Summary
Primäre dissoziiert Mittelhirn Dopamin Zellkulturen erlauben die Untersuchung der präsynaptischen Eigenschaften des Dopamin-Neuronen. Sie können verwendet werden, um Echtzeit-Freisetzung von Dopamin Kinetik und Protein / mRNA-Spiegel von Regulatoren der Dopamin-Exozytose zu überwachen. Hier zeigen wir Ihnen, wie Sie diese Kulturen von Nagetier Neugeborenen zu generieren.
Abstract
Die Fähigkeit zur primären Zellkulturen von Dopamin-Neuronen erstellen können für die Untersuchung der präsynaptischen Eigenschaften des Dopamin-Neuronen isoliert von systemischen Eingabe von anderswo im Gehirn. In unserem Labor verwenden wir diese Neuronen zu Dopamin Freisetzungskinetik mit Kohlefaser Amperometrie sowie Expression von Dopamin-Genen und Proteinen mittels quantitativer PCR und Immunzytochemie beurteilen. In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie wir diesen Kulturen zu generieren von Nagetier Neugeborenen.
Der Prozess umfasst mehrere Schritte, einschließlich der Beschichtung von kortikalen Gliazellen Astrozyten, die Konditionierung der neuronalen Zellkultur-Medien von den Gliazellen Substrat, das Sezieren des Mittelhirns bei Neugeborenen, die Aufschluss, Extraktion und Abscheidung von Dopamin-Neuronen und die Zugabe von neurotrophen Faktoren zu sicherzustellen, das Überleben der Zelle.
Die Anwendungen für ein solches Präparat enthalten Elektrophysiologie, Immunzytochemie, quantitative PCR, Video-Mikroskopie (dh in Echtzeit vesikulären Fusion mit der Plasmamembran), die Lebensfähigkeit der Zellen Assays und andere toxikologische Bildschirme.
Protocol
Vorbereitung Vor der Kultur
Hinweis: ** Gliazellen muss weit im Voraus beschichtet werden, so dass sie Zeit sich zu vermehren und decken den Boden der Küche haben. Bei Mäusen, die mit atypischen oder experimentelle genetische Hintergrund, stellen Sie sicher, Glia-und Nervenzellen Kulturen in Form von Genotyp entsprechen.
Hinweis: ** 1-7 Tage vor der Dissektion, bereiten Sie frisches neuronalen Medium und ersetzen Sie die Gliazellen Medium in den Schalen mit 2ml.
Hinweis: ** Am Tag vor der Dissektion, müssen die folgenden Elemente, um unter UV-Licht über Nacht verlassen werden:
- 4 Dissektion Platten
- 2 Dissoziation Fläschchen mit einem Mikro-Rührfisch
- 2 Verschlusskappen (mit 2 kleinen Löchern stocherte in der Spitze)
- Verteilt Gleitringe (und Mantel in 70% EtOH) - lassen Sie das Feld auch offen
- Mindestens 2 volle Kisten mit gelben (10-200 ul) Pipettenspitzen
- 1 Karton mit blau (100-1000μl) Pipettenspitzen
Day of Culture
Hinweis: * Achten Sie darauf, alles, was aus FÜR UV wurde über Nacht LINKS TOUCH!
Die Aufrechterhaltung einer sterilen Umgebung unter der Haube ist sehr wichtig.
1) Set Up:
Hinweis: ** beiseite Stellen Sie alle gefrorenen Zutaten zu Papain-Lösung zu machen.
- Saubere Zange mit 70% EtOH. Cover jede Spitze mit einem sterilen gelben Pipettenspitze. Verwenden Sie zum sterilen Gleitringe in ihre Box zu platzieren.
- Herdplatte:
- Legen Sie eine mini-magnetic/hot Platte unter der Haube mit einem 1000ml Becherglas gefüllt, um 500-600ml dH 2 O und einem großen Rührfisch.
- Legen Sie eine Styropor-Platte in das Becherglas nur oberhalb des Wasserspiegels.
- Schieben Sie das Thermometer in ein kleines Loch in das Styropor Platte. Hitze Einwahl braucht etwas mehr als 2 sein (für ein temporäres von 34 ° C) und die Aufsehen Einwahl sollte ~ 5-6 werden.
- PBS:
- Bereiten Sie sterile PBS und füllen 15 sterile 15ml Röhrchen mit 4-6 ml (achten Sie darauf, halten sterile
Technik). - Legen Sie die Rohre und die Vorratsflasche auf Eis neben der Motorhaube.
- Bereiten Sie sterile PBS und füllen 15 sterile 15ml Röhrchen mit 4-6 ml (achten Sie darauf, halten sterile
- Carbogen:
- Break a 5ml Stripette in der Mitte und schieben Sie sie durch einen Gummistopfen, so dass die Spitze des Stripette herausragt das breite Ende des Anschlags.
- Setzen Sie den Stopfen in einer 500ml Flasche mit 400-500ml dH 2 O (gebrochene Ende Stripette sollte in der dH 2 O werden).
- Schließen Sie einen Schlauch an der seitlichen Öffnung des Kolbens.
- Schneiden Sie die Spitze aus einer gelben Pipettenspitze und verbinden Sie diese bis zum Ende des Rohres (mit der Schnittfläche Seite nach außen).
Schließen Sie das Carbogen Tank an der Spitze des 5ml Stripette.
- Bereiten Papain sol'n:
- * Verwenden Sie vorsichtig sterile Technik.
- Mix in einem sterilen 50ml Tube.
- Filter Papain sol'n in die Dissoziation Durchstechflasche:
- Verwenden Sie einen Steriflip Filtrationseinheit und Transfer zum Dissoziation Fläschchen über 25ml Stripette (oder dem Ort eine neue 0,2 um Spritzenfilter auf die Spitze eines 20ml Kolbenspritze,
Entfernen Sie den Kolben und verwenden Sie ein Stripette (25ml), um alle Papain sol'n in die Spritze zu übertragen. - Filter in die Dissoziation Durchstechflasche).
- Verschließe das Röhrchen, legen Sie eine sterile Spritze durch das Loch in der Kappe und fügen Sie eine sterile Spritze 0,2 um Filter auf der Basis der Spritze.
- Schließen Sie das Carbogen, um den Filter und Parafilm dieser Stelle. Legen Sie die Flasche in den Styropor-Platte / Halterung.
* Die Mikro-Rührfisch müssen sich bewegen.
* Das Gas muss damit in die Durchstechflasche.
* Die Temperatur muss bei 34 ° C zu stabilisieren
- Verwenden Sie einen Steriflip Filtrationseinheit und Transfer zum Dissoziation Fläschchen über 25ml Stripette (oder dem Ort eine neue 0,2 um Spritzenfilter auf die Spitze eines 20ml Kolbenspritze,
- Dissection prep:
- Bringen Sie die Dissektionsmikroskop unter der Haube.
- Legen Sie alle Dissektionsinstrumente auf Aluminiumfolie, Spray mit 70% EtOH, abgießen Exzess und verlassen unter der Haube, um zu trocknen.
- Bereiten neuronalen Medium:
- Lassen Sie 30ml frischer neuronaler Medium in den Inkubator.
- Lay out 1 großes Quadrat aus Aluminiumfolie und 12 kleinere Quadrate. Verlassen Sie die Enthauptung einer Schere mit der Alufolie. Füllen Sie eine kleine Styropor-Box mit Eiswasser und lassen Sie alle außerhalb der Haube.
- Prep der Narkose (Ketamin und 0.075ml 0.075ml xzylazine).
- Holen Sie sich mindestens 12 Welpen (P0-P2) für 100 Platten. Bei Mäusen, stellen Sie sicher, gibt es eine Genotyp Spiel für die ganze Wurf. Wenn Genotyp unbekannt ist, Platte Zellen aus jeder Welpe auf einem separaten Teller, genaue Aufzeichnungen der Maus Zahlen und passen sie mit Zellkulturschalen und sicherstellen, dass der genetische Hintergrund der Glia-Substrat gleichmäßig über Zellkulturen.
2) Dissection
- Anesthetize das erste Tier mit einer intraperitonealen Injektion. Als Tier Sedierung zeigt und sich nicht auf Schwanzschlagetest reagieren; steckte es in Eis für 30 Sekunden (bis Hypothermie). Spülen Sie eine kleine Alu-Folie Quadrat, decapitation Schere, und der Kopf mit 70% EtOH.
- Enthaupten, damit Kopf bis auf Aluminiumfolie Platz fallen und bewegen sich unter der Haube. Entfernen Sie vorsichtig Gehirn in ein 15ml Röhrchen mit eiskaltem PBS. Das Röhrchen wieder auf Eis beim Entfernen der nächsten Gehirn.
- Wiederholen Sie diese ersten Schritte, bis es 3 Köpfe auf dem Eis. Füllen Sie alle 3 Köpfe und PBS auf die erste Sektion Gericht unter dem Mikroskop. Entfernen entsprechenden Abschnitt des Gehirns (VTA) und mit einem Transfer-Pipette auf die Segmente in Papain sol'n setzen. Starten einer Zeit, als die ersten Segmente hineingehen
- Wiederholen Sie die letzten 3 Schritte, bis alle Gehirne in Papain verdaut werden. Die durchschnittliche Zeit für die Verdauung sollte 2 Stunden betragen. Die ersten Segmente werden in ca. 1 Stunde bis zum Zeitpunkt der letzten, die hineingehen worden
Versuchen Sie, den Unterschied aufgeteilt. - * Während der Verdauung:
- Sicherstellen, dass die Temperatur im Bad ist 34 ° C.
- Segmente kann der Rührstab auf den ersten Stock, sollte aber ausbreiten wie die Zeit vergeht. Wenn sie das nicht tun, tippen Sie auf den Boden des Fläschchens.
3) Trituration:
- Mit einem Transfer Pipette das Gehirn Segmente in ein steriles 15 ml Tube (versuchen Sie, um überschüssige Papain sol'n zu vermeiden) und waschen Sie sie 3-mal mit 2 ml erwärmt Gliazellen Medium aus dem Inkubator. Nachdem er die Gliazellen Medien in die Röhre, damit Segmenten, sich niederzulassen und dann vorsichtig so viel sol'n wie möglich zu entfernen, ohne die Segmente. Ändern Pipetten, um Kontaminationen zu vermeiden!
** Nicht halten die sol'n, der entfernt wird. - Mit einem frischen Transferpipette beginnen Verreibungen in 2ml Gliazellen Medien. Man reibt 25-mal (vermeiden, dass in Luftblasen) und lassen Sie den Schlauch für 3 Minuten sitzen, bis undissoziierten Segmente zu begleichen. Verwenden Sie einen Transferpipette zu entfernen und zu halten, wie viel sol'n wie möglich, ohne störende Segmente an der Unterseite. Halten Sie den Überstand in ein neues (steril) 15m Schlauch.
- Wiederholen Sie den vorherigen Schritt mit einem 1000μl Pipette und 200 ul Pipette bis vollständig dissoziiert.
- Man reibt 10 mal mit einer Transferpipette, oder bis die Zellen vollständig in sol'n resuspendiert.
4) Plating Cells
- Mit einem sterilen gelben Pipettenspitze für jedes Spitze der Zange vorsichtig Tropfen ein Gleitring als das Glas so gut wie möglich in jedem Gericht zentriert.
- Setzen Sie 10 &mgr; l der Zelle Lösung auf dem Hämazytometer und zählen. (Exclude Junk-Massen).
- Multiplizieren Sie die Anzahl der Zellen um 10. Dies ist die Anzahl der Zellen / ul. Teilen Sie 1,000,000-1,500,000 (oder gewünschte Dichte) von dieser Nummer. Dies ist die Anzahl der ul pro Teller hinzuzufügen.
- Verwenden Sie die Pipettenspitze Ringe über die Mitte-und von jedem Gericht schieben, wie Sie geeignete ul / Schale hinzuzufügen. Platte sie sanft und schalten Sie Tipps für jedes Gericht.
- Add 100 &mgr; (verdünnte) GDNF sol'n innerhalb der Gleitring von jedem Gericht.
- An diesem Ort, Zeit die Fächer in den Inkubator und bringen die neuronale Medium in den Kühlraum.
- Lassen Zellen über Nacht absetzen.
- Am nächsten Tag: Sie Ringe (mit neuen sterilen Pipettenspitzen für die Zange Tipps für jedes Gericht)
5) Mitotische Inhibition: THE NEXT DAY
- Verdünnen FDU Aliquots 1000X Lager 1:10, indem 200 ul FDU Lager zu 1,8 ml sterile MEM.
- Add 20 &mgr; l verdünnt FDU sol'n den äußeren Ring von jedem Gericht. Ändern Pipettenspitzen oft. Cover und zurück in den Inkubator.
* Stören die Gerichte so wenig wie möglich für die nächsten 7-10 Tage. Prüfen Sie, ob infizierte Speisen und entfernen Sie alle infizierten Speisen bei den ersten Anzeichen einer Infektion. Kulturen sind bereit für die Prüfung innerhalb von 3 Wochen.
MEDIEN / SOLUTIONS
Neuronale Medium
(Für 200 ml)
** Am besten, wenn auf Glia aus Kolben über Nacht vor dem Einsatz zur Wäschen / Verreibung konditioniert
| Zutat | Betrag | Hinweise |
| BSA 5% | 0,5 g | Fraction V |
| MEM Flüssigkeit | 94,0 ml | Sigma |
| DMEM Flüssigkeit | 80,0 ml | Sigma |
| F-12 Flüssigkeit | 20,0 ml | Sigma |
| Glucose 45% Flüssigkeit | 1,50 ml | Sigma-Lösung |
| Glutamin 200 mM | 0,5 ml | Aliquotiert Sigma-Lösung |
| Diporzio Conc. | 2,0 ml | Sigma-Lösung |
| Flüssige Catalase | 0,1 ml | |
| Kynurensäure 0,5 M | 200 ul | In 1N NaOH |
| HCL 5N | 50 pl |
- Alle Zutaten (BSA geht Vorherige) in einem 250ml Kunststoff-Flasche.
- Filter, label, und in den Kühlschrank.
Kynurensäure
(FW = 189,2)
0,5 M = 94.6mg/ml
Machen 8ml Lager: 756.8mgKA/8ml 1N NaOH und Pipette in sterile Aliquots 200 ul
DiPorzio Medien
A) DiPorzio Conc. Stocks:
| NEED | Kombinieren | Alliquot | ||||||
| Zusatz | Lösungsmittel | Tube | Betrag | ml | ml / Rohr | Conc. | Betrag | # Aliq. |
| Insulin | 20 mM HCl (1) | Kunststoff | 250mg-Flasche | 10 | 1 | 25mg/ml | 25mg | 10 |
| Transferrin | Hank | 500mg-Flasche | 5 | 1 | 100mg/ml | 100mg | 5 | |
| SOD | Hank | 70mg-Flasche | 14 | 1 | 5mg/ml | 5mg | 14 | |
| Putrescin | Hank | 50mg | 3 | 0,12 | 20mg/ml | 2,4 mg | 21 | |
| Na 2 SeO 3 | Hank | 0.104mg | 10 | 0,5 | 10μg/ml | 5.2μg | 20 | |
| T3 | 10 mM NaOH | 2mg | 10 | 0,1 | 0.20mg/ml | 0mg | 100 | |
| Progesteron | 100% EtOH | Glas | 12.5mg | 10 | 0,05 | 1.25mg/ml | Verwenden Sie pipet | |
| Cortisol | 100% EtOH | Glas | 20mg | 10 | 0,02 | 2.00MG / ml | Verwenden Sie pipet | |
- 20 mM HCl = 41.5μl konz. HCl/25ml.
- Machen 1mg/ml Lager und stell 104μl bis 10ml.
B) DiPorzio Medien Stock:
| Zusatz | Menge (ml) | Menge (ml) X2 | Finale Conc. pg / ml | Finale Conc. Molarität |
| Progesteron | 0,05 | 0,1 | 0,06 | 200 nM |
| Cortisol | 0,02 | 0,04 | 0,04 | 125nM |
| Hanks BSS | 6,21 | 12,42 | ||
| Insulin | 1 | 2 | 25 | |
| Na 2 SeO 3 | 0,5 | 1 | 0,01 | 30Nm |
| T3 | 0,1 | 0,2 | 0,02 | 30Nm |
| SOD | 1 | 2 | 5 | |
| Putrescin | 0,12 | 0,24 | 2,4 | 15nm |
| Transferrin | 1 | 2 | 100 |
- Verwenden Sie ein 15ml Polypropylen sterilen Röhrchen an den Progesteron und Cortisol hinzuzufügen. Verwenden Sie einen Aspirator Pipette und Vakuum-Verdampfung von EtOH Geschwindigkeit: (verwenden Sie einen 5ml Stripette in der Hälfte und Ort auf halbem Weg nach unten in die Röhre sehr vorsichtig, nicht EtOH Flüssigkeitsaufnahme gebrochen Halten pipet sicher an seinem Platz mit Kimwipes und dann bringen die Spitze. bis in die 500μl Markierung auf der Seite der Röhre befindet.
- Fügen Sie die nachfolgenden Aliquots in der Reihenfolge ihres Auftretens auf der Tabelle oben.
- Nach der Zugabe von Insulin, das den sol'n bewölkt macht, fügen Sie 20 &mgr; l 1 N NaOH auf den pH-Wert zu neutralisieren. Sol'n sollte von gelb bis pink und sofort klar gehen. Auch nach der Zugabe von Transferrin, sofort hinzufügen 20 &mgr; l 1 N NaOH, um den pH-Wert zu neutralisieren und verhindern die Bildung von Niederschlägen.
- Zeichnen Sie bis 10ml in eine serologische Pipette und teilen sich in 5 Aliquots (eine Charge).
- Shop @ -20 ° C.
- 2. Mai Chargen auf einmal zu machen.
Dissoziation Medien
A. Papain (für 1 Flasche):
** Bereiten Tag der Beschichtung Recht vor ihrer Zerlegung.
| Zutat | Betrag </ Strong> | (Notes) Final Conc. |
| Cystein Wasser | 7.8mL | 1mM Cystein |
| Papain | Variiert (* 190μl für die Flasche 44.0mg/ml) | 20 Einheiten / ml (400 Einheiten insgesamt für 20ml im Wert von sol'n) |
| H & B konz. | 2 ml | |
| Carbogen | 95% O2 + 5% CO2 | |
| HCl 5N | 10 &mgr; l | |
| 0,5% Phenolrot | 20 &mgr; l | 0,001% |
| Kynurenate 0,5 M | 10 &mgr; l | (In 1N NaOH) 0,5 mM |
- Add Papain auf die Cystein Wasser FIRST.
- Fügen Sie die H & B konz., Kynurenate, HCl, und Phenolrot.
- Filter in Dissoziation Fläschchen (wie in der Set-up Richtungen beschrieben) und die Verbindung zum Carbogen.
B. H & B-Konzentrat (100 ml 5-fach):
| Zutaten | MW | Powder/50ml H 2 O | Conc. (M) | Combine (ml) | Finale Conc. (MM) |
| NaCl | 58,44 | 11,699 g | 4 | 14,5 | 116 |
| KCl | 74,56 | 3,728 g | 1 | 2,7 | 5,4 |
| NaHCO 3 | 84,01 | 4,2 g | 1 | 13 | 26 |
| NaH 2 PO 4 · H 2 O | 137,99 | 6,90 g | 1 | 1 | 2 |
| MgSO 4 | 120,38 | 6,019 g | 1 | 0,5 | 1 |
| EDTA (ED2-SS) | 292 | Sigma 5% (make 5g/100ml Lager) | 0,134 | 0,3722 | 0,5 |
| Glucose | 180 | Sigma 45% | 2,5 | 5 | 25 |
| TC H 2 O | 62,93 |
- Kombinieren Mengen aus Stammlösungen.
- Teilen Sie sich in 4ml Aliquots.
- Add Aliquot zu Cystein Wasser nach Zugabe von Papain.
C. Cystein Water (157.5ml 1X):
| Zutaten | MW | Komponenten Powder (mg) | H 2 O (ml) | Lager Conc. (MM) | Combine (ml) | Finale Conc. (MM) |
| CaCl 2 | 147,2 | 736 | 10 | 500 | 0,6 | 1.9mm |
| Cystein | 121,7 | (1.5) | 24 | 20mm (0,02 M) | 10 | 1,27 (0.88) |
| TC Wasser | 146,9 |
- Machen und zu halten einen Bestand von 0,5 M CaCl2 sol'n bei 4 ° C
- Machen Sie eine Verwendung sol'n von Cystein und in Kombination mit anderen Inhaltsstoffen
- Teilen Sie sich in 10 Aliquots von 15,75 ml und lagern bei 4 ° C
GDNF Vorbereitung
- Aliquot prep:
- Lösen Sie sterile, lyophilisierte Pellet 5μg GDNF mit 2,4 ml sterilem deionisiertem Wasser. Die Konzentration dieses GDNF sol'n = 2.08μg/mL.
- Verteilen Sie die 2.08μg/mL GDNF sol'n in 76.9μl Aliquots in sterile Kryoröhrchen. Diese = 160ng pro Fläschchen.
- Lagerung bei -20 ° C.
- Zusätzlich zu den Kulturen:
- Thaw 1 ALIQUOT für alle 8 Gerichte.
- Verdünnen aliquoten indem 723.1μl neuronalen media / Aliquot. Damit wird ein sol'n von 160ng/800μl GDNF.
- Add 100 &mgr; dieser sol'n die 2 ml Medium in jedes Gericht für eine endgültige Konzentration von 10ng GDNF pro mL.
FDU Vorbereitung
FDU-sol'n 1000X Lager:
| Zutat | Betrag | (Notes) Final Conc. |
| Uridin | 247 mg | 16,5 mg / ml |
| 5-FDU (5-Fluordeoxyuridin) | 100 mg (Flasche) | 6,7 mg / ml |
| TC Wasser | 15 ml |
- Machen Sie ein wenig mehr als 15 ml von 16,5 mg / ml Uridin.
- 15 ml Uridin sol'n bis 100 mg Flasche FDU auf 6,7 mg / ml sol'n FDU machen.
- Teilen Sie sich in 200 ul Aliquots und frieren in -20 ° C.
Verdünnen Sie für den Einsatz:
- Hemmen das Wachstum von nicht-neuronalen Zellen. Verdünnen 1000X Lager 1:10, indem 200 ul Lager zu 1,8 ml MEM.
- Add 20 &mgr; l verdünnt FDU den äußeren Ring von jedem Gericht. Ändern Pipettenspitzen oft. Cover und zurück in den Inkubator.
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Discussion
Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen feine Auflösung von morphologischen und neurochemischen Merkmalen der zentralen Dopamin-Neuronen, die sonst nicht in einen systemischen oder in vivo-Ansatz zur Verfügung.
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Acknowledgments
Die Arbeit wurde von DK065872 (ENP), eine Smith Family Foundation Award of Excellence in Biomedical Research (ENP), F31 DA023760 (BMG, ENP) und P30 NS047243 (Tufts Center for Neuroscience Research) unterstützt.
Materials
| Materials are included in the protocol text. |
References
- Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
- Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
- Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
- Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).
