Dissezione del sistema nervoso centrale larvali in Drosophila melanogaster

Summary

In questo articolo mostriamo come di sezionare il sistema nervoso centrale da terze larve instar Drosophila.

Abstract

Il sistema nervoso centrale (SNC) di larve di Drosophila è complessa e poco conosciuta. Un modo per indagare il sistema nervoso centrale è quello di utilizzare immunoistochimica per esaminare l'espressione di nuove e diverse proteine ​​marker. La colorazione delle larve di tutto non è praticabile perché la cuticola dura anticorpi impedisce di penetrare all'interno della cavità del corpo. Al fine di macchiare questi tessuti è necessario sezionare l'animale prima di fissaggio e la colorazione. In questo articolo mostriamo come a sezionare le larve di Drosophila, senza danneggiare il sistema nervoso centrale. Inizia strappare la larva a metà con un paio di pinze bene, e poi girare la cuticola "inside-out" per esporre il sistema nervoso centrale. Se la dissezione viene eseguita con cura il sistema nervoso centrale rimarranno attaccati alla cuticola. Noi di solito mantenere il sistema nervoso centrale collegato alla cuticola durante le fasi di fissazione e colorazione, e solo rimuovere completamente il sistema nervoso centrale dalla cuticola appena prima del montaggio dei campioni su vetrini. Mostriamo anche alcune immagini rappresentative di un sistema nervoso centrale larvale macchiata di Eva, un fattore di trascrizione espresso in un sottogruppo di neuroni nel sistema nervoso centrale. L'articolo si conclude con una discussione di alcuni degli usi pratici di questa tecnica e le potenziali difficoltà che potrebbero sorgere.

Protocol

1. Sezionare 3 ^° larve instar, lasciando collegato al sistema nervoso centrale la cuticola. Mettere in una provetta da 1,5 ml.
2. Fissare in PBS (1x) contenente 2% di formaldeide per 40 minuti con dondolo. ; Usa 250ul per ogni SNC 5-10 sezionato.
3. Rimuovere la formaldeide e brevemente lavare 3 volte con PBS + 0.1% Triton X-100 (PBST). Utilizzare una pipetta Pasteur finemente tirato per evitare la perdita di tessuto.
4. Blocco non specifici siti di legame con le proteine ​​e le membrane delle cellule permeabilize incubando tessuto 1-8 ore in PBST + 5% di BSA, dondolo a 4 ° C.
5. Incubare in anticorpo primario diluito in PBST + 5% di BSA a dondolo a 4 ° C durante la notte. Diluizione degli anticorpi ottimale varia per gli anticorpi diversi.
6. Sciacquare 3x in PBST seguito da due lavaggi 30min a 4 ° C.
7. Incubare in anticorpo secondario diluito in PBST + 5% di BSA per 1-3 ore a dondolo a 4 ° C. Sciacquare 3x in PBST seguito da due lavaggi 30min a 4 ° C. Se il secondario è coniugato con un composto sensibile alla luce, avvolgere il tubo in foglio di alluminio.
8. Sezionare il tessuto ulteriormente (se necessario) e montata sul diapositive.

Discussion

Questo video mostra come sezionare il sistema nervoso centrale da terzi larve instar Drosophila. Dopo la dissezione, il sistema nervoso centrale possono essere colorati utilizzando un protocollo standard di immunoistochimica. Attualmente, è molto più ancora sconosciuto su come il sistema nervoso adulto è generato e come si memorizza e trasmette informazioni. Studi della Drosophila sviluppo larvale SNC dovrebbe accrescere la nostra conoscenza del cablaggio del sistema nervoso e la funzione.

Larve di Drosophila presentano una serie di comportamenti stereotpyed, come risposta a stimoli ambientali. In che modo questi comportamenti appresi e memorizzati nel sistema nervoso? Gli studi del sistema nervoso durante lo sviluppo larvale contribuirà a rispondere a questa domanda.

A questo stadio dello sviluppo in Drosophila, l'organismo si prepara a subire grandi cambiamenti morfologici che si verificano durante impupamento. Durante questo periodo, il rimodellamento di massa del sistema neuromuscolare si verifica come le transizioni da una striscia organsim larva in una mosca adulta. Sarà interessante per determinare come i neuroni cambiano durante questa fase di sviluppo e se lo stesso tipo di comportamento può essere osservato nei neuroni degli animali superiori.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	fine tipped
9-well Watch glass
Plastic Petri dish