Summary
Este video describe la manipulación de cultivos de neuronas con pinzas láser in vitro.
Abstract
En este documento y de vídeo, se describen los protocolos utilizados en nuestro laboratorio para estudiar las preferencias de orientación de los procesos de regeneración celular de neuronas de la retina adulta in vitro. Procedimientos para la preparación de los cultivos de células retinianas comienzan con la disección, la digestión y la trituración de la retina, y terminar con el revestimiento de células aisladas de la retina en platos elaborados especialmente para su uso con pinzas láser. Estos platos se dividen en un medio adhesivo celular y una media de células repelente. El lado adhesivo celular está recubierta con una capa de Sal-1 anticuerpos, que proporcionan un sustrato sobre el que las células crecen. Otros sustratos adhesivos podrían ser utilizados para otros tipos de células. El lado repelente de la célula está recubierta con una fina capa de poli-HEMA. Las células plateado en la parte de poli-HEMA del plato son atrapados con las pinzas láser, transportados y luego se coloca junto a una celda de la Sal-1 lado para crear un par. Formación de grupos de células de cualquier tamaño, debería ser posible con esta técnica. "Pinzas láser controlado por micromanipulación" significa que el investigador puede elegir la que las células se muevan, y la distancia deseada entre las células pueden ser estandarizados. Debido a que el rayo láser pasa a través de superficies transparentes de la placa de cultivo, selección y colocación de células se llevan a cabo en un ambiente cerrado y estéril. Las células pueden ser monitoreados por video time-lapse y utilizar en cualquier técnica de las células biológicas requeridas. Esta técnica puede ayudar a las investigaciones de las interacciones célula-célula.
Protocol
Las pinzas ópticas para la manipulación de células aisladas en la cultura
Las fuerzas de la captura de las pinzas ópticas se generan a partir del impulso de la luz (Ashkin, 1991;. Ashkin et al, 1986). A pesar de estas fuerzas fácil atrapar las células en suspensión, que no son capaces de mover las células que se adhieren a la superficie. Por lo tanto, a reducir la adherencia de la placa de cultivo en el punto donde las células están atrapados, los cubreobjetos está recubierta con poli-2-hidroxietilo (poli-HEMA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO), un compuesto no tóxico con la célula de repelente propiedades empleadas previamente para estudios de adherencia en las células endoteliales (Folkman y Moscona, 1978). Mientras que el poli-HEMA cubre la mitad de la placa de cultivo, la otra mitad está cubierta con un sustrato que soporta el crecimiento celular. En nuestro laboratorio, Sal-1 se utiliza como sustrato para el cultivo de células de la retina salamandra. El procedimiento para la fabricación de Sal-1 y poli-HEMA platos recubiertos se describe a continuación:
Fabricación de placas de cultivo
- Cubres limpio (# 1 VWR Scientific Inc., Media, PA) en ácido. Esto cubre objetos fue seleccionada por su grosor de tan sólo 0,1 mm, necesaria para los objetivos de gran apertura numérica necesario para enfocar el láser.
- Para crear un área de repelente de la célula, se disuelven 20 mg de poli-HEMA (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) en 1 ml de etanol al 95% durante la noche a temperatura ambiente. Preferiblemente, esta solución debe utilizarse dentro de un mes de preparación.
- Apuntalar la cubres en una posición casi vertical en un ambiente libre de polvo, como una campana.
- Coloque una o dos gotas de solución de poli-HEMA en la parte superior de la cubre objetos desde la punta de plástico de una micropipeta 200μl. Las gotas (50-100μl cada uno) debería limitarse a la mitad de los cubre-objetos. La pendiente pronunciada se asegura que el líquido fluye por la superficie del cubre objetos en el fondo, proporcionando una capa delgada y uniforme de poli-HEMA. Deje que la cubres recubiertos de poli-HEMA a secar en la campana durante 30-60 minutos a temperatura ambiente.
- Marque el lado de la poli-HEMA el cubre con una pluma de punta fina cerca del borde.
- Taladrar un agujero de 1 cm en la parte inferior de una placa de cultivo de 35 mm.
- Pegue el cubreobjetos recubiertos de poli-HEMA a la parte inferior de la placa de cultivo con Sylgard 184 (Dow Corning Co., Midland, MI) de manera que la cara cubierta de poli-HEMA se enfrenta hacia el interior del plato. Asegúrese de que el borde de la capa de poli-HEMA corre por el centro del agujero. Deje que la vajilla se seque durante 1-3 días a temperatura ambiente en un ambiente libre de polvo.
- El principio de una línea en el exterior de el cubre con una pluma de punta de diamante siguiendo el borde de la capa de poli-HEMA. Entonces, el principio dos líneas que se cruzan en ángulos rectos a aproximadamente 2 mm de distancia. Los dos puntos de intersección servir de referencia o puntos fiduciales que se utilizarán para la reproducción de la misma orientación de la placa de cultivo en la platina del microscopio.
- Esterilizar los platos bajo la luz ultravioleta durante la noche.
- Para crear un medio de células adherentes de la placa de cultivo, la capa no poli-HEMA medio con Sal-1, que contiene un ratón anti-salamandra anticuerpo contra las membranas de células de la retina (generosamente proporcionada por el Dr. Peter MacLeish, Escuela de Medicina Morehouse , Atlanta, GA; ver MacLeish et al (1983)).. En primer lugar, cubrir el Sal-1 lados, con aproximadamente 100μl de 0,1 mg / ml estériles de cabra anti-ratón de anticuerpos IgG (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN), teniendo cuidado de no derramar el líquido sobre el lado en el poli-HEMA. Dejar durante tres horas, y luego retírela. Lave el área con la misma solución de Ringer estéril una vez o dos veces, luego coloque 100μl Sal-1 sobrenadante, teniendo cuidado de no derramar el líquido en la parte de poli-HEMA del plato. El primer anticuerpo asegura Sal-1 está revestido en una concentración conocida.
- Incubar los platos con la noche a la mañana Sal-1.
- Eliminar la solución de Sal-1 anticuerpo y lavar el área con solución de Ringer estéril. Introducir 2 ml de medio para el plato justo antes de la chapa de la célula.
La composición de la solución de Ringer anfibio, medio libre de suero de anfibios, y la solución de Ringer para la digestión enzimática se encuentran en MacLeish y Townes Anderson (1988) y Mandell et al. (1993).
Preparación de cultivos celulares
Las células utilizadas en este video se deriva de la luz-adaptado, adultos, acuáticos fase de salamandras tigre (Ambystoma tigrinum), que mide 17-22 cm de longitud (Charles Sullivan Inc., en Nashville, TN), mantenido a 5 ° C en un 12 h: 12 h ciclo luz-oscuridad. Los protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey, en estricta conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud. Los procedimientos para la preparación de los cultivos de células retinianas son descritos por Nachman-Clewner y Townes-Anderson (1996) y son los siguientes:
- Decapitar y la médula de los animales. Eliminar los ojos y diseccionar las córneas y el iris. La retina se separe un poco en el ocular. Mediante la colocación de una pinza curva debajo de la retina, saque las retinas. No es importante si la lente se adjunta a la retina en esta etapa.
- Recopilación de las retinas de 14 U / ml papaína (Worthington, Freehold, NJ) en solución de Ringer salamandra durante 40 minutos.
- Antes de su uso, la solución de Ringer papaína debe ser burbujeado con 95% O 5.2% de gas CO 2 durante 30 min., Se esteriliza por el paso a través de un filtro de 0,22 micrones (Millipore, Carrigtwohill, Irlanda).
- Enjuague las retinas con una solución estéril de Ringer salamandra tres veces.
- Quitar las lentes de la solución de Ringer y suavemente triturar el tejido de la retina con un diámetro de 3 mm de pipeta para obtener una suspensión celular.
Pinzas láser manipulación de neuronas aisladas
- Coloque el plato de la cultura en la platina del microscopio, la orientación de la antena mediante la alineación de una marca en el plato con un punto de referencia en el escenario. Guardar las coordenadas de los puntos de referencia en el ordenador.
- Células de la placa en ambas Sal-1 y poli-HEMA mitad del plato.
- Permitir que las células que conformarse con unos 20 minutos, que es lo suficientemente largo para que las células en el lado adherente del plato para insertarse en el sustrato de anticuerpos.
- Seleccione una celda en el lado de Sal-1 adherente del plato. Marcar la X y la etapa y las coordenadas de una posición cercana a la célula. En nuestro caso, el punto fue de aproximadamente 10μm de las dendritas primarias de la celda seleccionada. Guardar las coordenadas en la computadora.
- Seleccione una segunda neurona, en nuestro caso un fotorreceptor, en el lado del poli-HEMA de la antena y el uso de la herramienta pinzas láser para atrapar. Trampas se puede lograr en una amplia gama de niveles de potencia. Sin embargo, se establece la potencia del láser en un 10% -20%, que es lo suficientemente baja como para evitar los restos de captura junto con la célula, pero no suficiente para el transporte de la célula a través del medio.
- Mientras mantiene la celda en la trampa, baje el escenario para que la célula está muy por encima de la superficie de la placa de cultivo y, sobre todo las neuronas adjunto. Mover el escenario bajo control de computadora para llevar el celular a la guardada previamente coordenadas X e Y en el Sal-1 lado. El movimiento en el escenario se fijó en 8-20μm / s, pero la velocidad máxima debe ser determinada empíricamente. A la llegada al punto de destino en el Sal-1 lado, aumentar la etapa para que la célula atrapada en la superficie del plato. La colocación de células se pueden hacer con una precisión de unas pocas micras. Permiten a la célula a adherirse a la Sal, un sustrato.
- La obtención de imágenes digitalizadas de las dos células de la pareja antes y después de la formación par proporciona un registro útil.
- Mantenga los pares de células en una incubadora. Para las células de salamandra, el lugar de los platos en una cámara húmeda a 10 º C. Las células pueden ser controlados por el transcurso de vídeo en tiempo y utilizar en cualquier técnica de las células biológicas requeridas.
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Discussion
La luz tiene un momento, y cuando un rayo de luz se refracta al pasar a través de un celular, se requiere una fuerza para cambiar la dirección del momento. Debido a la ley de conservación del momento, una fuerza en la dirección opuesta que, a su vez, reacciona de nuevo en una celda. Ashkin (1991) demostró que la fuerza generada por un rayo láser enfocado por una lente objetivo del microscopio se mueve una celda hacia el centro de atención. A pesar de que un rayo láser genera sólo un piconewtons pocos de la fuerza, esta fuerza es suficiente para tirar de una célula a través del medio. Una longitud de onda del infrarrojo cercano que es mal absorbida por el agua se utiliza para evitar el daño a las células (Liu et al 1995). La estación de trabajo láser pinza utilizada en nuestro laboratorio (celular Robotics Inc., Albuquerque NM) utiliza un 1 W, el láser de diodo de onda continua de la longitud de onda de 980nm. La luz láser se transmite a las células a través de una inmersión en aceite de 40x lente del objetivo del plan neofluor de gran apertura numérica (NA1.3) (Carl Zeiss Inc) que se centra la viga en el mismo plano focal como el microscopio.
Pinzas láser controlado por micromanipulación presenta una serie de ventajas con respecto a los estudios sobre las células al azar plateado. Por ejemplo, las células pueden ser colocados a una distancia deseada entre sí que puede ser estandarizado para todas las células manipuladas. Además, el rayo láser pasa a través de la superficie transparente de la placa de cultivo y, por tanto, la manipulación de células se realiza en un ambiente cerrado y estéril. Las fuerzas muy pequeñas generado por el láser pone un límite a lo que puede quedar atrapado. En nuestra experiencia, la adhesión y la forma de la célula son los factores más importantes que limitan el éxito de captura. En general, podemos atrapar las células aisladas de 10-15μm de diámetro y los transportan a distancias de varios milímetros a través de la placa de cultivo a su destino. Es posible pasar de células más grandes que éstas, por ejemplo, células de Müller gliales, que son 20-40μm de largo y son las células más grandes en nuestras culturas.
Debido a atrapar las células es un desafío cuando las células se adhieren al fondo de cristal de la placa de cultivo y el uno al otro, el desarrollo de un repelente de la superficie celular en el cubre con poli-HEMA resultó fundamental para nuestro éxito en la manipulación de las células. Aún así, las células en la superficie de poli-HEMA finalmente se convirtió en más pegajoso y difícil de manipular en las culturas más de 1-2 horas de vida. En culturas más antiguas, la práctica común en nuestro laboratorio fue para tratar de recoger las células con el láser mediante el ajuste de potencia máxima, a continuación, a su vez el poder hacia abajo para el transporte.
La facilidad con que los objetos pequeños pueden quedar atrapados en el láser significa que los desechos se puede tirar en la trampa de las distancias y fuera de la célula. Esto resultó ser un problema durante la captura de nuestras células. Esto se puede evitar en muchos casos por bajar la potencia del láser con el mínimo posible que pueda mantener la celda en la trampa. La velocidad a la cual las células pueden ser transportados en la trampa está limitada por la viscosidad del medio. Normalmente, establecer la velocidad de alrededor de 8.20 m / segundo, que se encuentran dentro de un rango seguro para el transporte.
La posibilidad de que el láser tiene efectos perjudiciales sobre las células, celebrada en la trampa debe ser considerado. En nuestra cultura la retina, nos encontramos con objetos oscuros como las células de pigmento que se destruyen cuando fue capturado en el rayo láser. Es evidente, por lo tanto, estas células no pueden ser estudiados usando pinzas láser. Sin embargo, en estudios previos sobre las neuronas de la retina y los fotorreceptores llevó a cabo en nuestro laboratorio, no se encontraron diferencias en el crecimiento neurítico y la capacidad para formar conexiones entre las células manipuladas con pinzas y las células no manipuladas (Townes-Anderson et al 1998; Clarke et al 2008 ).
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Acknowledgments
La investigación fue apoyada por subvenciones del NIH EY012031 y EY0182175 y la Fundación FM Kirby.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR international | 48380 080 | |
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | |
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning | 7078A-5 | |
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning | 430165 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc. | ||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc. | ||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss, Inc. | Numerical aperture (N.A. 1.3) | |
| Black and white CCD camera | Sony Corporation | ||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
