Använda Laser pincett för att manipulera enstaka nervceller i Vitro

Summary

Denna video beskriver manipulation av odlade nervceller med hjälp av laser pincett in vitro.

Abstract

I detta papper och video beskriver vi de protokoll som används i vårt laboratorium för att studera inriktningen preferenser förnya cellprocesser av vuxna näthinnans nervceller in vitro. Rutiner för beredning av retinal cellkulturer börja med dissektion, matsmältningen och trituration av näthinnan och avsluta med plätering av isolerade näthinnans celler på rätter gjorda speciellt för användning med laser pincett. Dessa rätter är uppdelad i en cell lim halv och en cell avskräckningsmedel halv. Cellen självhäftande sidan är belagd med ett lager av Sal-1-antikroppar, som ger ett underlag på vilken våra celler växa. Andra lim substrat kan användas för andra celltyper. Cellen avskräckningsmedel sidan är belagd med ett tunt lager av poly-HEMA. Cellerna pläterade på poly-HEMA sidan av skålen sitter fast med laser pincett, transporteras och sedan placeras i anslutning till en cell i Sal-1 sida för att skapa ett par. Bildandet av celler grupper av alla storlekar bör vara möjligt med denna teknik. "Laser-pincett-kontrollerad mikromanipulation" innebär att utredaren kan välja vilka celler att röra sig, och önskat avstånd mellan cellerna kan standardiseras. Eftersom laserstrålen går genom öppna ytor av kulturen skålen, är cellen Urvalet och placeringen sker i en sluten, steril miljö. Cellerna kan övervakas av video tidsförlopp och användas med någon cell nödvändiga biologiska teknik. Denna teknik kan hjälpa undersökningar av cell-cell interaktioner.

Protocol

Optisk pincett för att manipulera enstaka celler i odling

Fångst krafter optisk pincett genereras från dynamiken i ljus (Ashkin, 1991;. Ashkin et al, 1986). Även om dessa krafter lätt fälla celler i suspension, är de inte kan flytta celler som följer en yta. Därför att minska vidhäftning till kulturen skålen på den plats där cellerna är instängd, är täckglas belagd med poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) (Sigma Chemical Co, St Louis, MO), en giftfri förening med cell motbjudande fastigheter som används som tidigare för vidhäftning studier på endotelceller (Folkman och Moscona, 1978). Medan poly-HEMA täcker hälften av kulturen skålen, är den andra hälften belagda med ett substrat som stöder celltillväxt. I vårt laboratorium, är Sal-1 används som substrat för näthinnans odling salamandern celler. Förfarandet för att tillverka Sal-1 och poly-HEMA belagda rätter beskrivs nedan:

Tillverkning av kultur rätter

1. Rengör täckglas (# 1 VWR Scientific Inc., Media, PA) i syra. Detta coverglass valdes för dess tjocklek på endast 0,1 mm, som krävs för den höga numeriska bländaröppningen mål som krävs för att fokusera lasern.
2. För att skapa ett område cell repellerande, Lös 20 mg poly-HEMA (Sigma Chemical Co, St Louis, MO) i 1 ml 95% etanol över natten i rumstemperatur. Helst ska denna lösning ska användas inom 1 månad efter beredning.
3. Stötta upp täckglas på en nästan vertikal position i en dammfri miljö som en huva.
4. Placera en eller två droppar av poly-HEMA lösning nära toppen av coverglass från plasten spetsen av en 200μl mikropipett. Det droppar (ca 50-100μl vardera) bör begränsas till hälften av coverglass. Den branta lutningen gör att vätskan rinner ner ytan av coverglass till botten, vilket ger en tunn jämn beläggning av poly-HEMA. Låt poly-HEMA belagd täckglas för att torka i huven i 30-60 minuter i rumstemperatur.
5. Markera poly-HEMA sidan av coverglass med en fin spets penna nära kanten.
6. Borra ett 1 cm hål i botten av en 35 mm kultur maträtt.
7. Limma poly-HEMA belagd coverglass till botten av kulturen skålen med Sylgard 184 (Dow Corning Co, Midland, MI) så att poly-HEMA bestrukna sidan är vänd mot insidan av skålen. Se till att kanten av poly-HEMA beläggningen rinner ner i mitten av hålet. Låt disken torka i 1-3 dagar i rumstemperatur i en dammfri miljö.
8. Skrapa en linje på utsidan av coverglass med en diamant spets penna efter kanten av poly-HEMA beläggning. Sedan början två korsande linjer i rät vinkel till den cirka 2 mm från varandra. De två skärningspunkterna tjäna som referens eller referenspunkternas punkter som ska användas för att återge samma inriktning av kulturen skålen på mikroskop scenen.
9. Sterilisera disken under ultraviolett ljus över natten.
10. För att skapa en cell-anhängare hälften av kulturen skålen, päls som inte poly-HEMA halv med Sal-1, som innehåller en mus-anti-salamander antikropp som riktas mot näthinnans cellmembran (generöst tillhandahålls av Dr Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine , Atlanta, GA, se MacLeish et al (1983)).. Först belägga Sal-1 sida med cirka 100μl på 0,1 mg / ml sterilt get-anti-mus IgG antikropp (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis IN), noga med att inte spilla vätska över på poly-HEMA sida. Låt stå i tre timmar, ta sedan bort det. Tvätta samma område med steril Ringers lösning en eller två gånger, sedan placera 100μl Sal-1 supernatanten noga med att inte spilla vätska i poly-HEMA sidan av skålen. Den första antikroppen garanterar Sal-1 är belagt med en känd koncentration.
11. Inkubera rätter med Sal-1 över natten.
12. Ta bort Sal-1-antikroppar lösning och skölj området med steril Ringers lösning. Introducera 2 ml medium till skålen strax innan en cell plätering.

Sammansättningen av amfibie Ringers lösning, serumfritt amfibie medium och Ringers lösning för enzym matsmältningen finns i MacLeish och Townes-Anderson (1988) och Mandell et al. (1993).

Beredning av cellkulturer

De celler som används i denna video härrör från lätta anpassas, vuxna, vatten-fas tiger salamandrar (Ambystoma tigrinum) mäter 17-22 cm långa (Charles Sullivan Inc., Nashville, TN), hålls vid 5 ° C på en 12 h: 12 h ljus och mörker cykel. De protokoll som godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Medicine and Dentistry of New Jersey i strikt enlighet med riktlinjerna från National Institutes of Health. Förfaranden för att förbereda retinal cellkulturer beskrivs av Nachman-Clewner och Townes-Anderson (1996) och är följande:

1. Halshugga och märg djuren. Ta bort ögonen och dissekera ut hornhinnor och iris. Den näthinnor ska lossa något inom ögonmusslan. Genom att placera en böjd pincett under näthinnan, gröp ur näthinnor. Det är inte viktigt om objektivet sitter på näthinnan i detta skede.
2. Smälta näthinnor i 14 U / ml papain (Worthington, Freehold, NJ) hos salamandern Ringers lösning för 40 min.
3. Före användning bör papain Ringers lösning bubblas med 95% O ₂ / 5% CO _2-gas i 30 minuter. Och sedan steriliseras genom passage genom ett 0,22 mikron filter (Millipore, Carrigtwohill, Irland).
4. Skölj näthinnor med steril salamandern Ringers lösning tre gånger.
5. Ta ut linserna ur Ringers lösning, sedan försiktigt mal sönder näthinnans vävnad med ett 3 mm hål pipett för att ge en cellsuspension.

Laser pincett manipulation av isolerade nervceller

1. Placera kulturen skålen på mikroskop scenen, orientera skålen genom att rikta ett märke på skålen med en referenspunkt på scenen. Spara koordinaterna för referenspunkternas punkter i datorn.
2. Tavla celler på båda Sal-1 och poly-HEMA halvor av skålen.
3. Låt cellerna att bosätta sig i ca 20 minuter, vilket är tillräckligt lång för celler på den klibbiga sidan av skålen att fästa antikroppen underlaget.
4. Markera en cell i Sal-1 klibbiga sidan av skålen. Markera x-och y scenkoordinater i ett läge nära till cellen. I vårt fall var det punkt cirka 10μm från den primära dendriter i den markerade cellen. Spara koordinater i datorn.
5. Välj ett andra neuron, i vårt fall en ljusmätare, på poly-HEMA sidan av skålen och använda verktyget laser pincett för att fånga den. Svällning kan ske över ett brett spektrum av effektnivåer. Men sätter vi kraften i lasern på 10% -20%, vilket är tillräckligt låg för att undvika att fånga skräp tillsammans med cellen, men tillräckligt för att transportera cellen genom mediet.
6. Håll cellen i fällan, lägre scenen så att cellen är väl ovanför den kultur skålen och över alla anslutna nervceller. Flytta etappen enligt datorstyrning för att få cellen till tidigare sparade x-och y-koordinater på Sal-1 sida. Scenen rörelsen var satt till 8-20 mikroM / s, men maximal hastighet bör vara empiriskt bestämmas. Vid ankomsten till destinationen punkt på Sal-1 sida, höja scenen för att få fångade cellen till ytan av skålen. Cell placering kan göras med en noggrannhet på några få mikrometer. Låt cellen att ansluta sig till Sal-1 substrat.
7. Att få digitaliserade bilder av både celler i paret före och efter parbildning ger en användbar rekord.
8. Behåll cellen par i en inkubator. För salamander celler, placera rätter i en fuktig kammare vid 10 ° C. Cellerna kan övervakas av video-tid förfaller och används med någon cell nödvändiga biologiska teknik.

Discussion

Ljus har fart, och när en ljusstråle bryts när den passerar genom en cell, är en kraft som krävs för att ändra riktningen på den drivkraft. På grund av lagen om bevarande av rörelsemängd, måste en kraft i motsatt riktning i sin tur reagerar tillbaka på en cell. Ashkin (1991) visade att den kraft som genereras av en laserstråle fokuserad genom ett mikroskop objektiv kommer att flytta en cell mot mitten av fokus. Även om en laserstråle genererar bara några piconewtons i kraft, är denna kraft tillräckligt för att dra en cell genom medium. En nära infraröda våglängdsområdet som är dåligt absorberas av vatten används för att undvika skador på cellen (Liu et al 1995). Lasern-Pincett arbetsstation som används i vårt laboratorium (Cell Robotics Inc. Albuquerque NM) använder en 1 W, kontinuerlig laser våg diod för 980nm våglängd. Det laserljus överförs till cellerna via en 40x oljeimmersion planen neofluor objektiv av hög numerisk apertur (NA1.3) (Carl Zeiss Inc.) som fokuserar strålen på samma fokalplanet som mikroskopet.

Laser-pincett-kontrollerad mikromanipulation presenteras ett antal fördelar jämfört med studier av slumpmässigt pläterade celler. Till exempel kan cellerna placeras på ett lämpligt avstånd från varandra som kan vara enhetlig för alla manipulerade celler. Dessutom passerar laserstrålen genom det öppna ytan av kulturen skålen och därför är cellmanipulering sker i en sluten, steril miljö. De mycket små krafter som genereras av laser lägger en gräns för vad som kan komma i kläm. I vår erfarenhet, vidhäftning och cell formen är de viktigaste faktorer som begränsar lyckad fångst. I allmänhet fälla vi isolerade celler av 10-15μm i diameter och transportera dem avstånd på flera millimeter över kulturen skålen till sin destination. Det är möjligt att flytta större celler än dessa, t.ex. Muller gliaceller, som är 20-40μm i längd och är de största cellerna i våra kulturer.

Eftersom svällning celler är en utmaning när cellerna följa glaset botten av kulturen skålen och till varandra, utveckla en cell-avskräckningsmedel yta på coverglass med poly-HEMA visat sig ovärderligt för vår framgång i att manipulera celler. Trots detta blev cellerna i poly-HEMA ytan så småningom segare och svårare att manipulera i kulturer mer än 1-2 timmar gammal. I äldre kulturer, var det vanligt i vårt labb för att försöka plocka upp cellerna med laser med maximal effekt inställningen sedan på strömmen ner för att transportera den.

Den lätthet med vilken små föremål kan fastna i laser innebär att skräp kan dras i fällan på avstånd och utanför cellen. Detta visade sig vara ett problem under fångst av våra celler. Detta kan undvikas i de flesta fall genom att vrida ned kraften i laser för att minsta möjliga som kan hålla cellen i fällan. Hastigheten med vilken cellerna kan transporteras i fällan begränsas av viskositeten på mediet. Vi sätter normalt den hastighet runt 8-20 ìm / sekund, som befanns vara inom ett säkert område för transport.

Möjligheten att lasern har negativa effekter på cellerna hålls i fällan måste beaktas. I vår retinala kulturer möter vi mörka föremål som pigment celler som förstörs när fångas i laserstrålen. Klart, därför kan dessa celler inte kan studeras med hjälp av laser pincett. Men i tidigare studier på näthinnan nervceller och fotoreceptorer som utförs i vårt laboratorium fann vi ingen skillnad i neuritic tillväxt och förmåga att bilda anslutningar mellan pincett-Manipulerade celler och icke-manipulerade celler (Townes-Anderson et al 1998, Clarke et al 2008 ).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25mm circle No.1 coverglass	VWR international	48380 080
poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA)	Sigma-Aldrich	P-3932	Dissolve in 95% ethanol
Goat anti-mouse IgG antibody	Chemicon International	AP181	1mg in 1ml, dilute 10x for use
Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody	generously provided by Dr. Peter MacLeish		Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA
3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets	Corning	7078A-5
Cell culture dishes 35mm x 10mm	Corning	430165
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning
Optical tweezers-microtool or laser tweezers	Cell Robotics Inc.
1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength	Cell Robotics Inc.
Axiovert 100 inverted light microscope	Carl Zeiss, Inc.
40x oil immersion plan neofluor objective lens	Carl Zeiss, Inc.		Numerical aperture (N.A. 1.3)
Black and white CCD camera	Sony Corporation
Computer and joystick with software	Cell Robotics Inc.		for controlling a motorized stage