Summary
脑组织细胞的异质性，构成一个明显的局限性染色，因为大多数分析缺乏单细胞分辨率的表观遗传标记的研究。通常是神经元与神经胶质细胞和其他非神经元细胞混合。我们提供了一个协议提取和收集从人脑的神经元细胞核。
Abstract
人类大脑中的神经元在很大程度上成为有丝分裂期间胎儿发育，从而保持其在整个全寿命核。然而，鲜为人知的是，在神经细胞染色质和核组织的发育和衰老过程中的变化，或在慢性神经精神疾病。然而，迄今为止最染色质和DNA检测（鱼除外）缺乏单细胞分辨率。为此，相当大的脑组织细胞的异质性带来明显的局限性，因为通常是不同的亚群的神经元与神经胶质细胞和其他非神经元细胞的不同类型混合的。一种可能的解决方案将增长细胞类型的特定的文化，但最中枢神经系统的细胞，包括神经细胞，体外可持续，充其量只有几个星期，从而将提供一个表观遗传机制的不完整的模型，可能整个全寿命。在这里，我们提供了一个协议冻结（从来没有固定）人死后脑细胞核提取和纯化。该方法包括低渗裂解液中提取的原子核，其次是超速离心法和反NeuN抗体immunotagging。标记神经元的细胞核，然后收集分别用荧光激活排序。这种方法应该适用于任何一个物种的广泛的大脑区域，适用于染色质免疫沉淀与现场和修改特异性抗组蛋白抗体，和DNA甲基化和其他实验研究。
Protocol
细胞核提取
- 于5 mL裂解液1 250毫克冷冻死后脑组织douncer置于冰上。要收到约500万的排序后流式细胞仪细胞核，我们通常使用1000毫克每样本的组织。
- 一旦该组织已经解冻，dounce为1分钟，而冰的组织。
- 匀浆组织，放入15毫升明确超速离心机管。管置于冰上。
- 以9 mL蔗糖溶液2中，用移液器移液器明确超速离心机管底部，并释放 2蔗糖溶液与蔗糖溶液 2顶部的匀浆组织的解决方案，以创建一个浓度梯度。
- 权衡超速离心机管，以确保内超速离心机旋转时，他们都将平衡。加入裂解液1至顶层的任何重量的调整。
- 管已称量后，放入转子的水桶。
- 放入一个SW28转子所有的水桶，小心地放入超速离心机的转子。
- 超速离心机样品107163.6离心力为2.5小时，4 ° C。
- 一旦完成离心，去除上清液，同时发现在浓度梯度的碎片层，使用真空，同时小心不要打扰颗粒包含的原子核在试管底部。
- 每个颗粒，并添加500μL的1X PBS让冰坐了20分钟。这使得颗粒溶于自己的一点点，使得更容易稍后机械解散移液器向上和向下，这减少的压力量的原子核经验。
- 孵育冰20分钟后，原子核，机械移液器上下完全溶解细胞核内1XPBS。
- 从超速离心机管取出的原子核包含的解决方案，并结合成一个单一的2 ml离心管，两管的内容。同样，放在冰的样品。
免疫染色为流式细胞仪
- 在这一点上，使免疫中小学抗体组成的混合物，并阻止混合。对于每个样品，300μL含1.2μLNeuN抗体，100μL阻塞组合，其中包含0.5％BSA和10％正常山羊血清，在1XPBS和1μL的Alexa Fluor 488 1XPBS结合起来。对照样本中，排除的主要抗体NeuN，相反，只需添加更多1XPBS。
- 涡免疫混合物和孵化5分钟，在室温下在黑暗中。
- 虽然染色的混合物，是培育，使样品的控制。排序，样品，仅含有核的流式细胞仪，称为“不染控制”是必要的;第二个样品，阴性对照，含二级抗体的Alexa Fluor 488，无主的抗体NeuN，还需要原子核。
- 分装20μL的解决方案包含到另一个2 mL含980 UL阴性对照1XPBS管1XPBS不染控制，和另外20微升2 ml离心管核。提高卷的原子核包含示例备份1XPBS至1 mL。所有样品放置在冰上。
- 免疫混合物现在已完成孵化，其内容添加到相应的样品401μL。原子核的样本将收到NeuN的Alexa Fluor 488的混合物，而阴性样品将收到含有二级抗体的Alexa Fluor 488的混合物。
- 考虑到冷藏室的样品，在黑暗中旋转了45分钟。
- 样品在黑暗中孵育45分钟后，置于冰上，并给他们带来的流式细胞仪设施。在流式细胞仪设施的运输，样品应保持在冰上，在黑暗中。
流式细胞仪
- 在流式细胞仪的工厂，通过一个40微米的过滤器过滤的样品。然后，运行通过了几分钟的工具，同时又保持低温，以排序前得到一些初步的数据。
- 在这一点上，它是必要的设置进行排序所需的适当的盖茨。几种不同的门是用来排序的样品。第一门提供了一个样本内发现了不同的原子核的大小的想法，并允许从实际细胞核碎片separatation。第二个门，让我们单独排序原子核。丢弃任何聚合被丢弃在这一点上。最后，第三个门是设置一个特定的荧光波长，匹配的荧光，发现在我们的第二抗体。配售这扇大门，使我们能够进行排序和单独NeuN +，因此从NeuN神经核 - 核。
- 所有的门都选择后，原子核可以分为1XPBS。
- 一旦经历了整个样本，检查通过仪器运行的有序样品等分纯度的排序。确保样品的荧光是不扩散，而是包含在一个单一的象限。这是最好的选择样本超过90％的纯。
后，流式细胞仪
- 一旦样品已排序，处理的细胞核，就可以开始。排序样品取10毫升，以及加入2毫升的蔗糖溶液 2，有50 UL 1M氯化钙和30 UL 1M毫克（ACE） 2。在此提醒您，永远是因为原子核是不固定的的，一定要保持冰样本。
- 如果有小于10毫升排序样本，提高音量至10 mL，加入1XPBS，或调整相应的补充材料。
- 15分钟，反转样品几次冰和地点。
- 孵育15分钟，冰的样品后，在Swing桶转子离心15分钟4，在1786 离心力° C 。
- 倒掉上清，与使用的真空，而不会干扰在试管底部发现白色颗粒。
- 沉淀溶解于200μL的任何解决方案，您需要为出发实验，吸管向上和向下。
- 解决方案，并转移到一个较小的管放入-80℃冷冻，直到进一步利用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里介绍的协议应重点研究神经细胞染色质的表观遗传变化，更普遍，特别是有用的，对神经细胞的细胞核，在正常的发展和老龄化，或在神经或精神疾病，分子表型。当脑组织细胞的异质性，包括潜在的变化在老化过程中神经元的神经胶质细胞的口粮，或因疾病是关注1，该方法是特别的优势。例如，通过染色质免疫沉淀技术结合目前的排序协议，我们最近在大脑衍生神经营养因子（BDNF）基因启动子的描述神经元特异性组蛋白的甲基化模式，并为更多的神经元的基因2。以前类似的方法已被用于收集成人追溯出生约会3大脑皮层神经元。分拣技术，还聘请在鼠脑2，因为稳定的原子核中冷冻，然后解冻组织，我们预计，这里介绍的方法是适用于广泛的物种的。因为从低至10000个细胞的染色质免疫沉淀现在即使有更全面的基因组覆盖4可行的，它可能会使用比起始原料，上面我们建议的1000毫克少得多。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
作者感谢理查德博士Konz和工作人员在美国马萨诸塞大学医学院的流式细胞仪核心设施提供咨询和技术支持。也可用于糖尿病内分泌研究中心授予DK032520支持的核心资源。这项工作是由美国国立精神卫生研究所（NIMH），国家药物滥用研究所（NIDA）和国家儿童健康和人类发展研究所的赠款支持。
Materials
Reagents:
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons. PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S.
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells. Biotechniques. 43, 791-797 (2007).
.jpg
){kind=link}