Summary
हम दृश्य - मोटर रिस्पांस विकसित करने के लिए प्रकाश वेतन वृद्धि और decrements के जवाब में लार्वा zebrafish की मोटर उत्पादन quantitate. हम भी कोई optokinetic प्रतिक्रिया म्यूटेंट (NRC), जो पूरी तरह से अंधा होने लगा रहे थे जब एक और दृष्टि परख, optokinetic पलटा के द्वारा परीक्षण सहित zebrafish दृष्टि म्यूटेंट, जांच की.
Protocol
इस प्रोटोकॉल प्रकाश अपनी खुद की प्रयोगशाला में वेतन वृद्धि और decrements दृश्य मोटर zebrafish लार्वा के रिस्पांस प्रदर्शन करने के लिए कदम की रूपरेखा. Zebrafish व्यवहार के अध्ययन के लिए एक महान मॉडल प्रणाली रहे हैं. वे बनाए रखने के लिए आसान कर रहे हैं, वे बड़े क्लच आकार है, और वे जल्दी से विकसित करना. उदाहरण के लिए, विकास के 3 दिन के द्वारा और जो समय वे एक बिदकाना प्रतिक्रिया एक्ज़िबिट zebrafish लार्वा की आँखों प्रकाश उत्तरदायी हैं.
भाग 1: एक 96 अच्छी तरह से थाली में अलग - अलग मछली चढ़ाना
- एक अंधेरे / प्रकाश चक्र के तहत 28 पर आगे बढ़ें WT लार्वा ° सी कम से कम 4 दिनों के बाद निषेचन (DPF) तक. हमारे ठेठ प्रकाश: अंधेरे चक्र पर 9:00 पर शुरू, और रोशनी के 10 घंटे रवाना, 11:00 बजे शुरू रोशनी के 14 घंटे है. सबसे अच्छा व्यवहार परिणामों के लिए, भीड़भाड़ से बचने के, हम आम तौर पर एक एकल पेट्री डिश में कोई अधिक से अधिक 50 लार्वा रखने.
- 4 DPF के बाद, zebrafish एक 96 अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरित किया जा करने के लिए तैयार हैं. लार्वा अधिक तैराकी कमरा दे करने के लिए, हम आम तौर पर 650 μl एक बड़ी अच्छी तरह से आकार के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग करें, तथापि, मानक 96 अच्छी तरह प्लेटें बस ठीक काम. एक प्लास्टिक हस्तांतरण pipet का उपयोग, धीरे से एक लार्वा प्रति हस्तांतरण.
- कुओं में मछली स्थानांतरित करने के बाद, ऐसी है कि पानी की सतह लगभग कुओं के शीर्ष करने के लिए फ्लश है पर्याप्त मछली पानी से बाहर एक अच्छी तरह से भर. या तो overfilling या अच्छी तरह से underfilling रिकॉर्डिंग कैमरे के लिए ऑप्टिकल समस्याएं पैदा कर सकता है. इसके अलावा, कुओं में बुलबुले परिचय नहीं ख्याल रखना.
भाग 2: रिकॉर्डिंग उपकरण के सर्वेक्षण
प्रोटोकॉल के इस भाग के लिए, कृपया फिल्म के लिए उल्लेख करने के लिए घटकों की पहचान करने के लिए और रिकॉर्डिंग उपकरण के हमारे सेट अप के साथ खुद को परिचित.
- रिकार्डिंग कक्ष के अंदर एक अच्छी तरह से परिभाषित जगह 96 अच्छी तरह से थाली की स्थिति है.
- कैमरा पीठ में तैनात है और बॉक्स बंद दर्पण का उपयोग कर प्लेट पर ध्यान केंद्रित है. इन दर्पण के कोण शिकंजा उस जगह में दर्पण पकड़ मोड़ से समायोजित किया जा सकता है.
- रिकॉर्डिंग कक्ष के नीचे से अवरक्त एल ई डी द्वारा प्रबुद्ध है. यह कैमरा भी अंधेरे में मछली देखने के लिए अनुमति देता है है. लार्वा IR प्रकाश का पता नहीं लगा सकते, तो इस निरंतर IR रोशनी प्रयोग को प्रभावित नहीं करता है. सफेद एल ई डी भी नीचे से रिकॉर्डिंग कक्ष रोशन. वे अलग आईआर रोशनी से नियंत्रित कर रहे हैं. से ऊपर या पक्षों से सफेद रोशनी के साथ चैम्बर रोशन निश्चित रूप से संभव है, तथापि, उन मामलों में, देखभाल से बचने के लिए पानी की सतह है कि कैमरे के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं बंद मजबूत glares लिया होना चाहिए.
- प्रयोगों है कि घंटे के एक जोड़े की तुलना में अब पिछले धीरे पानी चलाने के लिए प्रयोगात्मक अवधि के लिए एक निरंतर तापमान बनाए रखने में मदद के साथ कक्ष को भरने के लिए. पानी के एक निरंतर प्रवाह को पूरा करने का एक तरीका है कि पानी के नीचे एक ठेठ मछलीघर हीटर के साथ 28 ° गरम किया जाता है एक छोटे से मछलीघर पंप द्वारा एक जलाशय से पानी पंप है.
- कमरे से आवारा कंपन को कम करने के लिए, पूरी रिकॉर्डिंग एकक एक भारी संतुलन तालिका के ऊपर बैठना चाहिए.
भाग 3: वीडियो ट्रैकिंग के कंप्यूटर ग्रिड के साथ 96 अच्छी तरह से थाली के संरेखण
सॉफ्टवेयर
- 96 अच्छी तरह से रिकॉर्डिंग के चेंबर में मछली युक्त थाली प्लेस.
- जब एक पानी के स्नान का उपयोग कर, धीरे धीरे पानी में थाली जगह जल स्तर करने के लिए एक थाली पर spilling बिना समायोजित करने का मौका दे रही है. वैकल्पिक रूप से, बंद पानी का प्रवाह बंद, थाली जोड़ने, और तब प्रवाह फिर से शुरू. इसके अलावा, एक वसंत या एक रबर बैंड का उपयोग करने के लिए जगह में 96 अच्छी तरह से थाली पकड़ करने के लिए सुनिश्चित हो.
- दृष्टिकोण Videotrack सॉफ्टवेयर में जाँच, कि अपने प्रयोग के सभी लार्वा कंप्यूटर स्क्रीन पर दिखाई दे रहे हैं. सॉफ्टवेयर के नियंत्रण का उपयोग करना, अपने ऐसी है कि प्रत्येक मछली ग्रिड के एक वर्ग के भीतर है थाली के कुओं के साथ सॉफ्टवेयर वीडियो ट्रैकिंग - ग्रिड पर संरेखित करें. ट्रैकिंग कंप्यूटर आंदोलन की गणना हो जाएगा इन बक्सों में से प्रत्येक के लिए अलग है, इसलिए यदि आप कंप्यूटर ग्रिड misalign मछली आंदोलनों के कुछ खो दिया जा सकता है. या भी बदतर: दो आसन्न मछली उसी क्षेत्र पर कब्जा है और एक मछली के रूप में गिना. यह कदम अपने सभी रिकॉर्डिंग के लिए बहुत महत्वपूर्ण है.
- संरेखण के बाद, कार्यक्रम के लिए जब रोशनी पर और बंद जाना चाहिए समय. हम आम तौर पर बॉक्स में प्रकाश या अंधेरे अनुकूलन के 3 घंटे के दोनों एक आधारभूत गतिविधि का स्तर प्राप्त करने के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन यह भी लार्वा pipetting और हैंडलिंग के बाद शांत हो जाओ करने का अवसर दे. आधारभूत बाद, हम तो पर रोशनी रवाना रोशनी के 30 मिनट बाद 30 मिनट के साथ वैकल्पिक, और कई बार दोहराएँ.
- अगले, रिकार्डिंग कक्ष के दरवाजे बंद करो और रिकॉर्डिंग शुरू.
- व्यवहार में, हम प्रति सेकंड प्रत्येक मछली की गतिविधि रिकॉर्ड है, लेकिन वास्तव में दृष्टिकोण सॉफ्टवेयर डेटा फ्रेम से फ्रेम रिकॉर्ड (फिल्म को देखेंडेटा संग्रह का एक प्रदर्शन के लिए). फ्रेम प्रति न्यूनतम पिक्सेल परिवर्तन के लिए सीमा मान सेट कुछ हद तक अपने विशेष कैमरे और प्रकाश सेटअप पर निर्भर करेगा. हमारे सेटअप के लिए, हम आम तौर पर 4 पिक्सल के एक सीमा का उपयोग करें, वह है, अगर से कम 4 पिक्सल बदल रहे हैं, यह पृष्ठभूमि में माना जाता है. यदि अधिक से अधिक 4 पिक्सल बढ़ रहे हैं, यह इंगित करता है मछली बढ़ रहा है. हम empirically निर्धारित किया है कि इस cutoff के लगभग सभी लार्वा तैरना और बारी आंदोलनों का पता लगाता है.
- हालांकि रिकॉर्डिंग बक्से लार्वा काफी अच्छी तरह से अलग, बंद कमरे में रोशनी की बारी है और देखभाल करने के लिए ऐसे कमरे में बंद और खोलने दरवाजे, एक नृत्य पार्टी होने, या अपने व्यायाम दिनचर्या कर के रूप में यांत्रिक शोर के साथ रुकावट कम से कम.
भाग 4: डेटा का विश्लेषण
- प्रयोग के बाद पूरा हो गया है, एक एक्सेल शीट में या अपने पसंदीदा विश्लेषण सूट में एकत्रित डाटा हस्तांतरण.
- संलग्न एक्सेल शीट क्या डेटा की तरह लग सकता है की एक उदाहरण है: यह गतिविधि और पूरे प्रयोग के दौरान सभी मछली के लिए सेकंड के प्रति प्रत्येक लार्वा के प्रयोग के शुरू से ही सेकंड में समय (में अनुपूरक फ़ाइल उदाहरण डेटा देखें शामिल इस पृष्ठ की फ़ाइलें अनुभाग).
- चित्रा 1 में एक एकल लार्वा की गतिविधि का एक उदाहरण दिखाता है. चित्रा 2 40 WT zebrafish लार्वा के औसत के एक प्रतिनिधि का पता लगाने है. पर औसत और रवाना प्रतिक्रियाओं प्रमुख और संगत कर रहे हैं.
चित्रा 1: एक एकल मछली की गतिविधि पर 30 मिनट के प्रकाश की अवधि बारी और रवाना करने के लिए प्रतिक्रिया में 5 DPF पर एक एकल WT मछली की गतिविधि. पर प्रतिक्रियाओं काला तीर और लाल तीर के साथ रवाना प्रतिक्रियाओं से संकेत कर रहे हैं.
चित्रा 2: 40 मछली की औसत गतिविधि पर 30 मिनट के प्रकाश की अवधि बारी और रवाना करने के लिए प्रतिक्रिया में 5 DPF पर 40 WT मछली की औसत गतिविधि. पर औसतन (काला तीर) और रवाना प्रतिक्रियाएं (लाल तीर) प्रमुख और संगत कर रहे हैं.
5. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 3 प्रयोगात्मक के सभी हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल किया रूपरेखा का एक योजनाबद्ध रूपरेखा है. 
चित्रा 3. दृश्य मोटर रिस्पांस परीक्षण (VMR) के प्रायोगिक डिजाइन एक) व्यक्तिगत मछली एक रिकॉर्डिंग कक्ष में एक 96 अच्छी तरह से थाली में रखा जाता है. प्रत्येक मछली की गतिविधि प्रति सेकंड में मापा जाता है. बी) मछली अंधेरे या प्रकाश अनुकूलन की अवधि के लिए उन्हें व्यवस्थित करने के लिए और एक आधारभूत गतिविधि का स्तर प्राप्त करने के दिए गए हैं. 30 मिनट पर रोशनी और रोशनी के काल रवाना लगातार 3 घंटे के एक कुल के लिए शुरू कर रहे हैं. इस चित्र Prober एट अल से रूपांतरित किया गया. 2006.
दृश्य मोटर रिस्पांस रेखांकन कैसे दिखते हैं?
हम प्रकाश वेतन वृद्धि और decrements WT मछली के पर और बंद प्रतिक्रियाओं मापा. यह पुष्टि करने के लिए कि इन प्रतिक्रियाओं आँख समारोह पर निर्भर थे, हम chk म्यूटेंट, जो किसी भी आंखों विकसित नहीं की गतिविधि मापा. चित्रा 4 औसत WT के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पशुओं chk म्यूटेंट से प्राप्त गतिविधि से पता चलता है. 
चित्रा 4: WT मछली पर और बंद प्रतिक्रियाओं है कि पार्श्व आंखों से मध्यस्थता कर रहे हैं स्पष्ट है 30 मिनट पर प्रकाश की और प्रकाश रवाना की 30 मिनट के जवाब में 5 DPF पर zebrafish लार्वा की हरकत का व्यवहार प्रति सेकंड दर्ज की गई है. . प्रत्येक ट्रेस 120 व्यक्ति (नीला ट्रेस) WT या chk उत्परिवर्ती लार्वा (नारंगी का पता लगाने) 3 प्रयोगों से अधिक रिकॉर्ड से 480 प्रतिक्रियाओं के एक औसत का प्रतिनिधित्व करता है. chk म्यूटेंट काफी या तो प्रकाश वेतन वृद्धि या decrements उनकी गतिविधि में वृद्धि नहीं करते हैं और गतिविधि के एक कम आधारभूत स्तर है. यह आंकड़ा Emran एट अल, 2007 से अनुकूलित किया गया था.
NRC उत्परिवर्ती मछली से दृश्य मोटर प्रतिक्रियाएँ.
NRC उत्परिवर्ती के लिए पूरी तरह से OKR परीक्षण पर आधारित अंधा होने लगा था. NRC उत्परिवर्ती में फोटोरिसेप्टर टर्मिनलों ठीक से फार्म नहीं है और दृश्य मार्ग पर गंभीर समझौता किया है 1 . इन उत्परिवर्ती मछली से रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल रिकॉर्डिंग से पता चला है कि वे मुख्य रूप से प्रदर्शन ऑफ प्रकार नाड़ीग्रन्थि सेल प्रतिक्रिया, कुछ असामान्य पर बंद, लेकिन कोई प्रतिक्रियाएं प्रकार शुद्ध 2.
VMR परीक्षण का उपयोग कर हम पता चला है कि NRC उत्परिवर्ती एक सामान्य ऑफ प्रतिक्रिया और एक देरी और सुस्त प्रतिक्रिया है (सेई चित्रा 5). इस प्रकार, NRC उत्परिवर्ती पूरी तरह से अंधा है के रूप में पहले 2 सोचा नहीं है. 
चित्रा 5: NRC mutats प्रकाश तीव्रता में परिवर्तन करने के लिए जवाब में उनकी गतिविधि में वृद्धि व्यवहार प्रतिक्रियाओं पर प्रकाश और WT और NRC 5 DPF उत्परिवर्ती लार्वा से रवाना. . प्रत्येक ट्रेस प्रत्येक जीनोटाइप से 120 व्यक्ति मछली से 480 प्रतिक्रियाओं के एक औसत का प्रतिनिधित्व करता है. NRC म्यूटेंट की औसत हरकत का व्यवहार (गुलाबी निशान) थोड़ा के रूप में WT मछली (नीले निशान) की तुलना में कम है, लेकिन उत्तेजना रवाना प्रकाश निम्नलिखित जोरदार बनी हुई है. नोट NRC उत्परिवर्ती प्रतिक्रिया में धीमी गति से वृद्धि समय पर WT मछली की प्रतिक्रिया पर प्रकाश की तुलना में प्रकाश है.
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Discussion
प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं हम फिल्म में दिखाने WT मछली के सभी प्रतिनिधि हैं. हालांकि, इन प्रयोगों के उत्परिवर्ती मछली के रूप में अच्छी तरह से (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें) पर हो analogously किया जा सकता है. हम प्लेट WT और इष्टतम नियंत्रण के प्रयोजनों के लिए एक चेकर बोर्ड रूपरेखा में एक ही थाली पर उत्परिवर्ती मछली का सुझाव देते हैं.
जब WT मछली के रूप में एक ही थाली पर उत्परिवर्ती मछली का उपयोग कर सुनिश्चित करें कि आप लिख क्या मछली के प्रकार प्रत्येक कुएं में चढ़ाया गया था बनाते हैं. यहाँ कैसे एक अच्छी तरह से में मढ़वाया मछली का ट्रैक रखने के लिए (डेटा पत्रक के साथ नोट बुक शो) पर एक सुझाव है.
इसके अलावा, यह सबसे अच्छा है के लिए दिन के एक ही समय में एक निश्चित प्रयोग के दोहराता है. उदाहरण के लिए, अगर आप 3 घंटे अंधेरे अनुकूलन शुरू करने के लिए 12 बजे (दोपहर) में एक आधारभूत गतिविधि प्राप्त है, तो डेटा के निम्नलिखित सेट के लिए एक ही समय में एक ही प्रयोग को दोहराने.
इसके अलावा, दिन के दौरान प्रयोगों मछली के रूप में और अधिक सक्रिय और संवेदनशील दिन के दौरान बनाम रात के दौरान तीव्रता परिवर्तन प्रकाश कर रहे हैं.
हम दृष्टिकोण लाइफसाइंसेस से परिमाणीकरण मोड में Videotrack सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया. हालांकि, वहाँ अन्य comerically उपलब्ध Noldus.Or से EthoVision सहित ट्रैकिंग सिस्टम, के रूप में अन्य किया labshave, अपने ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर डिजाइन youcould हैं.
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Acknowledgments
यह काम स्वास्थ्य EY0081 और 5T32UY07145 अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा और शूरवीरों टमप्लर नेत्र फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया. जेसन Rihel ब्रिस्टल Squibb लाइफ साइंसेज रिसर्च फाउंडेशन के एक साथी है.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Microplate devices | Tool | Whatman, GE Healthcare | 7701-1651 | |
| Transfer pipetes | Tool | VWR international | 202205 | |
| Fish water | Reagent | refer to reference #4 | ||
| Recording chambers (Zebrabox) | Tool | Viewpoint Lifesciences | ||
| Videotrack Software | Tool | Viewpoint Lifesciences |
References
- Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant. J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
