Summary
Aqui demonstramos um método para induzir e gravar o progresso de um atraso de hipersensibilidade do tipo-reação (DTH) na orelha de ratos. Isso é seguido por uma demonstração da preparação do tecido da orelha de rato para geração de imagens de dois fótons da resposta das células de memória / T efectoras.
Abstract
De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação imunológica em que os jogadores principais são CCR7 - efetoras / linfócitos T de memória. Aqui, nós demonstramos um método para induzir e gravar o progresso de uma reação de DTH no ouvido do rato. Isso é seguido por uma demonstração da preparação do tecido da orelha de rato para geração de imagens de dois fótons do CCR7 - resposta das células de memória / efetoras T.
Um DTH adotiva é induzida pela injeção intraperitoneal de GFP-rotulados Ova específicos CCR7 - linha de célula de memória / efetoras T (Beeton, C J. Experiências visualizado, Issue 8). Células são então permaneceram em ratos por 48 horas antes do desafio, injetando uma orelha com uma solução salina (controle de ouvido) ea outra com uma mistura 1:1 de conjugados óvulos e Ova de Texas-Vermelha (Ova-TR) para permitir a visualização residente de células apresentadoras de antígenos.
Nós descrevemos um método de preparação dos tecidos útil para geração de imagens a motilidade das células na camada profunda da derme durante uma resposta imune, em conjunto com a visualização das fibras colágenas por geração de segundo harmônico. Tecido da orelha é cortada em 5 x 5 quadrados mm (um pouco maior é melhor) e montados em lamínulas de plástico usando Vetbond ™, que são protegidos usando graxa de silicone em uma câmara de imagem e superfused por oxigênio bolhas meio de cultura de tecidos a 37 ° C .
Protocol
Indução de DTH Adoptive
Por favor, veja o artigo jove: Indução e Monitorização de hipersensibilidade tardia-Type Adoptive em Ratos
Christine Beeton, George K. Chandy
Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia, Irvine
Experimentos J. visualizado, Edição 8
Aqui, temos modificado esse protocolo usando antígeno (ovalbumina) conjugado com Texas Red-na proporção de 1:1 com antígeno não marcado para permitir a visualização de fagocíticas células apresentadoras de antígenos.
Colheita de tecido da orelha
- Euthanize o rato no tempo desejado ponto por procedimentos descritos no seu protocolo de animais aprovados. Aqui, usamos uma overdose do anestésico, isoflurano. Isto é feito em um recipiente fechado localizado dentro de uma capa bem ventilado. Certifique-se o animal está morto por uma decapitação de por a abertura da cavidade torácica e corte o coração.
- Com uma tesoura grande remover a orelha com um único corte, o mais próximo possível do corpo do animal quanto possível (Figura 1).
Figura 1. Remoção da orelha de rato - Coloque o ouvido em um tubo cônico contendo 15 ml ~ 10 ml de gelado 1x PBS ou RPMI-1640. Mantenha as amostras de tecido no gelo até que esteja pronto para preparar o tecido para a imagem latente.
- Tecido a imagem o mais rapidamente possível; encontramos, porém, que 1 a 2 horas sobre o gelo não tem nenhum efeito perceptível sobre a motilidade celular no tecido quando comparado ao tecido colhidas e gravadas imediatamente.
Preparação do tecido for Imaging
I. A remoção da camada epidérmica e dérmica
* Nota: A camada profunda da derme deve ser mantida intacta. Se feito corretamente grandes vasos sanguíneos permanecerá intacta ea cartilagem da orelha não será exposto. Esta é uma técnica difícil, especialmente quando não há inflamação (condições de controle) e é útil usar um microscópio de dissecação.
- Coloque as duas tecido e meios de comunicação a partir do tubo cônico de 10 centímetros placa de cultura de tecidos.
- Com as mãos enluvadas segurar a orelha de rato delicadamente na ponta da orelha (distal) com o lado dorsal da orelha para cima (Figura 2).
Figura 2. Fur aparar a orelha - Com o polegar na parte superior da orelha, o tecido firme, enquanto com a ponta de fechado Dumont # 5 tesoura para separar a derme da derme profunda. Alternativamente, se a ponta da orelha tem um excesso de pele / derme profunda, isso pode ser apreendido com uma pinça e gentilmente puxou para separar este a partir do tecido por baixo (Figura 3).
Figura 3. Remoção da derme superior - Uma vez que uma pequena área da pele foi separado do tecido subjacente, repita as etapas de separação como alternativa usar a tesoura para cortar entre as camadas dérmicas e pinças para remover suavemente e retire a pele desalojado.
- Expor um 5 x 5 mm ou maior área de tecido da orelha que é pelo menos 3 mm a partir do site inicial da injeção de antígeno (Figura 4).
Figura 4. Tecido exposto para imagens
II. Protegendo Tissue ao Palco Imagem
- Cortar uma lamínula de plástico para um tamanho ligeiramente maior do que o tecido preparado.
- Espalhe uma fina camada de cola 3M ™ Vetbond tecido-safe em todo o slide.
- Segure o canto do tecido preparado (onde não são susceptíveis de imagem), remova a mídia, e bata na parte de baixo do tecido em papel lente ou Kym pano para remover o excesso de mídia.
- Tocar a borda do tecido para o slide cola cobertas (as curas Vetbond imediatamente sobre o tecido molhado). Esticar suavemente o tecido plano, com a extremidade oposta sendo o último a tocar o slide (Figura 5)
Figura 5. Montagem de tecido para cobrir slip - Curar a ™ Vetbond invertendo o tecido da amostra / slide e mergulhando-o em um reservatório de meios tais que o tecido e deslize estão viradas para baixo e aproximadamente em um ângulo de 45 graus. Segurando o tecido de cabeça para baixo em um ângulo ajuda a evitar excesso de cola de cura na superfície dos tecidos expostos. Cola na superfície do tecido irá bloquear a laser (Figura 6).
Figura 6. Cura de tecidos vetbond glue por imersão em meios
Nota: 05/02 passos podem levar um pouco de prática para dominar. Tente praticar com pedaços de tecidos descartados ou extra antes de tentar, pela primeira vez. - Dab uma pequena quantidade de graxa de silicone na parte inferior do slide.
- Coloque o slide na câmara de perfusão. Certifique-se que a mídia perfusão está fluindo, 37 ° C e oxigenado antes de adicionar o tecido. Pressione gentilmente as bordas do slide fazendo um selo com a graxa de silicone entre o fundo da câmara de perfusão ea lamínula de plástico.
III. Dois Photon Imagens
- Utilizando-campo brilhante luz transmitida, o foco em cima do tecido. Desligar todas as luzes.
- Ligue o laser, PMTs conforme exigido pelo seu sistema de microscópio multi-fotão.
- Geração de segundo harmônico (SHG) em proteínas altamente ordenada fibroso (colágeno e miosina) produz um sinal de menos metade do comprimento de onda do laser de excitação. Nós usamos excitação em 900 nm, levando a SHG a 450 nm que pode ser visualizado através do canal de "blue" do microscópio. SHG geração é um processo não-linear (dois fótons), e, portanto, fornece uma óptica "corte" efeito semelhante ao de excitação de dois fótons de fluorescência. O pico de eficiência de SHG ocorre quando as fibras são perpendiculares ao laser, enquanto fibrilas que são executados em paralelo não será visualizado 1.
- Localizar uma área de imagem boa com abundância de células, definir a sua área de aquisição de tal forma que a maioria das células estão no centro e comece a imagem. Nota: Nas reações DTH, as células T e outros infiltrados celulares são encontrados frequentemente para ser concentrados juntos enquanto outras áreas são desprovidas de se infiltrar em células 2. Portanto, pode demorar algum tempo à procura do tecido para encontrar a melhor área para a imagem.
- Verificar a viabilidade celular através da avaliação da velocidade de células e polaridade durante o exame. Use o poder menor laser que proporciona uma qualidade de imagem aceitável para garantir o mínimo de fotografias danos.
- Troca em uma preparação de novos tecidos, conforme necessário.
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References
- Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
- Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
- Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
- Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. , In Press (2008).
