जमे हुए कक्ष से शुरू संस्कृति: मानव ES कोशिकाओं

Summary

यहाँ हम का प्रदर्शन कैसे हमारी प्रयोगशाला एक जमे हुए स्टॉक से एक रंग मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइन संस्कृति शुरू होता है.

Abstract

यहाँ हम का प्रदर्शन कैसे हमारी प्रयोगशाला एक जमे हुए स्टॉक से एक रंग मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइन संस्कृति शुरू होता है. सबसे पहले, एक से दो दिन पुरानी दस लगभग एक सेमी प्लेट (दो) मिलियन विकिरणित माउस भ्रूण fibroblast फीडर कोशिकाओं hues मीडिया के साथ rinsed है अवशिष्ट सीरम और सेल मलबे को हटाने, और तब रंग मीडिया जोड़ा और सेल में संतुलित करने के लिए छोड़ दिया इनक्यूबेटर संस्कृति. लंबी अवधि तरल नाइट्रोजन भंडारण या एक 80C फ्रीजर से कोशिकाओं के एक जमे हुए शीशी sourced है और जल्दी से जल्दी विगलन के लिए एक 37C पानी के स्नान में जलमग्न. ठंड मीडिया में कक्ष तब शीशी से हटा रहे हैं और रंग मीडिया की एक बड़ी मात्रा में रखा है. रंग की बड़ी मात्रा में मीडिया अतिरिक्त सीरम और DMSO के हटाने है, जो रंग मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए पैदा कर सकता है सुविधा. कक्ष निलंबन की धीरे बाहर काता, और तब फिर से ताजा hues मीडिया है कि तब MEF थाली बीज के लिए प्रयोग किया जाता है की एक छोटी मात्रा में निलंबित कर दिया. यह MEF थाली बीज के लिए महत्वपूर्ण धीरे एक बूंद बुद्धिमान फैशन में रंग कोशिकाओं को जोड़ने के लिए समान रूप से उन्हें थाली भर में फैलाने के द्वारा माना जाता है. 48 घंटे के लिए नव स्थापित hues संस्कृति थाली इनक्यूबेटर में लौट रहा है पहले मीडिया जगह है, तो उसके बाद हर 24 घंटे तंग आ गया है.

Protocol

एक जमे हुए स्टॉक से पहले गला लें :

1. Hues कोशिकाओं विगलन से पहले यह सुनिश्चित है कि आप पहले से ही तैयार किया है MEF थाली ठीक से अच्छी हालत में चढ़ाया हुआ है और. वांछनीय थाली, या एक है कि तीन दिन से अधिक उम्र के है की तुलना में एक कम उपयोग करने की कोशिश नहीं करते. यह पूर्व लेबल सभी शंक्वाकार ट्यूबों और कुओं का इस्तेमाल किया जा रहा करने के लिए सिफारिश की है.
   
   
2. पूर्व गर्म 37 सी. सेंटीग्रेड hues मीडिया प्रत्येक पंक्ति के लिए एक बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में विभाज्य hues मीडिया. -80 से शीशी / एस hues निकालें और तुरंत एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब के नीचे आधा डूब. यह 45-60 सेकंड के बारे में लेने से पहले कोशिकाओं 80% (छोटे जमी बाएं हिस्से) thawed चाहिए.
   
   
3. लामिना का प्रवाह हुड ट्यूब जल्दी लाने के, 70% शराब के साथ नीचे स्प्रे, और धीरे से पूर्व गर्म मीडिया की कोशिकाओं हस्तांतरण. ट्यूब स्पिन, मीडिया निकालने के लिए, और ताजा, पूर्व गर्म hues मीडिया के एक उचित मात्रा में resuspend.
   
   
4. कई कुओं के रूप में आप में विगलन जाएगा के रूप में बंद से MEF मीडिया Aspirate. जल्दी, विभाज्य पूर्व गर्म hues वापस थाली में से प्रत्येक में अच्छी तरह से मीडिया, संलग्न MEFs परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है. थाली हुड में अलग सेट. MEFs के साथ के रूप में, सबसे अच्छा परिणाम अगर बूँदें थाली के बारे में समान रूप से वितरित कर रहे हैं प्राप्त कर रहे हैं. ध्यान से एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर करने के लिए थाली रातोंरात लौटने के लिए अनुमति देने के बीज के रंग कोशिकाओं MEFs. ~~ 48 घंटे पिघलना के बाद मीडिया को बदलें, ताजा hues मीडिया के साथ की जगह.

Discussion

इस वीडियो में, हम बताते हैं कि हमारी प्रयोगशाला नियमित रूप से जमे हुए स्टॉक से एक रंग मानव भ्रूण स्टेम सेल संस्कृति स्थापित. यह प्रक्रिया किसी भी स्तनधारी सेल अगर एक DMSO समाधान में जमे हुए के साथ सामान्य उपयोग के लिए उत्तरदायी है. कुशल विगलन एक जमे हुए स्टॉक से hues कोशिकाओं की एक नई संस्कृति की स्थापना के लिए आवश्यक है, और प्रयोगात्मक स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 mL Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 mlbeta-mercapt–thanol 0.5 µl KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 mL bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml