation GDNF

1. Prep Aliquot:
   1. Dissoudre stérile, lyophilisée pastille de 5 ug GDNF avec 2,4 ml d'eau déminéralisée stérile. La concentration de cette 2.08μg/mL GDNF sol'n =.
   2. Distribuez les 2.08μg/mL GDNF sol'n en 76.9μl aliquotes dans des cryotubes stériles. Cette 160ng = par flacon.
   3. Conserver à -20 ° C.
2. Ajout aux cultures:
   1. Dégeler une aliquote de tous les 8 plats.
   2. Diluer aliquote en ajoutant 723.1μl médias neuronales / aliquote. Cela fera un sol'n des 160ng/800μl GDNF.
   3. Ajouter 100 ul de cette sol'n à l'2mL de milieu de chaque plat pour une concentration finale de 10 ng par ml de GDNF.
      

Préparation FDU

FDU-sol'n Stock 1000X:

Ingrédient	Montant	(Notes) Conc final.
Uridine	247 mg	16,5 mg / ml
5-UPF (5-fluorodésoxyuridine)	100 mg (bouteille)	6,7 mg / ml
Eau TC	15 ml

1. Faire un peu plus de 15 ml de 16,5 mg / ml d'uridine.
2. Ajouter 15 ml d'uridine sol'n à 100 mg de bouteille pour faire FDU 6,7 mg / ml sol'n FDU.
3. Diviser en parties aliquotes et congeler dans 200 pl de -20 ° C.

Diluer d'utilisation:

1. Inhiber la croissance des cellules non-neuronales. Diluer 1:10 stocks 1000X en ajoutant 200 ul d'actions à 1,8 ml MEM.
2. Ajouter 20 pi FDU dilué à l'anneau extérieur de chaque plat. Changer embouts de pipettes souvent. Couvrir et retourner à l'incubateur.

Discussion

Les méthodes décrites ici permettent de résolution fine des caractéristiques morphologiques et neurochimiques des neurones dopaminergiques centrales qui sont par ailleurs pas disponible dans une approche systémique ou dans l'approche in vivo.

Materials

Materials are included in the protocol text.