Summary
Fundamental, aber einzigartigen Eigenschaften der Nager olfaktorische System zu ihrer zunehmenden Studie unter Biologen geführt. Eine relativ einfache Beurteilung ihrer Funktion wird dann benötigt. Hier beschreiben wir sensitive Tests zur Charakterisierung von Maus olfaktorischen Sensibilität und Präferenz.
Abstract
Das Nagetier olfaktorischen System ist von zunehmendem Interesse an Wissenschaftler, studierte, zum Teil in der Systembiologie durch seine stereotype, aber zugängliche Schaltungen. Darüber hinaus macht dieses Gebiet die einzigartige Fähigkeit, neue Nervenzellen in einem Organismus zu Lebzeiten generieren zu einem attraktiven System für Entwicklungs-und regenerative Biologen gleichermaßen. Ein solches Interesse erfordert ein Mittel für eine schnelle und gleichzeitig zuverlässige Beurteilung der olfaktorischen Funktion. Viele Tests von olfaktorischen Fähigkeiten sind komplexe, variable oder nicht speziell für Mäuse entwickelt. Auch sind einige Tests empfindlich auf Gedächtnisstörungen sowie Mängel in olfaktorischen Fähigkeiten, verwirrende erzielten Ergebnisse.
Hier beschreiben wir eine einfache Reihe von Tests entwickelt, um Defekte im olfaktorischen Sensibilität und Präferenz zu identifizieren. Erstens ermöglicht eine erste allgemeine gesundheitliche Bewertung für die Kennzeichnung von Tieren geeignet für weitere Tests. Zweitens sind die Mäuse zu verschiedenen Verdünnungen von Düften ausgesetzt, um festzustellen, ob es einen Schwellenwert Unterschied. Drittens werden die Mäuse mit verschiedenen Düften, sowohl attraktiv als auch aversive, dass für die Beurteilung der olfaktorischen Präferenz ermöglichen vorgestellt. Diese einfachen Studien sollte die erstmalige Beschreibung der olfaktorischen Verhalten zugänglich für Labore verschiedener Ressourcen und Know-how.
Protocol
General Health Exam
Eine umfassendere Behandlung der allgemeinen Gesundheit Prüfungen in ausgezeichneten Verhaltens Jacqueline Crawleys Phänotypisierung Ressource gefunden werden kann, ist, was mit meiner Maus Wrong? 1. Wir ersten Einsatz einer modifizierten Beobachtungsstudien Testbatterie zur allgemeinen Gesundheit des Patienten zu beurteilen. Die Batterie enthält Elemente aus umfassende Beurteilung Samuel Irwins Protokoll 2 schnell zu identifizieren jene Themen, die als ungeeignet für die weitere Erprobung wird. In kurzen, identifiziert die modifizierte Batterie Tiere, die körperlich nicht normal sind (z. B. stark unter-oder übergewichtig, schlecht gepflegt, Dyspnoe) oder weisen abnormale Körperhaltung, Fortbewegung oder Verhaltensweisen. Diese konnten alle Erscheinungsformen der Krankheit sein. Jede erste Auswertung, die ähnlich identifiziert ungesunde Themen angemessen ist.
Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Tiere tierschutzgerecht beide sind während der allgemeinen Gesundheits-Prüfung als auch bei nachfolgenden Tests verwendet. Keine Anästhesie oder Analgesie verwendet wird, wie diese Tests nicht enthalten potenziell schmerzhaften Eingriffen.
Olfaktorische Empfindlichkeit Testing
Dieser Test wurde entwickelt, um einen Unterschied in der olfaktorischen Empfindlichkeit zwischen zwei Gruppen von Mäusen (zB ein Wildtyp und Mutante Gruppe von Tieren) zu erkennen. In diesem Test werden mehrere Verdünnungen eines Duftes aus. Eine naive Tier untersucht dann einer einzigen Verdünnung von diesem Duft und die gesamte explorative Zeit (max. 3 Minuten) wird aufgezeichnet. Mehrere Verdünnungen der Duft auf unterschiedlichen, naive Versuchspersonen getestet und die gesamte explorative Zeit wird verwendet, um Dosis-Wirkungs-Kurven für jede Gruppe von Mäusen zu erzeugen. Zwei Forscher sollten in der Prüfung beteiligt sein, mit einem Blinden zu unterwerfen Genotypen und / oder Zustand.
Primäre Forscher
- Erhalten vier saubere Käfige (8 H x 10 B x 18 L, in cm), alle ohne Betten. Richten Sie die vier Käfige in der Biosicherheitswerkbank.
- Set up Trennwände zwischen jeder Arena mit einer undurchsichtigen Filterpapier. Legen Sie ein schwarzes Plakat Bord über die endgültige Teilung, so dass die schwarze Seite Zeilen der Seite und Boden des Käfigs. Decken Sie die Oberseite der Arena mit einem klaren Stück Plexiglas, damit Licht in die Arena zu beleuchten.
(A)
(B) 
Abbildung 1. Arena Set-Up. (A) Richtig drapiert, leere arena (b) Arena mit dem Betreff und duftende Filterpapier. - Begin Gewöhnung der Probanden. Legen Sie das erste Thema in der ersten Käfig für Gewöhnung. Nach 15 Minuten bewegen das erste Thema auf den zweiten Käfig. Reinigen Sie die erste Käfig mit Quatricide TB. Als nächstes legen Sie das zweite Thema in der ersten, gereinigt Käfig. Setzen Sie diesen Vorgang mit anschließender Themen. Letztlich sollte jeder Gegenstand in allen drei Käfigen, bevor sie in die Arena (vierte und letzte Käfig) für weitere 15 Minuten der Gewöhnung vor der Prüfung gelegt gewöhnt werden.
(B) 
Blinde Forscher
- Machen Sie eine entsprechende Anzahl von 2 Zoll um 2 cm große Quadrate aus Filterpapier für Duftproben.
- Mit den vorab ausgewählten Duft, entsprechend verdünnen. Für hydrophobe Proben wie Erdnussbutter, mit Öl als Lösungsmittel, für alle anderen, destilliertes Wasser verwenden. Vortex.
- Legen Sie eine digitale Video-Aufnahmegerät am anderen Ende der Biosicherheitswerkbank so dass der gesamte Käfig Ende im Fokus ist. Werfen Sie einen vorläufigen Video, um sicherzustellen, Parameter sind ausreichend.
- Notieren Sie die Reihenfolge, in der Verdünnungen getestet werden darauf achten, dass die Reihenfolge der Versuche zufällig.
- Rekord Thema Wurf und Identifikationsnummern.
- Sobald das Motiv für 15 Minuten in der Arena gewöhnt, beginnen Vorbereitung für den ersten Versuch. Pipette die erste Verdünnung nach oben und unten in den konischen Rohr vor dem Pipettieren sie auf ein Filterpapier entfernt. Das Filterpapier Oberfläche sollte optimal ~ 85% fallen (etwa 0,50 ml Lösung). Verwenden Sie einen Kimwipe um sicherzustellen, dass das Filterpapier nicht übermäßig gesättigt.
- Begin Videoaufnahme.
- Legen Sie das Filterpapier Platz im Käfig auf der gegenüberliegenden Seite des Tieres die aktuelle Position.
- Beginnen mit der Zeitmessung.
- Nach 3 Minuten, die Aufnahme zu beenden, und entfernen Sie das verdünnte Duft.
- Wenn nur ein Duft (zB Zimt) getestet werden soll, entfernen Sie die erste Testperson aus der Arena. Wiederholen Sie die Schritte 6-11 für jedes Tier, entsprechend Verdünnen der Duft für jedes Thema. Wenn mehr als ein Duft ist zu prüfen, aber nicht entfernen der Proband aus der Arena. Stattdessen beginnen mit der Zeitmessung.
- Passend zu verdünnen den nächsten Duft mit den gleichen Methoden wie oben aufgeführt.
- Nach 1 Minute beginnen Videoaufnahme. Legen Sie das Filterpapier Quadrat mit der Verdünnung der nächsten Duft in den Käfig auf der gegenüberliegenden Seite des Tieres aktuellen Position.
- Wiederholen Sie die Schritte 6-13 jeden Duft, unter Hinweis auf die Video-Datei-Nummer für jeden Versuch.
- Wiederholen Sie die Schritte 6-14 jedem Thema.
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse für eine Sitzung des olfaktorischen Sensibilität Tests. Jede Maus entweder von der Kontrollgruppe (Gruppe A) oder der experimentellen Gruppe (Gruppe B) wurde zu einem der fünf verschiedenen Verdünnungen von Zimt-Extrakt auf Filterpapier für einen, drei minütigen Sitzung ausgesetzt. Insgesamt benötigte Zeit, erkunden das Filterpapier beurteilt wurde. Mäuse in der Gruppe A haben eine größere olfaktorischen Empfindlichkeit als die in Gruppe B.
Olfaktorische Preference Testing
Dieser Test wurde entwickelt, um spezifische Detektion Mängel, nämlich die Fähigkeit, attraktive oder aversive Gerüche Sinn zu erkennen. Das folgende Verfahren borgt freizügig aus dem Protokoll der Kobayakawa, K., et al.3. Auch hier sollten zwei Forscher in Tests beteiligt sein, mit einem Blinden zu unterwerfen Genotypen und / oder Zustand. Die gesamte explorative Zeit wieder aufgenommen (auf Video-Anzeigen) für verschiedene Düfte. Diese Düfte mit insgesamt explorative mal größer sind als Wasser, als "attraktiv", während die mit Zeiten von weniger als Wasser bezeichnet werden "aversive" bezeichnet. Der Forscher dann untersucht, ob die gleichen Düfte "attraktiv" oder "aversive" für verschiedene Testpersonen werden.
Bitte folgen Sie den Schritten 1-3 in der olfaktorischen Empfindlichkeit Testabschnitt für den primären Forscher.
Blinde Researcher
Das Verfahren für die olfaktorischen Präferenz Test ist der gleiche, mit leichten Modifikationen der Schritte 2 und 4. Bitte befolgen Sie die Schritte 1-15 in der olfaktorischen Empfindlichkeit Testabschnitt für Blinde Forscher, mit folgenden Änderungen: Für Schritt 2 mit den vorher ausgewählten Düften (eine Kombination der beiden attraktiven und aversive Düfte), machen entsprechend verdünnten Lösungen von jedem in konischen Rohren. Für hydrophobe Proben wie Erdnussbutter, mit Öl als Lösungsmittel, für alle anderen, destilliertes Wasser verwenden. Vortex. Für Schritt 4, anstatt die Aufnahme der Verdünnung getestet werden, notieren Sie die Reihenfolge der vielfältigen Düfte, die getestet werden, die zufällige Reihenfolge der Versuche.
Dieser Test wurde entwickelt, um spezifische Detektion Mängel, nämlich die Fähigkeit, attraktive oder aversive Gerüche Sinn zu erkennen. Das folgende Verfahren borgt freizügig aus dem Protokoll der Kobayakawa, K. et al. 3. Auch hier sollten zwei Forscher in Tests beteiligt sein, mit einem Blinden zu unterwerfen Genotypen und / oder Zustand. Die gesamte explorative Zeit wieder aufgenommen (auf Video-Anzeigen) für verschiedene Düfte. Diese Düfte mit insgesamt explorative mal größer sind als Wasser, als "attraktiv" bezeichnet, während diejenigen mit mal weniger als Wasser bezeichnet werden "aversive". Der Forscher dann untersucht, ob die gleichen Düfte "attraktiv" oder "aversive" für verschiedene Testpersonen werden.
Bitte folgen Sie den Schritten 1-3 in der olfaktorischen Empfindlichkeit Testabschnitt für den primären Forscher.
Blinde Researcher
Das Verfahren für die olfaktorischen Präferenz Test ist der gleiche, mit leichten Modifikationen der Schritte 2, 4 und 13. Bitte befolgen Sie die Schritte 1-15 in der olfaktorischen Empfindlichkeit Testabschnitt für Blinde Forscher, mit folgenden Änderungen: Für Schritt 2 mit den vorher ausgewählten Düften (eine Kombination der beiden attraktiven und aversive Düfte), machen entsprechend verdünnten Lösungen von jedem in konischen Rohren. Für hydrophobe Proben wie Erdnussbutter, mit Öl als Lösungsmittel, für alle anderen, destilliertes Wasser verwenden. Vortex. Für Schritt 4, anstatt die Aufnahme der Verdünnung getestet werden, notieren Sie die Reihenfolge der vielfältigen Düfte, die getestet werden, die zufällige Reihenfolge, in jedem Versuch. Für den Schritt 13, place des Filterpapiers Platz mit dem nächsten Duft in den Käfig auf der gegenüberliegenden Seite des Tieres die aktuelle Position.
Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse für eine Sitzung des olfaktorischen Präferenz Tests. Jede Maus wurde zu jedem der verschiedenen Düften auf Filterpapier für einen, drei minütigen Sitzung ausgesetzt. Insgesamt benötigte Zeit, erkunden das Filterpapier beurteilt wurde. Peanut Butter und Vanille sind attraktive Düfte (explorative Zeit Duft> explorative Zeit Wasser) und 2-Methylbuttersäure ist aversive (explorative Zeit Duft <explorative Zeit Wasser).
Scoring der olfaktorischen Tests
Nach dem Erwerb aller der olfaktorischen Sensibilität und Präferenz Videos, ist es notwendig, die gesamte Zeit erkunden jeder Verdünnung / Duft zu analysieren. Haben die blinden Forscherin analysiert alle Videos auf Konsistenz.
- Vorschau video, unter Hinweis auf die folgenden: a) wenn das Filterpapier in die Arena gebracht wird, b) wenn die Maus nähert sich dem Filterpapier, c) wenn die Maus untersucht das Filterpapier und d) wenn 3 Minuten vergangen sind (ab wann der Filter Papier wurde in der Arena). Zu wissen, wann man sich auf das Verhalten der Maus Fokus macht es einfacher, genau Score der gesamten Zeit erkunden bei Durchsicht.
- Überprüfen Sie die Video. Notieren Sie sich die Zeit, wenn der Mauszeiger untersucht das Filterpapier (Latenz).
- Mit einer Stoppuhr, Uhrzeit alle Untersuchungen innerhalb von drei Minuten zu platzieren das Filterpapier in die Arena. Der Zeitpunkt der Untersuchung ist wie jedes Mal, wenn die Maus die Nasenlöcher <1 mm aus dem Filterpapier definiert sind. Es ist wichtig, keine von der Zeit, wenn die Maus in der Nähe des Filterpapier umfassen, ist aber nicht aktiv untersucht es. Verwenden Sie keine Anfälle von Kau-und leckt das Papier oder die Kämpfe des Sitzens auf dem Papier in der gesamten explorativen Zeit. Es ist notwendig, eng und konsequent an diese Regeln genau zu analysieren olfaktorischen Verhalten.
- Rekord Latenzzeit, verbrachte die gesamte Zeit der Untersuchung der Filterpapier-und Video-Datei-Nummer.
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Discussion
Die oben genannten Tests ermöglichen die schnelle und zuverlässige Beurteilung der grundlegenden Riechvermögen. Es ist nicht zu übersehen ist jedoch, dass diese Zuverlässigkeit der richtigen Auswahl und Vorbereitung der Themen für die Prüfung benötigt. Tiere, die krank oder anderweitig behindert sind, sind oft widersprüchlich Probanden. Außerdem ist die Gewöhnung der Probanden Taste. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung von mehreren Käfigen während der Gewöhnung Prozess der Tiere, um sich mit Experimentator Behandlung und wechselnden Umgebungen ermöglicht. Wir haben auch festgestellt, dass die Zeiten kürzer als die für die Gewöhnung angegeben nicht ausreichen, um Angst zu vermindern. Ängstliche Tiere werden auch oft unvorhersehbar Probanden und kann wahre Unterschiede zu verschleiern.
In der eigentlichen Prüfung der Mäuse, ist es wichtig, nicht nur konsequent zu sein beim Erwerb der Daten, sondern auch bei der Analyse der Themen "Verhalten. Wir haben es für sinnvoll, zählen nur die Zeit, wenn der Proband die Nase ist <1 mm aus dem Filterpapier als Teil des gesamten explorativen Zeit. Außerdem werden Verhaltensweisen wie Beißen oder Kauen das Filterpapier nicht in der Gesamtsumme explorative Zeit enthalten. Darüber hinaus können Latenzzeit (für attraktive Düfte) auch ein nützliches Metrik. Verschiedene Mäuse Hintergrund können unterschiedliche Verdünnungen von Düften für eine effektive Unterscheidung zwischen einer Steuer-und experimentelle Gruppe erfordern. Es ist auch wichtig, um Sex-match und Alter-match-Paare. Wir fanden es hilfreich, empirisch ableiten entsprechenden Duft Verdünnungen (zu Themen wie in der Kontrollgruppe), bevor Sie mit der experimentellen Erprobung von naiven Mäusen. Schließlich wurden diese Tests ausgewählt, um die Wirkung anderer kognitiven Beeinträchtigungen, vor allem, Mängel in Lern-und / oder Speicher zu minimieren. Zu diesem Zweck ist es wichtig, naive Mäuse zum Testen verwenden.
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Acknowledgments
Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch ein Stuart HQ & Victoria Quan Promotionsstipendium (RMW), NIH Pioneer Award (RAS) unterstützt
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutyric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | W269506 | Concentrations Used:9.16 x 10-1 – 10-8 M (in H20) |
| Pure Vanilla Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy) | Reagent | Unilever | n/a | Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil |
| Cinnamon Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Mineral Oil, light | Reagent | Fisher Scientific | O121-1 | Concentrations Used:N/A |
References
- Crawley, J. N. What’s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , John Wiley and Sons. 42-60 (2007).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Kobayakawa, K. Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb. Nature. 450, 503-508 (2007).
