Summary
כאן אנו להדגים שיטה גרימת הקלטה ההתקדמות של הצתה מאוחרת (DTH) סוג רגישות יתר באוזן חולדה. זה ואחריו הפגנה של הכנת רקמות האוזן עכברוש הדמיה שני הפוטונים של התגובה מפעיל T / תא זיכרון.
Abstract
סוג של רגישות יתר מאוחרת (DTH) היא תגובה חיסונית שבה השחקנים העיקריים הם CCR7 - מפעיל / זיכרון לימפוציטים מסוג T. הנה, אנחנו מדגימים שיטה גרימת הקלטה התקדמות התגובה DTH באוזן חולדה. זה ואחריו הפגנה של הכנת רקמות האוזן עכברוש הדמיה שני הפוטונים של CCR7 - תגובה T זיכרון מפעיל / התא.
DTH המאמצת הוא המושרה על ידי הזרקת intraperitoneal של ה-GFP שכותרתו הסגלגל ספציפי CCR7 - קו T זיכרון מפעיל / תא (ביטון, סי ג'יי ניסויים דמיינו, גיליון 8). תאים מותר אז לאזן בחולדה עבור 48 שעות לפני לאתגר על ידי הזרקת אוזן אחת עם מי מלח (באוזן מלאה) והשני עם תערובת 01:01 של מצומדות הסגלגל ואת הביציות כדי טקסס אדום (הסגלגל-TR) כדי לאפשר ויזואליזציה של אנטיגן הצגת תאים תושב.
אנו מתארים שיטת הכנה רקמות שימושי הדמיה תנועתיות של תאים בתוך שכבת הדרמיס עמוק במהלך תגובה חיסונית, בשיתוף עם ויזואליזציה של סיבי קולגן על ידי דור הרמונית השני. רקמת האוזן הוא חתך לתוך 5 × 5 ריבועים מ"מ (מעט גדול יותר הוא טוב יותר) ו רכוב על גבי תלושי כיסוי הפלסטיק באמצעות Vetbond ™, אשר מובטחות אז באמצעות גריז סיליקון בחדר הדמיה superfused על ידי החמצן מבעבע בינוני בתרבית רקמה על 37 ° C .
Protocol
אינדוקציה של DTH המאמצת
נא עיין במאמר יופיטר: אינדוקציה וניטור של רגישות יתר מושהית-Type המאמצת בחולדות
כריסטין ביטון, ג'ורג' ק Chandy
המחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה, אוניברסיטת קליפורניה, אירווין
J. ניסויים דמיינו, גיליון 8
הנה, יש לנו בפרוטוקול זה שונה באמצעות אנטיגן (Ovalbumin) מצומדות כדי טקסס האדום ביחס 1:1 עם אנטיגן ללא תווית, כדי לאפשר הדמיה של אנטיגן הצגת תאים phagocytic.
רקמות האוזן קציר
- להרדים את העכברוש בנקודת זמן הרצוי על ידי הנהלים המפורטים פרוטוקול שאושר שלך חיה. כאן, אנו משתמשים מנת יתר של סם ההרדמה, isoflurane. הדבר נעשה במיכל סגור הממוקם בתוך מכסה המנוע מאוורר היטב. ודא החיה מת על ידי עריפת ראש אחד על ידי פתיחת חלל החזה וחיתוך הלב.
- בעזרת מספריים גדולים להסיר את האוזן עם חתך בודד, קרוב אל הגוף של החיה ככל האפשר (איור 1).
באיור 1. הסרה של האוזן עכברוש - מניחים את האוזן בצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של ~ קר כקרח 1x PBS או RPMI-1640. שמור את דגימות רקמה על הקרח עד שתהיה מוכן להכין את הרקמה הדמיה.
- רקמת תמונה בהקדם האפשרי, אנו מוצאים, כי, כי 1-2 שעות על הקרח אין כל השפעה על תנועתיות התא להבחין ברקמות בהשוואה לרקמות לקצור צילמו מיד.
רקמות הכנה הדמיה
הסרת שכבה I. עוריות ו Dermal
* הערה: שכבת הדרמיס עמוק חייב להישמר ללא פגע. אם נעשה בצורה נכונה בכלי דם גדולים יישאר ללא שינוי ונראה את הסחוס של האוזן לא יהיו חשופים. זוהי טכניקה קשה, במיוחד כאשר אין דלקת (בתנאי הבקרה) ו - כדאי להשתמש במיקרוסקופ לנתח.
- המקום הן רקמות התקשורת מהצינור חרוטי בתוך צלחת 10 ס"מ תרבות רקמות.
- בידיים עטויות כפפות להחזיק את האוזן בעדינות עכברוש בקצה האוזן (דיסטלי) עם הצד הגבי של האוזן כלפי מעלה (איור 2).
איור 2. פרווה חתוך את האוזן - עם האגודל על החלק העליון של האוזן, רקמה יציב תוך שימוש קצה סגור דומון # 5 במספריים כדי להפריד את הדרמיס של הדרמיס עמוק. לחילופין, אם את הקצה של האוזן יש הסככה של העור / הדרמיס עמוק, זה יכול להיות תפס במלקחיים ומשכה בעדינות להפריד זה מן הרקמה שמתחת (איור 3).
איור 3. הסרת הדרמיס העליון - ברגע בשטח קטן של עור שהופרד הרקמה הבסיסית, חזור על השלבים ההפרדה לחילופין באמצעות מספריים לחתוך בין שכבות הדרמיס מלקחיים כדי להסיר בעדינות לקלף את העור וחילצה.
- חשוף 5 x 5 מ"מ או שטח גדול יותר של רקמת האוזן כי הוא לפחות 3 מ"מ מאתר ההזרקה הראשוני של אנטיגן (איור 4).
איור 4. רקמות חשוף הדמיה
השנייה. אבטחת רקמות לשלב הדמיה
- חותכים פיסת כיסוי פלסטיק לגודל מעט גדול יותר רקמה מוכנה.
- מורחים שכבה דקה של 3M Vetbond ™ רקמות בטוח דבק על פני השקופית.
- תפוס את הפינה של הרקמה מוכן (שבו אתה לא צפויות התמונה), להסיר מן התקשורת, להספיג את הצד התחתון של הרקמה על הנייר עדשה או Kym לנגב להסיר התקשורת עודף.
- לגעת בקצה של הרקמה לשקופית דבק מכוסה (מרפא Vetbond מיד על רקמת רטוב). למתוח בעדינות את הרקמות בצורה שטוחה, בקצה השני היה האחרון לגעת השקופית (איור 5)
איור 5. הר רקמות כדי לכסות להחליק - Cure ™ Vetbond על ידי היפוך רקמת מדגם / שקופיות טובלים אותו למאגר של מדיה כגון כי רקמות השקופיות הפנים למטה בערך בזווית של 45 מעלות. אחזקות רקמת במהופך בזווית מסייעת במניעת דבק עודף בריפוי על פני רקמת חשוף. דבק על פני השטח של הרקמה תחסום את הלייזר (איור 6).
איור 6. Cure vetbond רקמות gluדואר על ידי טבילה בתקשורת
הערה: צעדים 2-5 עלול לקחת מעט אימון הורים. נסה להתאמן עם פיסות רקמות או מושלך נוסף לפני שתנסה בפעם הראשונה. - תמרחי כמות קטנה של שמן סיליקון על גבי החלק התחתון של השקופית.
- מניחים את החלק בתא זלוף. ודא כי המדיה זלוף זורם, 37 ° C ו מחומצן לפני הוספת רקמה. לחץ בעדינות על הקצוות של השקופית יצירת חסימה עם גריז סיליקון בין החלק התחתון של החדר זלוף ואת פליטת כיסוי הפלסטיק.
ג. שני הפוטונים הדמיה
- באמצעות אור בהיר שדה המשודר, להתמקד העליון של הרקמה. כבו כל האורות.
- הפעל את הלייזר, PMTs כפי שנדרש על ידי המערכת רב פוטון מיקרוסקופ.
- דור הרמונית השני (SHG) ב מאוד מסודרים חלבונים סיביים (קולגן שרירן) מייצר אות באורך גל חצי לייזר עירור. אנו משתמשים עירור ב 900 ננומטר, המוביל SHG ב 450 ננומטר, אשר ניתן דמיינו באמצעות ערוץ "כחול" של המיקרוסקופ. SHG דור הוא שאינו ליניארי (שני פוטונים) תהליך, ובכך מספק אופטי "חתך" אפקט דומה לזה של עירור שני פוטונים של הקרינה. שיא היעילות של SHG מתרחשת כאשר הסיבים הם בניצב לייזר, בעוד הסיבים הפועלות במקביל לא יהיה דמיינו 1.
- אתר השטח הדמיה טובה עם הרבה תאים, הגדר באזור הרכישה כזה שלך כי הרוב המכריע של התאים במרכז ולהתחיל הדמיה. הערה: תגובות DTH, בתאי T מחלחל תאים אחרים נמצאים לעתים קרובות להיות מרוכזים יחדיו בעוד באזורים אחרים ללא חדירה לתאי 2. לכן, זה עשוי לקחת קצת זמן לחפש את הרקמה כדי למצוא את שטח התמונה הטובה ביותר.
- בדיקת כדאיות התא על ידי הערכת מהירות התא הקוטביות במהלך ההדמיה. השתמש כוח לייזר הנמוך ביותר המספק תמונה באיכות מקובל על מנת להבטיח מינימלי צילום נזק.
- החלפה לקראת רקמה חדשה לפי הצורך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
- Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
- Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
- Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. , In Press (2008).
