Summary
Это видео описывает манипуляции культурный нейронов помощью лазерного пинцета в пробирке.
Abstract
В данной работе и видео, мы описываем протоколов, используемых в нашей лаборатории для изучения ориентации предпочтения регенерации клеточных процессов взрослых нейронов сетчатки в пробирке. Порядок подготовки сетчатки клеточных культурах начинается с рассечение, пищеварения и растирания сетчатки, а в конце покрытия изолированных клеток сетчатки на блюда, приготовленные специально для использования с лазерным пинцетом. Эти блюда делятся на половину ячейки клей с половиной ячейки репеллент. Стороны ячейки клей покрыта слоем Сал-1 антител, которые обеспечивают подложки, на которой наши клетки расти. Другие клей подложки могут быть использованы для других типов клеток. Стороны ячейки репеллент покрыта тонким слоем поли-НЕМА. Клетки высевали на поли-НЕМА стороне блюда оказались в ловушке с лазерным пинцетом, транспортировались и затем помещается рядом с ячейкой на Сал-1 стороной для создания пары. Формирование группы клеток любого размера должно быть возможным с этой техникой. "Лазерный пинцет контролируемых микроманипуляция" означает, что исследователь может выбрать, какие клетки необходимо переместить, и необходимое расстояние между клетками может быть стандартизирована. Поскольку лазерный луч проходит через прозрачную поверхность культуры блюдо, выбора ячейки и размещение делается в закрытых, стерильной среде. Клетки могут контролироваться с помощью видео покадровой и использовать с любой клетки биологических техники требуется. Эта техника может помочь исследование межклеточных взаимодействий.
Protocol
Оптический пинцет для манипуляций изолированных клеток в культуре
Захват силами оптического пинцета создаются из импульсов света (Ашкина, 1991;. Ашкина и др., 1986). Хотя эти силы легко ловушку клеток в суспензии, они не в состоянии двигаться клеток, которые придерживаются поверхности. Поэтому, чтобы уменьшить адгезию к культуре блюдо в точке, где клетки оказались в ловушке, покровное покрыта поли-2-гидроксиэтилметакрилата (поли-НЕМА) (Sigma Chemical Co, Сент-Луис, Миссури), нетоксичные соединения с сотовыми репелленты свойствами ранее для адгезии исследования на эндотелиальных клетках (Фолькмана и Moscona, 1978). Хотя поли-НЕМА охватывает половину культуры блюдо, другая половина покрыта подложкой, что поддерживает рост клеток. В нашей лаборатории, Сал-1 используется в качестве подложки для культивирования клеток сетчатки саламандры. Процедура изготовления Сал-1 и поли-НЕМА покрытием блюд, описанных ниже:
Изготовление культуры блюда
- Чистая coverglasses (# 1 VWR Научно Inc, СМИ, PA) в кислоте. Это покровного стекла был выбран для его толщина всего 0,1 мм, необходимые для высокой числовой цели отверстие, необходимое для фокусировки лазера.
- Чтобы создать область ячейки репеллент, растворите 20 мг поли-НЕМА (Sigma Chemical Co, Сент-Луис, Миссури) в 1 мл 95% этанола в течение ночи при комнатной температуре. Предпочтительно, это решение должно быть использовано в течение 1 месяца с момента приготовления.
- Подоприте coverglasses в почти вертикальное положение в пыли окружающей среды, таких как капот.
- Положите одну или две капли поли-НЕМА решение в верхней части покровного стекла с пластмассовым наконечником из 200 мкл микропипетки. Капель (около 50-100 мкл каждого) должно быть ограничено до половины покровного стекла. Крутой склон обеспечивает жидкость стекает на поверхность покровного стекла на дно, обеспечивая тонким ровным покрытием поли-НЕМА. Разрешить поли-НЕМА покрытием coverglasses сушить в капюшоне в течение 30-60 минут при комнатной температуре.
- Марк поли-НЕМА стороне покровного стекла с тонким кончиком пера близко к краю.
- Дрель 1 см отверстие в нижней части 35 мм культуры блюдо.
- Клей поли-НЕМА покрытием покровного стекла на дно культуры блюдо с Sylgard 184 (Dow Corning Компания Midland, MI), так что поли-НЕМА покрытие боковых граней к внутренней стороне тарелки. Обеспечить краю поли-НЕМА покрытия стекает центре отверстие. Разрешить блюда высохнуть в течение 1-3 дней при комнатной температуре в пыли окружающей среды.
- Царапины линию на внешней стороне покровного стекла с алмазным наконечником пера следующие краю поли-НЕМА покрытия. Потом, поцарапать двух пересекающихся линий под прямым углом к ней примерно 2 мм друг от друга. Две точки пересечения служить ссылкой или координатных точках, которые будут использоваться для воспроизведения той же ориентации культуры блюдо на столик микроскопа.
- Стерилизовать посуду под ультрафиолетовым светом ночь.
- Для создания клеточных приверженцем половине культуры блюдо, пальто без поли-НЕМА пополам с Сал-1, который содержит мыши анти-саламандра антител, выдвигаемые против сетчатки клеточных мембран (любезно предоставлен д-р Питер MacLeish, Морхаус школы медицины , Атланта, Джорджия, см. MacLeish и др. (1983)).. Во-первых, пальто Сал-1 бок с примерно 100 мкл 0,1 мг / мл стерильного антимышиного IgG антител (Boehringer Mannheim корпорации, Индианаполис IN), стараясь не пролить жидкость на на поли-НЕМА стороны. Оставьте на три часа, затем удалить его. Мыть же районе с стерильного раствора Рингера один или два раза, затем поместите 100 мкл Сал-1 супернатант, стараясь не пролить жидкость в поли-НЕМА стороне тарелки. Первый антител обеспечивает Сал-1 покрыта в известной концентрации.
- Инкубируйте блюда с Сал-1 ночь.
- Удалить Сал-1 раствор антител и промойте область с стерильного раствора Рингера. Ввести 2 мл среды в блюдо непосредственно перед ячейки покрытия.
Состав раствора амфибия Рингера, бессывороточной амфибий среде, и раствор Рингера для ферментативного расщепления находятся в MacLeish и Таунс-Андерсона (1988) и др. Манделл. (1993).
Подготовка культурах клеток
Клетки, которые используются в этом видео были получены от светло-адаптированы, для взрослых, водные фазы тигра саламандры (Ambystoma tigrinum), измерительные 17-22 см в длину (Charles Sullivan Inc, Nashville, TN), поддерживается на уровне 5 ° С на 12 ч: 12 ч свет-темнота цикла. Протоколы были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) при Университете медицины и стоматологии Нью-Джерси в строгом соответствии с руководящими принципами, от Национального института здоровья. Процедуры подготовки сетчатки культурах клеток описываются Нахмана-Clewner и Таунс-Андерсона (1996) и заключаются в следующем:
- Обезглавьте и сердцевина животных. Удалите глаза и рассекать из роговицы и радужной оболочки глаза. Сетчатки должны отделить немного в наглазник. Размещая изогнутых щипцов под сетчатку, выкопайте сетчатки. Это не важно, если объектив крепится к сетчатке на данном этапе.
- Дайджест сетчатки в 14 Ед / мл папаин (Уортингтон, Freehold, штат Нью-Джерси) в растворе Рингера саламандр в течение 40 минут.
- Перед использованием раствор папаин Рингера должны быть клокотало с 95% O 2 / 5% СО 2 в течение 30 мин., Затем стерилизуют при прохождении через фильтр 0,22 мкм (Millipore, Carrigtwohill, Ирландия).
- Промыть сетчатки с стерильного раствора Рингера саламандра в три раза.
- Удалить линзы из раствора Рингера, затем осторожно растирают ткани сетчатки с 3 мм отверстие пипетки для получения клеточной суспензии.
Лазерный пинцет манипуляции изолированных нейронов
- Место культуры блюдо на столике микроскопа, ориентируя блюдо, совместив метку на блюдо с ориентиром на сцене. Сохранить координаты реперных точек в компьютер.
- Пластина клеток на обеих Сал-1 и поли-НЕМА половинки блюдо.
- Разрешить клетки урегулировать в течение примерно 20 минут, что является достаточно долго, для клеток на приверженцем стороне блюдо для подключения к антитела подложки.
- Выберите ячейку Сал-1 приверженцем стороне тарелки. Марк х и у координаты этапе положение, близкое к клетке. В нашем случае точка была приблизительно 10 мкм от первичной дендритов выбранной ячейки. Сохранить координаты в компьютер.
- Выбор второго нейрона, в нашем случае фоторецептор, на поли-НЕМА сторону тарелку и использовать инструмент лазерный пинцет, чтобы уловить. Захват может быть достигнута в широком диапазоне уровней мощности. Тем не менее, мы устанавливаем мощность лазера на 10% -20%, что является достаточно низким, чтобы избежать захвата мусор вместе с клеткой, но достаточный для транспортировки клетку через среду.
- Удерживая ячейку в ловушку, ниже этапе, с тем, что клетка значительно выше поверхности культуры блюдо и выше всех присоединенных нейронов. Перемещение сцене под управлением компьютера принести ячейку ранее сохраненные координаты х и у на Сал-1 стороны. Сценического движения была установлена на уровне 8-20 мкм / с, но максимальная скорость должна быть определены эмпирически. По прибытию в пункт назначения на Сал-1 стороны, поднимать на сцену, чтобы принести ловушку ячейки на поверхности блюда. Сотовые размещения могут быть сделаны с точностью до нескольких микрон. Разрешить ячейки придерживаться Сал-1 подложке.
- Получение цифровых изображений обеих клеток в паре до и после образования пар представляет собой полезный записи.
- Поддерживать ячейки пар в инкубаторе. Для саламандры клетки, места блюд во влажной камере при 10 ° C. Клетки могут контролироваться с помощью видео промежуток времени и использовать с любой клетки биологических техники требуется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Свет импульс, и, когда световой луч преломляется, проходя через ячейки, сила требуется для изменения направления движения. В силу закона сохранения импульса, силы в противоположном направлении должна, в свою очередь, реагируют обратно на камеру. Ашкина (1991) показали, что сила, создаваемая с помощью лазерного луча фокусируется объективом микроскопа будет двигаться ячейки к центру внимания. Хотя лазерный луч генерирует только несколько piconewtons силы, эта сила достаточно, чтобы вытащить камеру через среду. Ближней инфракрасной длине волны, которая плохо поглощается водой используется, чтобы избежать повреждения клетки (Liu и др. 1995). Лазерный пинцет станция, используемая в нашей лаборатории (Cell Robotics Inc, Альбукерке NM) использует 1 Вт, непрерывный лазерный диод волны 980nm длины волны. Лазерное излучение передается на клетки с помощью 40x нефти погружения план neofluor объектив высокой числовой апертурой (NA1.3) (Carl Zeiss, Inc) в котором основное внимание пучка на той же фокальной плоскости, как микроскоп.
Лазерный пинцет контролируемых микроманипуляция представляет ряд преимуществ по сравнению исследования случайным покрытые клетками. Например, клетки могут быть размещены на нужном расстоянии друг от друга, которые могут быть стандартизированы для всех манипулировать клетками. Кроме того, лазерный луч проходит через прозрачную поверхность культуры блюдо и, следовательно, сотовые манипуляция производится в закрытой, стерильной среде. Очень маленькие сил, возникающих при лазерном устанавливает ограничение на то, что может оказаться в ловушке. По нашему опыту, адгезии и формы клеток являются важнейшими факторами, ограничивающими успешного захвата. В общем, мы ловушку изолированные клетки 10-15 мкм в диаметре и транспортировать их расстояния в несколько миллиметров по культуре блюдо к месту назначения. Можно перемещать больше клеток, чем эти, например, Мюллер глиальных клеток, которые 20-40 мкм в длину и являются самыми крупными клетками в наших культур.
Поскольку захват клеток проблемой, когда клетки придерживаться стеклянным дном культуры блюдо и друг к другу, развитие клеточной поверхности, на репеллент покровного стекла использованием поли-НЕМА доказали неоценимое значение для нашего успеха в манипулировании клеток. Тем не менее, клетки на поли-НЕМА поверхности в конечном счете стала липкой и трудно манипулировать в культурах более 1-2 часов назад. В старых культурах, обычная практика в нашей лаборатории было попытаться подобрать клеток с использованием лазерной максимальное значение мощности, затем включите питание вниз по его транспортировке.
Легкость, с которой небольшие объекты могут оказаться в ловушке лазерной означает, что мусор можно вытянуть в ловушку от расстояния и вне клетки. Это оказалось проблемой во время захвата наших клеток. Этого можно избежать, в большинстве случаев, повернув вниз мощность лазера до минимально возможной, которая может содержать ячейки в ловушку. Скорость, с которой клетки могут транспортироваться в ловушке ограничивается вязкость среды. Мы обычно устанавливается скорость около 8-20 мкм / сек который оказался на безопасном уровне для транспортировки.
Возможность того, что лазер оказывает негативное воздействие на клетки состоялась в ловушку должны быть рассмотрены. В нашей сетчатки культур, мы сталкиваемся с темных объектов, таких как пигментные клетки, которые разрушены, когда захваченные в лазерный луч. Поэтому ясно, что эти клетки не могут быть исследованы с помощью лазерного пинцета. Однако в предыдущих исследованиях нейронов сетчатки и фоторецепторов, проведенных в нашей лаборатории, мы не обнаружили различий в neuritic роста и способность к образованию связей между пинцет-манипулировать клетками и не манипулировать клетками (Таунс-Андерсона и др., 1998; Кларк и др. 2008 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке грантов NIH EY012031 и EY0182175 и FM-Кирби Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR international | 48380 080 | |
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | |
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning | 7078A-5 | |
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning | 430165 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc. | ||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc. | ||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss, Inc. | Numerical aperture (N.A. 1.3) | |
| Black and white CCD camera | Sony Corporation | ||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
