Summary
कृंतक घ्राण प्रणाली के मौलिक, अभी तक अद्वितीय गुण जीव के बीच अपनी बढ़ती अध्ययन करने के लिए नेतृत्व किया है. अपने कार्य का एक अपेक्षाकृत सरल आकलन फिर भी जरूरत है. यहाँ हम माउस घ्राण संवेदनशीलता और वरीयता के लक्षण वर्णन के लिए संवेदनशील परीक्षण का वर्णन.
Abstract
कृंतक घ्राण प्रणाली वैज्ञानिकों, अध्ययन के लिए ब्याज में वृद्धि, भाग में, सिस्टम जीवविज्ञान में अपने टकसाली, अभी तक सुलभ circuitry की वजह से की है. इसके अलावा, इस क्षेत्र के अद्वितीय एक जीव के जीवन भर नए न्यूरॉन्स उत्पन्न करने की क्षमता समान विकास और पुनर्योजी जीव के लिए एक आकर्षक प्रणाली बनाता है. इस तरह के ब्याज घ्राण समारोह के एक त्वरित, अभी तक विश्वसनीय मूल्यांकन के लिए एक साधन आवश्यक. घ्राण क्षमता से कई परीक्षण जटिल चर, या विशेष रूप से चूहों के लिए तैयार नहीं हैं. इसके अलावा, कुछ परीक्षण स्मृति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से घाटे घ्राण क्षमता, confounding प्राप्त परिणामों में दोष के प्रति संवेदनशील हैं.
यहाँ, हम सूंघनेवाला संवेदनशीलता और वरीयता में दोष की पहचान करने के लिए डिज़ाइन परीक्षण के एक सरल बैटरी का वर्णन. सबसे पहले, एक प्रारंभिक सामान्य स्वास्थ्य का आकलन है आगे के परीक्षण के लिए उपयुक्त पशुओं की पहचान के लिए अनुमति देता है. दूसरा, चूहों scents के विभिन्न dilutions को उजागर कर रहे हैं पता लगाने के लिए कि क्या वहाँ एक सीमा अंतर है. तीसरा, चूहों विभिन्न scents, दोनों आकर्षक और aversive, कि घ्राण वरीयता के मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं के साथ प्रस्तुत कर रहे हैं. इन सरल अध्ययन घ्राण विभिन्न संसाधनों और विशेषज्ञता के प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ व्यवहार के प्रारंभिक लक्षण वर्णन करना चाहिए.
Protocol
सामान्य स्वास्थ्य परीक्षा
सामान्य स्वास्थ्य परीक्षा के एक अधिक व्यापक उपचार जैकलिन Crawley उत्कृष्ट व्यवहार phenotyping संसाधन में पाया जा सकता है, अपने माउस के साथ क्या गलत है 1? . हम पहली बार एक संशोधित अवलोकन परीक्षण बैटरी का उपयोग करने के लिए इस विषय के सामान्य स्वास्थ्य का आकलन है. बैटरी शमूएल इरविन व्यापक मूल्यांकन 2 प्रोटोकॉल से आइटम करने के लिए जल्दी है कि आगे के परीक्षण के लिए अनुपयुक्त हो जाएगा उन विषयों की पहचान शामिल है. संक्षेप में, संशोधित बैटरी जानवरों कि शारीरिक रूप से असामान्य कर रहे हैं को दिखाता है (eg. गंभीर के तहत या अधिक वजन खराब तैयार, dyspneic) या कि एक्ज़िबिट असामान्य मुद्रा हरकत, या व्यवहार. ये सभी बीमारी की अभिव्यक्ति हो सकता है. कोई प्रारंभिक मूल्यांकन है कि इसी तरह अस्वस्थ विषयों की पहचान उपयुक्त है.
यह भी महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि जानवरों दोनों humanely सामान्य स्वास्थ्य परीक्षा के दौरान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बाद के परीक्षणों के दौरान इस्तेमाल किया जाता है. कोई संज्ञाहरण या analgesia के रूप में इन परीक्षणों को किसी भी संभावित दर्दनाक प्रक्रियाओं को शामिल नहीं करते के लिए प्रयोग किया जाता है.
घ्राण संवेदनशीलता परीक्षण
इस परीक्षण के लिए चूहों के दो समूहों (eg. एक जंगली प्रकार और पशुओं के एक उत्परिवर्ती समूह) के बीच घ्राण संवेदनशीलता में एक फर्क का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है. इस परीक्षण में, एक खुशबू के कई dilutions बना रहे हैं. एक भोले जानवर तो इस गंध और कुल खोजपूर्ण समय (3 मिनट के भीतर) के एक एकल कमजोर पड़ने की जांच दर्ज की है. खुशबू की एकाधिक dilutions अलग है, भोले विषयों पर परीक्षण कर रहे हैं और कुल खोजपूर्ण समय चूहों के प्रत्येक समूह के लिए खुराक प्रतिक्रिया घटता उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. दो शोधकर्ताओं ने परीक्षण में शामिल किया जाना चाहिए एक विषय जीनोटाइप और / या स्थिति के लिए अंधा के साथ.
प्राथमिक शोधकर्ता
- चार स्वच्छ (8 एच x 10 इंच डब्ल्यू एक्स 18 एल,) पिंजरों, बिस्तर बिना प्राप्त करते हैं. जैव सुरक्षा कैबिनेट में चार पिंजरों अप लाइन.
- प्रत्येक अपारदर्शी फिल्टर पेपर का उपयोग क्षेत्र के बीच विभाजन सेट. अंतिम विभाजन भर में एक काला पोस्टर बोर्ड रखें कि इस तरह के काले पक्ष लाइनों पक्ष और पिंजरे के नीचे है. Plexiglass के एक स्पष्ट टुकड़ा के साथ कवर क्षेत्र के शीर्ष करने के लिए प्रकाश क्षेत्र रोशन करने की अनुमति.
(क)
(ख) 
चित्रा 1. एरेना (क) ठीक से लिपटी, (ख) Arena विषय और सुगंधित फिल्टर पेपर के साथ खाली मैदान सेट अप. . - विषयों habituating शुरू करो. Habituation के लिए पहली पिंजरे में पहली विषय रखें. 15 मिनट के बाद, दूसरे पिंजरे पहला विषय चाल है. Quatricide टीबी के साथ पहली पिंजरे साफ. अगला, पहली, साफ पिंजरे में दूसरा विषय जगह है. बाद के विषयों के साथ इस प्रक्रिया को जारी रखें. अंत में, प्रत्येक विषय के habituation की एक और 15 मिनट परीक्षण करने के लिए पहले के लिए क्षेत्र (चौथा और अंतिम पिंजरे) में रखा जा रहा से पहले सभी तीन पिंजरों में आदत होना चाहिए.
(ख) 
ब्लाइंड शोधकर्ता
- गंध के नमूनों के लिए फिल्टर पेपर के 2 इंच वर्गों द्वारा 2 इंच का एक उचित संख्या बनाओ.
- पूर्व - चयनित खुशबू का प्रयोग, उचित यह पतला. मूंगफली का मक्खन जैसे हाइड्रोफोबिक नमूने लिए विलायक के रूप में तेल का उपयोग करें, सभी दूसरों के लिए, आसुत जल का उपयोग करें. भंवर.
- ऐसी है कि पूरे पिंजरे ध्यान में अंत है जैव सुरक्षा कैबिनेट के दूर के अंत में एक डिजिटल वीडियो रिकॉर्डिंग डिवाइस सेट. एक प्रारंभिक वीडियो लो करने के लिए सुनिश्चित करें मापदंडों पर्याप्त हैं.
- आदेश में जो dilutions परीक्षण किया जाएगा, ध्यान लेने के लिए परीक्षण के आदेश randomize रिकार्ड.
- रिकॉर्ड विषय कूड़े और पहचान संख्या.
- एक बार इस विषय क्षेत्र में 15 मिनट के लिए आदी है, पहले परीक्षण के लिए तैयारी शुरू. पहली कमजोर पड़ने विंदुक ऊपर और नीचे यह एक फिल्टर पेपर वर्ग पर pipetting से पहले शंक्वाकार ट्यूब में. फिल्टर पेपर की सतह बेहतर ~ 85% को कवर (0.50 लगभग समाधान के MLS) होना चाहिए. Kimwipe का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि फिल्टर पेपर पीढ़ी संतृप्त नहीं है.
- वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करो.
- जानवर की वर्तमान स्थिति के विपरीत छोर पर पिंजरे में फिल्टर पेपर वर्ग रखें.
- समय शुरू.
- 3 मिनट के बाद, रिकॉर्डिंग बंद करो और पतला खुशबू हटायें.
- यदि केवल एक खुशबू (eg. दालचीनी) परीक्षण किया है, क्षेत्र से पहले विषय की परीक्षा हटा दें. दोहराएँ प्रत्येक जानवर के लिए 6-11 कदम, उचित प्रत्येक विषय के लिए खुशबू गिराए. यदि एक से अधिक खुशबू परीक्षण किया है, तथापि, क्षेत्र से विषय की परीक्षा नहीं निकालूँ. इसके बजाय, समय शुरू करते हैं.
- उचित अगले वही इसके बाद के संस्करण के रूप में सूचीबद्ध तरीकों का उपयोग कर खुशबू पतला.
- 1 मिनट के बाद, वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं. पिंजरे में अगले खुशबू के कमजोर पड़ने के साथ जानवर वर्तमान पदों के विपरीत छोर पर फिल्टर पेपर वर्ग प्लेसएन
- दोहराएँ प्रत्येक खुशबू के लिए 6-13 कदम, प्रत्येक परीक्षण के लिए वीडियो फ़ाइल संख्या टिप्पण.
- दोहराएँ प्रत्येक विषय के लिए 6-14 कदम.
चित्रा 2. सूंघनेवाला संवेदनशीलता परीक्षण के एक सत्र के लिए प्रतिनिधि का परिणाम है. या तो नियंत्रण समूह (ग्रुप A) या प्रायोगिक समूह (ग्रुप बी) से प्रत्येक माउस दालचीनी के पांच अलग dilutions एक, तीन मिनट के सत्र के लिए फिल्टर पेपर पर निकालने के लिए संपर्क किया गया था. कुल समय फिल्टर पेपर मूल्यांकन किया गया था की खोज बिताया. समूह में चूहे एक समूह बी में उन लोगों की तुलना में एक अधिक से अधिक संवेदनशीलता घ्राण है
घ्राण पसंद परीक्षण
यह परीक्षण करने के लिए विशिष्ट पहचान की कमी, अर्थात् आकर्षक या aversive scents भावना की क्षमता की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. निम्न कार्यविधि Kobayakawa के प्रोटोकॉल, के, al.3 एट से उदारतापूर्वक उधार लेता है. फिर, दो शोधकर्ताओं परीक्षण में शामिल किया जाना चाहिए एक विषय जीनोटाइप और / या स्थिति के लिए अंधा के साथ,. कुल खोजपूर्ण समय विभिन्न scents के लिए फिर से दर्ज की गई है (वीडियो देखने पर). कुल खोजपूर्ण बार पानी से अधिक के साथ उन scents के "आकर्षक" जबकि पानी से भी कम समय के साथ उन "aversive" कहा जाता है के रूप में नामित कर रहे हैं. शोधकर्ता तो मानता है कि एक ही scents "आकर्षक" या "aversive" विभिन्न परीक्षण विषयों के लिए कर रहे हैं.
प्राथमिक शोधकर्ता के लिए घ्राण संवेदनशीलता परीक्षण खंड में 1-3 चरणों का पालन करें.
ब्लाइंड शोधक
घ्राण वरीयता के परीक्षण के लिए प्रक्रिया एक ही है, चरण 2 और 4 के मामूली संशोधनों के साथ है. अंधा शोधकर्ता के लिए घ्राण संवेदनशीलता परीक्षण खंड में 1-15 कदम निम्नलिखित परिवर्तन के साथ, का पालन करें: चरण 2 के लिए, पूर्व चयनित scents (दोनों आकर्षक और aversive scents के एक संयोजन) का उपयोग, में प्रत्येक के उचित पतला समाधान करना शंक्वाकार ट्यूबों. मूंगफली का मक्खन जैसे हाइड्रोफोबिक नमूने लिए विलायक के रूप में तेल का उपयोग करें, सभी दूसरों के लिए, आसुत जल का उपयोग करें. भंवर. 4 कदम के लिए परीक्षण किया जा कमजोर पड़ने रिकॉर्डिंग के बजाय, विभिन्न scents कि परीक्षण किया जाएगा के आदेश रिकॉर्ड, परीक्षण के आदेश randomizing.
यह परीक्षण करने के लिए विशिष्ट पहचान की कमी, अर्थात् आकर्षक या aversive scents भावना की क्षमता की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. निम्न कार्यविधि Kobayakawa के.एच., एट अल के प्रोटोकॉल से उदारतापूर्वक उधार 3.. फिर, दो शोधकर्ताओं परीक्षण में शामिल किया जाना चाहिए एक विषय जीनोटाइप और / या स्थिति के लिए अंधा के साथ,. कुल खोजपूर्ण समय विभिन्न scents के लिए फिर से दर्ज की गई है (वीडियो देखने पर). कुल खोजपूर्ण बार पानी से अधिक के साथ उन scents के "आकर्षक" के रूप में नामित कर रहे हैं, जबकि पानी की तुलना में कम समय के साथ उन "aversive" कहा जाता है. शोधकर्ता तो मानता है कि एक ही scents "आकर्षक" या "aversive" विभिन्न परीक्षण विषयों के लिए कर रहे हैं.
प्राथमिक शोधकर्ता के लिए घ्राण संवेदनशीलता परीक्षण खंड में 1-3 चरणों का पालन करें.
ब्लाइंड शोधक
घ्राण वरीयता के परीक्षण के लिए प्रक्रिया एक ही है, चरण 2, 4 और 13 के मामूली संशोधनों के साथ है. अंधा शोधकर्ता के लिए घ्राण संवेदनशीलता परीक्षण खंड में 1-15 कदम निम्नलिखित परिवर्तन के साथ, का पालन करें: चरण 2 के लिए, पूर्व चयनित scents (दोनों आकर्षक और aversive scents के एक संयोजन) का उपयोग, में प्रत्येक के उचित पतला समाधान करना शंक्वाकार ट्यूबों. मूंगफली का मक्खन जैसे हाइड्रोफोबिक नमूने लिए विलायक के रूप में तेल का उपयोग करें, सभी दूसरों के लिए, आसुत जल का उपयोग करें. भंवर. 4 कदम के लिए परीक्षण किया जा कमजोर पड़ने रिकॉर्डिंग के बजाय, विभिन्न scents कि परीक्षण किया जाएगा के आदेश रिकॉर्ड, प्रत्येक परीक्षण में आदेश randomizing. 13 कदम के लिए है, जानवर की वर्तमान स्थिति के विपरीत छोर पर पिंजरे में अगले गंध के साथ फिल्टर पेपर वर्ग जगह है.
चित्रा 3. घ्राण वरीयता परीक्षण के एक सत्र के लिए प्रतिनिधि का परिणाम है. प्रत्येक माउस एक, तीन मिनट के सत्र के लिए फिल्टर पेपर पर विभिन्न scents के प्रत्येक के लिए अवगत कराया गया था. कुल समय फिल्टर पेपर मूल्यांकन किया गया था की खोज बिताया. मूंगफली का मक्खन और वेनिला आकर्षक scents हैं (खोजपूर्ण समय> खुशबू खोजपूर्ण समय पानी) और 2-Methylbutyric एसिड aversive (खोजपूर्ण समय <खुशबू खोजपूर्ण समय पानी).
घ्राण टेस्ट की स्कोरिंग
सूंघनेवाला संवेदनशीलता और वरीयता वीडियो के सभी प्राप्त करने के बाद, यह कुल समय प्रत्येक कमजोर पड़ने / खुशबू की खोज खर्च का विश्लेषण आवश्यक है. अंधा शोधकर्ता स्थिरता के लिए वीडियो के सभी विश्लेषण.
- Vid पूर्वावलोकनeo, निम्नलिखित टिप्पण: एक) जब फिल्टर पेपर क्षेत्र में रखा गया है, ख) जब माउस फिल्टर पेपर, ग दृष्टिकोण) जब माउस फिल्टर पेपर की जांच और घ) जब तीन मिनट बीता है (फिल्टर जब कागज क्षेत्र में रखा गया था). जानने जब माउस के व्यवहार पर ध्यान केंद्रित करने के लिए यह आसान सही समीक्षा पर तलाश खर्च कुल समय स्कोर करने के लिए बनाता है.
- वीडियो की समीक्षा करें. समय जब माउस पहले फिल्टर पेपर (विलंबता) की जांच पर ध्यान दें.
- एक स्टॉपवॉच समय, क्षेत्र में फिल्टर पेपर रखने के तीन मिनट के भीतर सभी जांच का उपयोग करना. जांच के समय किसी भी समय जब माउस nares <फिल्टर पेपर से 1 मिमी के रूप में परिभाषित किया गया है. यह महत्वपूर्ण है के लिए समय जब माउस फिल्टर पेपर के लिए करीब निकटता में है किसी भी शामिल नहीं है, लेकिन यह सक्रिय नहीं जांच. चबाने और चाट कागज या कुल खोजपूर्ण समय में कागज पर बैठे के मुकाबलों के bouts शामिल नहीं है. इन नियमों को बारीकी से और लगातार पालन करने के लिए सही घ्राण व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है.
- कीर्तिमान विलंबता समय, कुल समय फिल्टर पेपर और वीडियो फ़ाइल नंबर की जांच बिताया.
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Discussion
aforementioned परीक्षणों जल्दी और विश्वसनीय बुनियादी घ्राण समारोह के मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं. यह नहीं अनदेखी की है, तथापि, कि इस विश्वसनीयता उचित और परीक्षण के लिए विषयों के चयन की तैयारी की आवश्यकता है. पशु है कि बीमार या अन्यथा अक्षम कर रहे हैं अक्सर असंगत परीक्षण विषयों. इसके अलावा, परीक्षण विषयों के आदी होना कुंजी है. हमने पाया है कि habituation प्रक्रिया के दौरान कई पिंजरों का उपयोग पशुओं experimenter हैंडलिंग और परिवेश बदलने के साथ सहज बनने के लिए अनुमति देता है. हम यह भी पाया है कि habituation के लिए संकेत दिया उन लोगों की तुलना में कम समय के लिए चिंता को कम करने के लिए पर्याप्त नहीं हैं. चिन्तित जानवरों को भी अक्सर अप्रत्याशित परीक्षण विषयों और सच मतभेद अस्पष्ट कर सकते हैं.
चूहों के वास्तविक परीक्षण में, यह न केवल अनुरूप हो जब डेटा प्राप्त है, लेकिन विषयों 'के व्यवहार का विश्लेषण करने में भी महत्वपूर्ण है. हम यह उपयोगी केवल उस समय गिनती जब परीक्षण विषय की नाक <कुल खोजपूर्ण समय के भाग के रूप में फिल्टर पेपर से 1 मिमी है पाया है. इसके अलावा, काटने या चबाने फिल्टर पेपर के रूप में इस तरह के व्यवहार कुल खोजपूर्ण समय में शामिल नहीं हैं. इसके अलावा, विलंबता समय (आकर्षक scents के लिए) भी एक उपयोगी मीट्रिक जा सकता है. विभिन्न चूहों पृष्ठभूमि एक नियंत्रण और प्रायोगिक समूह के बीच प्रभावी भेदभाव के लिए scents के विभिन्न dilutions की आवश्यकता हो सकती है. यह भी सेक्स मैच और उम्र मैच - जोड़े के लिए महत्वपूर्ण है. हम इसे उपयोगी पाया empirically भोले चूहों के प्रायोगिक परीक्षण के साथ आगे बढ़ने से पहले उचित खुशबू dilutions (नियंत्रण समूह के लिए इसी तरह के विषयों पर) प्राप्त. अंत में, इन परीक्षणों के किसी भी अन्य संज्ञानात्मक impairments, सबसे विशेष रूप से, सीखने और / या स्मृति में दोष के प्रभाव को कम करने के लिए चुना गया. कि अंत करने के लिए, यह परीक्षण के लिए भोले चूहों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.
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Acknowledgments
अनुदान: यह काम एक स्टुअर्ट मुख्यालय विक्टोरिया क्वान predoctoral फैलोशिप (RMW), एनआईएच पायनियर पुरस्कार (आरएएस) के द्वारा समर्थित किया गया था
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutyric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | W269506 | Concentrations Used:9.16 x 10-1 – 10-8 M (in H20) |
| Pure Vanilla Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy) | Reagent | Unilever | n/a | Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil |
| Cinnamon Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Mineral Oil, light | Reagent | Fisher Scientific | O121-1 | Concentrations Used:N/A |
References
- Crawley, J. N. What’s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , John Wiley and Sons. 42-60 (2007).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Kobayakawa, K. Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb. Nature. 450, 503-508 (2007).
