Un test pour mesurer la réactivité comportementale du poisson-zèbre à l'évolution des intensités de lumière

Summary

Nous avons développé la réponse visuelle et de motricité pour quantifier la puissance du moteur du poisson zèbre larvaire dans la réponse aux augmentations de lumière et décrémente. Nous avons également examiné la vision mutants poisson zèbre, y compris le pas de la réponse optocinétique (CNRC) mutants, qui étaient censées être complètement aveugle lorsqu'il est testé par un autre test de vision, le réflexe optocinétique.

Abstract

Le réflexe de optocinétique (OKR) est une base visuelle réflexe exposées par la plupart des vertébrés et joue un rôle important dans la stabilisation de l'oeil par rapport à la scène visuelle. Toutefois, l'OKR exige que l'animal détectez des bandes en mouvement et il est possible que les poissons qui ne parviennent pas à exposer une OKR peut ne pas être complètement aveugle. Un poisson zèbre mutant, l'absence de réponse optocinétique c (CNRC) n'a pas OKR dans n'importe quelles conditions de lumière testé et a été signalé à être complètement aveugle. Auparavant, nous avons montré que l'activité des cellules ganglionnaires OFF peuvent être enregistrées dans ces mutants. Afin de déterminer si le poisson mutant sans OKR tels que le mutant CNRC peut détecter par incréments de lumière simple et décrémente nous avons développé le test de motricité visuelle comportementale (VMR). Dans cet essai, les larves de poisson zèbre simples sont placés dans chaque puits d'une plaque de 96 puits permettant la surveillance simultanée des larves en utilisant un système automatisé de vidéo-système de suivi. Les réponses locomotrices de chaque larve à 30 minutes de lumière ON et OFF 30 minutes de lumière ont été enregistrées et quantifiées. WT poissons ont un bref pic d'activité automobile sur les lumières allumées, connue comme la réaction de sursaut, suivi d'un retour plus faibles que l'activité de base, appelé à un gel. Poissons WT également fortement augmenter leur activité locomotrice immédiatement après lumières et que progressivement (plus de quelques minutes) retour à l'activité locomotrice de base. Les mutants du CNRC réagissent de façon similaire à la lumière OFF comme le poisson WT, mais présentent une légère diminution de leur activité en moyenne par rapport aux poissons WT. L'activité motrice en réponse à la lumière ON dans nrc mutants est retardée et léthargique. Il ya un temps de montée lente de la réponse du CNRC mutant à la lumière SUR par rapport à la lumière en poids sur la réponse. Les résultats indiquent que les poissons du CNRC ne sont pas complètement aveugles. Parce que les téléostéens peuvent détecter la lumière à travers la rétine non tissus, nous a confirmé que les réponses immédiates à la lumière du comportement d'intensité changements nécessitent yeux intacts en utilisant le chokh (chk) des mutants, qui manquent totalement les yeux dès les premiers stades de développement. Dans notre test VMR, les mutants ne présentent aucun chk réaction de sursaut soit la lumière ON ou OFF, montrant que les yeux latéraux de médiateur dans ce comportement. Le dosage de VMR décrit ici un complément du dosage OKR bien établie, qui n'a pas de tester la capacité des larves de poisson zèbre pour répondre aux changements dans les intensités lumineuses. De plus, l'automatisation du test VMR se prête à criblage à haut débit pour les défauts de l'intensité lumineuse conduit réponses visuelles.

Protocol

Ce protocole décrit les étapes pour effectuer la réponse visuelle-moteur de larves de poisson zèbre à des incréments de la lumière et décréments dans votre propre laboratoire. Le poisson zèbre constituent un système modèle idéal pour des études comportementales. Ils sont faciles à entretenir, ils ont des tailles d'embrayage grandes, et elles se développent rapidement. Par exemple, les yeux des larves de poisson zèbre sont sensibles à la lumière par jour 3 de développement et à laquelle ils présentent une réaction de sursaut.

Partie 1: Placage chaque poisson dans une plaque à 96 puits

1. Cultivez larves WT dans un cycle clair / sombre à 28 ° C pendant au moins 4 jours après la fécondation (DPF). Nos typiques de lumière: obscurité du cycle est de 14 heures de lumières sur à partir de 09h00, et 10 heures de lumières, à partir de 23h00. Pour les meilleurs résultats comportementaux, éviter la surpopulation; nous conservons généralement pas plus de 50 larves dans un seul plat de Pétri.
2. Après 4 dpf, le poisson zèbre sont prêts à être transférés dans une plaque de 96 puits. Pour donner à la salle de la natation plus de larves, nous utilisons habituellement une plaque de 96 puits avec un bien-grande taille de 650 ul, toutefois, la norme plaques de 96 puits fonctionnent très bien. En utilisant une pipette de transfert en plastique, délicatement le transfert d'une larve par puits.
3. Après le transfert des poissons dans les puits, remplir chaque puits avec de l'eau suffisamment de poissons tels que la surface de l'eau est presque au ras de la surface du puits. Soit débordement ou sous-remplissage du bien peut causer des problèmes optiques pour la caméra d'enregistrement. Aussi, prenez garde à ne pas introduire de bulles dans les puits.

Partie 2: Enquête sur l'appareil d'enregistrement

Pour cette partie du protocole, s'il vous plaît se référer au film afin d'identifier les composants et de vous familiariser avec notre série de l'appareil d'enregistrement.

1. A l'intérieur de la chambre d'enregistrement est un lieu bien défini à la position de la plaque de 96 puits.
2. La caméra est positionnée dans le dos et se concentre sur la plaque en utilisant des miroirs de la boîte. L'angle de ces miroirs peut être ajusté en tournant les vis qui maintiennent le miroir en place.
3. La chambre d'enregistrement est illuminé par le bas par des diodes infrarouges. Cela permet à l'appareil photo pour voir les poissons, même dans l'obscurité. Les larves ne peuvent pas détecter la lumière infrarouge, donc cette illumination constante IR n'a pas d'incidence de l'expérience. LED blanches éclairent aussi la chambre d'enregistrement d'en bas. Ils sont contrôlés séparément de l'éclairage infrarouge. Eclairer la chambre avec la lumière blanche par-dessus ou sur les côtés est certes possible, mais dans ces cas, des précautions doivent être prises pour éviter une forte éclats de la surface de l'eau qui peuvent interférer avec la caméra.
4. Pour les expériences qui durent plus longtemps que quelques heures, remplir la chambre avec un filet d'eau pour aider à maintenir une température constante pendant toute la durée expérimentale. Une façon d'accomplir un flux constant d'eau est de pomper l'eau d'un réservoir par une petite pompe d'aquarium qui est chauffé à 28 ° avec un chauffe-aquarium sous-marin classique.
5. Pour minimiser les vibrations parasites de la salle, l'unité d'enregistrement complet doit s'asseoir sur une table bilan lourd.

Partie 3: Alignement de la plaque de 96 puits avec la grille informatique de la vidéo-tracking

Logiciel

1. Placer la plaque de 96 puits contenant le poisson dans la chambre d'enregistrement.
2. Lorsque vous utilisez un bain d'eau, lentement placer la plaque dans l'eau, donnant le niveau de l'eau une chance de s'adapter sans répandre sur la plaque. Sinon, arrêter l'écoulement de l'eau, ajouter la plaque, puis reprendre l'écoulement. Aussi, soyez sûr d'utiliser un ressort ou un élastique pour maintenir la plaque de 96 puits en place.
3. Dans le logiciel Videotrack Viewpoint, vérifiez que toutes les larves de votre expérience sont visibles sur l'écran d'ordinateur. Utilisation des commandes du logiciel, d'aligner la grille des logiciels de vidéo-tracking avec le puits de votre plaque d'telle sorte que chaque poisson est dans un carré de la grille. L'ordinateur de suivi sera calculer le mouvement séparément pour chacune de ces boîtes, donc si vous désaligner la grille informatique certains des mouvements de poissons peuvent être perdues. Ou pire encore: deux poissons adjacents va occuper la même zone et être compté comme un poisson. Cette étape est très importante pour tous vos enregistrements.
4. Après l'alignement, le programme du calendrier pour quand les lumières doivent aller sur et en dehors. Nous permettent généralement de 3 heures de l'adaptation clair ou foncé dans la boîte à la fois d'obtenir un niveau d'activité de base, mais aussi pour donner des larves une occasion de se calmer après le pipetage et de manutention. Après le départ, nous avons ensuite alterner avec 30 minutes de lumières sur suivies de 30 minutes de lumières, et de répéter plusieurs fois.
5. Ensuite, fermez la porte de la chambre d'enregistrement et de commencer l'enregistrement.
6. En pratique, nous enregistrons l'activité de chaque poisson par seconde, mais le logiciel Point de vue, en fait le cadre des dossiers par les données de la trame (voir le filmpour une démonstration de la collecte des données). Réglage de la valeur seuil pour les changements de pixels par image minimale dépendra un peu de votre appareil photo et la configuration particulière de lumière. Pour notre configuration, nous utilisons habituellement un seuil de 4 pixels, c'est, si moins de 4 pixels sont changeantes, il est considéré comme arrière-plan. Si plus de 4 pixels sont en mouvement, il indique que le poisson est en mouvement. Nous empiriquement déterminé que cette coupure détecte presque toutes les larves nagent et les mouvements tour.
7. Même si les boîtes d'enregistrement d'isoler les larves assez bien, éteindre la lumière dans la chambre et prendre soin de minimiser les interruptions avec les bruits mécaniques tels que la fermeture et l'ouverture des portes de la salle, une fête de danse, ou en faisant vos routines d'exercice.

Partie 4: Analyse des données

1. Après l'expérience est terminée, le transfert des données recueillies dans une feuille Excel ou dans votre suite de l'analyse préférés.
2. La feuille Excel ci-joint est un exemple de ce que les données peuvent ressembler: elle contient le temps en secondes depuis le début de l'expérience et l'activité de chaque larve par seconde pour tous les poissons à travers toute l'expérience (voir données complémentaires fichier d'exemple dans la section Fichiers de cette page).
   
   
3. La figure 1 montre un exemple de l'activité d'une seule larve. La figure 2 est une trace représentative de la moyenne de 40 larves de poisson zèbre WT. La moyenne ON et OFF réponses sont importantes et cohérentes.
   
   
   
   Figure 1: Activité d'un seul poisson L'activité d'un seul poisson WT à 5 dpf en réponse à une alternance de périodes de 30 minutes de lumière ON et OFF.. Les réponses sur sont indiqués par des flèches noires et les réponses OFF avec les flèches rouges.
   
   
   
   Figure 2: L'activité moyenne de 40 poissons L'activité moyenne de 40 poissons WT à 5 dpf en réponse à une alternance de périodes de 30 minutes de lumière ON et OFF.. La moyenne ON (flèches noires) et OFF (flèches rouges) les réponses sont importantes et cohérentes.

5. Les résultats représentatifs

La figure 3 est un aperçu schématique des lignes expérimentales utilisées dans l'ensemble de nos expériences.



Figure 3. La conception expérimentale de la réponse motrice visuelle (VMR) de test. Un poisson) individuels sont placés dans une plaque de 96 puits dans une chambre d'enregistrement. L'activité de chaque poisson est mesurée par seconde. B) les poissons sont donnés une période d'adaptation foncé ou clair de les régler et d'obtenir un niveau d'activité de base. Les périodes d'éclairage de 30 minutes ON et lumières sont introduits de façon consécutive pour un total de 3 heures. Ce diagramme a été adapté à partir Prober et al., 2006.

Qu'est-ce que les graphiques réponse visuelle-moteur ressemble?

Nous avons mesuré les réponses ON et OFF de poissons WT à des incréments de lumière et décrémente. Pour confirmer que ces réponses ont été dépendante de la fonction des yeux, nous avons mesuré l'activité des mutants chk, qui ne développent pas les yeux. La figure 4 montre l'activité moyenne obtenue à partir d'animaux WT ainsi que les mutants chk.



Figure 4: WT poissons ont clairement ON et OFF des réponses qui sont médiés par les yeux latéraux Le comportement locomoteur des larves de poisson zèbre à 5 dpf en réponse à 30 minutes de lumière et 30 minutes de OFF lumière est enregistrée par seconde.. Chaque trace correspond à une moyenne de 480 réponses individuelles à partir de 120 WT (bleu trace) ou des larves mutantes chk (orange trace) a enregistré plus de 3 expériences. Les mutants chk n'augmentent pas significativement leur activité soit à la lumière par incréments ou décréments et ont un niveau de base faible d'activité. Ce chiffre a été adapté à partir Emran et al., 2007.

Visual-Motor Réponses du CNRC poissons mutants.

Le mutant du CNRC a été pensé pour être complètement aveugle basée sur le test OKR. Dans le mutant du CNRC, les terminaux photorécepteur ne se forme pas correctement et la voie visuelle Sur est gravement compromise ^1. Rétiniennes enregistrements de cellules ganglionnaires de ces poissons mutants a révélé qu'ils présentent majoritairement hors-type des réponses des cellules ganglionnaires, certains anormaux ON-OFF, mais pas purs Sur les réponses de type ^2.

En utilisant le test VMR, nous avons montré que le mutant CNRC a une normale OFF-réponse et un retard et la lenteur SUR-réponse (SEFigure E 5). Ainsi, le mutant CNRC n'est pas complètement aveugle comme le pensait auparavant ^2.


Figure 5: mutats nrc augmenter leur activité en réponse aux changements dans les intensités lumineuses des réponses comportementales à la lumière ON et OFF de WT et le CNRC larves mutantes à 5 dpf.. Chaque trace correspond à une moyenne de 480 réponses provenant de 120 poissons individuels de chaque génotype. Le comportement locomoteur moyenne de mutants du CNRC (traces rose) est légèrement réduite par rapport aux poissons WT (traces bleues), mais reste vigoureuse en suivant la lumière OFF relance. Notez le temps de montée lente dans la réponse du CNRC mutant à la lumière par rapport à la lumière SUR LE réponse du poisson WT.

Discussion

Les procédures expérimentales, nous montrons dans le film sont tous représentatifs de poissons WT. Cependant, ces expériences peuvent être réalisées de façon analogue sur le poisson mutant ainsi (voir la section résultat représentatif). Nous suggérons aux poissons WT plaque et le poisson mutant sur la même plaque dans un aperçu damier à des fins de contrôle optimal.

Lors de l'utilisation du poisson mutant sur la même plaque que les poissons WT vous assurer que vous écrivez ce type de poisson a été plaqué dans chaque puits. Voici une suggestion sur la façon de garder une trace du poisson plaquée dans chaque puits (salon du livre note avec fiche technique).

Aussi, il est préférable de faire des répétitions d'une expérience certaine dans le même temps de la journée. Par exemple, si vous commencez l'adaptation trois heures sombres pour obtenir une activité de base à 12 h (midi), puis répéter la même expérience au même moment pour les ensembles de données suivants.

Aussi, ne les expériences pendant la journée que les poissons sont plus actifs et sensibles à la lumière des changements d'intensité durant la journée par rapport au cours de la nuit.

Nous avons utilisé le logiciel Videotrack dans le mode de quantification à partir Lifesciences Viewpoint. Cependant, il existe d'autres systèmes de suivi disponibles comerically, y compris à partir EthoVision Noldus.Or, comme d'autres labshave fait, la conception youcould votre logiciel de suivi propres.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Microplate devices	Tool	Whatman, GE Healthcare	7701-1651
Transfer pipetes	Tool	VWR international	202205
Fish water	Reagent			refer to reference #4
Recording chambers (Zebrabox)	Tool	Viewpoint Lifesciences
Videotrack Software	Tool	Viewpoint Lifesciences