Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

דם אוסף של סרטן הפרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס

Published: October 13, 2008 doi: 10.3791/958
Automatic Translation
1,2, 3
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Davis, 2Marine Biological Laboratory - MBL- woods hole, 3Department of Biological Sciences, Hunter College of CUNY

Summary

סרטן פרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס, הוא לטעון את המקור הנוח ביותר עבור כמויות גדולות של דם של חסרי חוליות כלשהו. דם היא פשוטה בהרכב, כאשר רק סוג תא אחד במחזור כללי, amebocyte פרטנית, ורק שלושה חלבונים בשפע בפלסמה, hemocyanin, C-reactive חלבונים, α2-macroglobulin. הדם נאסף מן הלב ותאי דם פלזמה מופרדים על ידי צנטריפוגה.

Abstract

סרטן פרסה יש את המערכת החיסונית ביותר מאופיין של חסרי חוליות חיים ארוכים כל. המחקר של חסינות סרטני הפרסה כבר בהנחייתם של הקלות באיסוף כמויות גדולות של דם מן הפשטות של הדם. סרטנים Horseshoe להציג רק סוג תא בודד במחזור כללי, amebocyte פרטנית. פלזמה יש את מליחות מי הים ורק שלושה חלבונים בשפע, hemocyanin, החלבון הנשימה, C-reactive חלבונים, אשר לתפקד חורבן cytolytic של תאים זרים, כולל תאים חיידקיים, ו-α2 macroglobulin, אשר מעכב את פרוטאזות של פתוגנים הפולשים. הדם נאסף על ידי לנקב לב ישיר בתנאים למזער את הזיהום על ידי lipopolysaccharide (רעלן פנימי aka, LPS), תוצר של חיידקים גראם שליליים. חיה גדולה יכולה להניב 200-400 מ"ל של דם. לצורך המחקר של הפלזמה, כדוריות דם יוסרו באופן מיידי על ידי צנטריפוגה מ פלזמה ו הפלזמה אז יכול להיות מופרדים לחלבונים המרכיבים אותה. בתאי הדם נלמדים בנוחות במיקרוסקופ על ידי איסוף כמויות קטנות של דם לתוך מלוחים LPS-free איזוטוני (0.5 M NaCl) בתנאים המאפשרים בדיקה מיקרוסקופית ישירה על ידי הצבת אחד יותר LPS-free coverglasses על פני צלחת תרבות, אז גובר אלה coverglasses בתאי תצפית פשוטה הבאה מצורף התא. הכנה שנייה תצפית ישירה היא לאסוף 3-5 מ"ל של דם בכלי LPS ללא עובר ואז explanting שברי amebocytes מצטברים לחדר כי כריכים הרקמה בין השקופיות לבין coverglass. בהכנה זו, amebocytes ניעתי נודדים על פני השטח coverglass, שבו הם יכולים בקלות להיות שנצפו. מערכת קרישת הדם כרוכה צבירה של amebocytes ואת היווצרות קריש תאית של חלבון, coagulin, אשר שוחרר מן גרגרי הפרשה של כדוריות הדם. אנליזה ביוכימית של כדוריות דם שטף מחייבת צבירה degranulation אינה מתרחשת, אשר יכול להתבצע על ידי איסוף דם לתוך 0.1 כרכים של 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, M ואחריו צנטריפוגה של התאים כביסה עם 0.5 NaCl.

Protocol

תכונות אנטומיות של הסרטן פרסה רלוונטי דימום (איור 1)

איור 1

איור 1

  1. שלוש החטיבות העיקריות של הגוף, מן הקדמי אל האחורי, הם prosoma (P), opisthosoma (O), ואת telson (ט) 1.
  2. שולי חינם קדמית לרוחב של prosoma הוא מקורבות.
  3. הכניסה האחורי ביותר של opisthosoma, שם telson מבטאת, הוא מסוף המפרץ.
  4. המפרק שבו prosoma ואת opisthosoma לבטא הוא ציר (H).
  5. הלב ממוקם לאורך קו האמצע הגב, ממש מתחת שריון של prostoma ו opisthosoma 2 (איור 2).


    איור 2

    איור 2

שיקולים כלליים, עקרות והגנה מפני חשיפה lipopolysaccharide (רעלן פנימי)

  1. האויב העיקרי של לדמם מוצלח הוא clumping התא, exocytosis, היווצרות של קריש coagulin. צבירת תאים exocytosis מומרץ ע"י lipopolysaccharide (רעלן פנימי aka, LPS), תוצר של חיידקים גראם שליליים. ריכוז הסף של LPS עבור exocytosis עבור תאים שטף הוא 0.1-1 מ"ג / מ"ל אבל התאים המרחפים פלזמה מופעלים על ידי ריכוזים נמוכים משמעותית 3. רעלן פנימי אינו מומת על ידי מעוקר פשוטה ניתן להניח להיות נוכח על משטחים ועל פתרונות ריאגנטים שאינם מוסמכים להיות רעלן פנימי חינם.
  2. כדי להקטין את הסיכויים של קרישת במהלך איסוף הדם, בחר מושלמת רק, בעלי חיים ניזוק על הדימום. טרום צמרמורת החיות 1-2 שעות בחדר 4 מעלות צלזיוס. תרגול טכניקה סטרילית. הימנע זיהום עם רעלן פנימי.
  3. LPS ללא מלח 3% משמש ברפואה קלינית ניתן לרכוש מהספקים רפואי (ראה טבלה של חומרים כימיים וציוד המקצועית). LPS ניתן להסיר זכוכית ומתכת על ידי הדגירה ב 180 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. סטרילי לשימוש חד פעמי מזרק מחטים, פטרי מנות בסגנון התרבות, בורג מכסה צינורות צנטריפוגה כל LPS חופשי וניתן להשתמש בו ללא שינוי כל עוד טכניקה סטרילית ראוי הוא התאמן.
  4. היציבות של כדוריות דם של חיות שונות שונה, עם תאים של כמה חיות אדם עובר degranulation ספונטנית, וכתוצאה מכך היווצרות של קריש coagulin, גם כאשר החיה הוא דימם בקפידה רבה. כדוריות הדם של סרטנים אחרים פרסה הפרט באופן משמעותי יציב יותר, כאשר הנהלים המתאימים אחריו, נותרים גרגרי במלואה במהלך הדימום הפרדת תאים פלזמה.
  5. סוכנים אחדים דווחו לייצב את כדוריות הדם בעקבות דימום, כולל קפאין (לדמם לתוך 0.25 כרכים של קפאין 10 מ"מ LPS-free NaCl 3%) 4, propranolol (1 mM הריכוז הסופי) 5, 6 dimethylsulfoxide, קלאציה קטיון divalent ( לדמם לתוך נפח שווה של 0.1 M דקסטרוז, 0.03 מ 'ציטרט הנתרן, 0.026 M חומצת לימון, 10 mM disodium ethylenediaminetetraacetic חומצה (Na 2 EDTA), pH 4.6) 7, מעכבי חלבון-G ו-C phospholipase מסלולים (כולרה pertussus רעלים, U73122) 8, החלפה של כלוריד עם אניון isethionate 9, ערוץ כלוריד חוסמי 9, מחזורית-AMP היריבים 9, ריאגנטים sulfhydryl (5 N-אתיל mM maleimide, Nem) 5, ואת קרום פעיל דטרגנט Tween-20 ( לדמם לתוך 0.1% בנפח 2 Tween-20 ב LPS ללא 0.5 M NaCl).

ספקי ו ריאגנטים עבור הדימום סרטן פרסה: אוסף של כמויות גדולות של דם

  1. אחד או יותר סרטנים גדולים, פרסה ניזוק
  2. להשפריץ בקבוק המכיל 70% אתנול
  3. Kimwipes
  4. 14 מחט מד
  5. חסון מלקחיים
  6. קרח בדלי עם קרח
  7. 50 מ"ל בורג מכסה פלסטיק חד פעמיות צנטריפוגות מבחנות
  8. מדף כדי להחזיק את הצינורות 50 מ"ל
  9. נגד העליון צנטריפוגות
  10. סטרילי 50 מ"ל pipettes סרולוגיות
  11. נורה מסוג פיפטה מלוי
  12. הפנויה מנגנון סינון סטרילי
  13. משאבת ואקום
  14. LPS ללא פתרון NaCl 3% (עבור אוסף של כדוריות הדם)
  15. Tween-20 (לאיסוף כדוריות הדם)

ההכנות דימום גדול בנפח

  1. לגבי הדימום, להשתמש גדולים, בעלי חיים ניזוק. החיה צ'יל עבור h 1 בחדר קר לפני הדימום.
  2. הקמת סידור נוח עם תמיכה יציבה עבור דלי קרח זה על 0.3 מטר (מכולה חד פעמי קלקר לדיוור ריאגנטים קר או קפוא מתאים) ואת כיסא נמוך למפעיל. דלי קרח ממוקם על מבנה תמיכה הכסא נמשךעד יחידה זו. אתה צריך להיות ישיבה נוחה במשך תקופה ארוכה על הכיסא עם המרפקים נחים על הירכיים, ועם יד שמאל אוחזת סרטן פרסה נאבקים ממוצבת מעל אוסף צינורות דם נשען זקוף על מצע של קרח בדלי קרח.
  3. טרום צמרמורת 4-6 של 50 מ"ל פלסטיק חד פעמיות צינורות צנטריפוגה עם סגירת בורג באמבט קרח. צינורות נקבעים זקוף הקרח נע סביב היקף של מיכל אמבט קרח. בדיוק לפני תחילת המבצע דימום, להסיר את כובעי מן צינורות כמוסות מקום על השולחן הסמוך, דבקות בטכניקה סטרילית.
  4. הסר את המכסה של מחט ga 14 ולהשתמש מלקחיים חסון לשחרר את המחט השרוול שלה, אבל אין להסיר מחט מן השרוול. לשמור על סטריליות. אין לגעת באף חלק של המחט עם האצבעות. שרוול מקום עם מחט על הדלפק הסמוך בקת חשוף של המחט גבוהות מכל מגע עם משטח כלשהו כדי לשמור על סטריליות שלה.
  5. לחלח Kimwipe עם אתנול 70%.

דימום החי (במיוחד עבור מפעיל ימניים)

  1. החזקת בעלי חיים לדימום: חיה לתפוס ביד שמאל עם ארבע אצבעות במגע עם מקורבות הקדמי של prosoma ואת האגודל תופס את החלק האחורי של opisthosma בבסיס הזנב (מסוף המפרץ). המשטח הגחון של החיה פנים כף היד שלך. Telson שוכנת לאורך בסיס האגודל פרויקטים על כף היד. להגמיש את החיה בעדינות כך prosoma ו opisthosoma הם בזוויות ישרות זה לזה (איור 3a).

    איור 3

    איור 3

  2. נקה prosoma החשוף משותף ציר חיבור opisthosoma עם אתנול 70% להחיל עם אתנול, לחלח Kimwipe (איור 3 ב).
  3. סובב את יד שמאל כך אצבעות 2-4 הם העליון לבין השטח הגבי של החיה פונה כלפי מעלה. עם יד ימין, להכניס את מחט המזרק 14 ga, עדיין שרוול המגן שלה, בין אצבעות 2 ו -3 של יד שמאל. קח את מלקחיים ביד ימין ולהסיר את המחט מן השרוול המגן שלה על ידי לתפוס את התחת עם מלקחיים (איור 3c). סובב את יד שמאל, כך פני השטח הגבי של היד פונה אל אגודל שמאל, לאצבע הם למעלה, בעל החיים הוא הפוך, עם פני השטח הגבי שלה מול יד ימין. מקם את התחת של המחט מעל הראשון של אוסף 50 מ"ל ו צינורות המזרח חיה כך את הקצה החד של המחט הוא הצביע על הציר המשותף כך פיר מחט מקביל לקו האמצע הגבי (איור 3d). הכנס את הקצה החד של המחט דרך משותפת הציר לתוך לומן של הלב, שמירה המחט ממוקם במקביל לקו האמצע הגבי ונוסף על קו האמצע עם הקת של המחט עדיין ממוצבת מעל פתיחת צינור האיסוף. המחט מוחדרת על 1-2 ס"מ עמוק לתוך החלק של הלב ב prosoma. ברגע הלב הוא ניקב, הדם יזרום במהירות (איור 4 א, חץ), ולכן חשוב להבטיח כי בסוף המסירה של מחט מזרק ממוקם מעל הפה של הצינור כדי לאסוף אוסף זה נחשול של דם ראשוני.
  4. דם תצא הלב בהתחלה בזרם מתמשך, לאחר כ - 30-50 מ"ל של דם נאספו, יהיה איטי טיפות בודדות (איור 4 ב). כדי לשפר את זרימת הדם, זה עשוי להיות מדיניות טובה קצה מחדש להתמצא של המחט מעט. הטה את המחט למעלה או למטה, שמאלה או ימינה; שקופיות קצהו עמוק לתוך הלב, או למשוך אותו קרוב יותר ציר משותף כדי למצוא את המיקום אשר מייעל את זרימת הדם. אין לדחוס את החיה בצורה מוגזמת, כי הסיכונים זו פגיעה בבעלי חיים עלולה לגרום דם extravasated ליזום קרישת.

    איור 4

    איור 4

  5. כמו כל צינור האיסוף מתמלא בדם, לסובב את אמבט קרח כדי להביא את שפופרת ריק מתחת הבא סוף מסירה של המחט.
  6. כמו דימום מאט, אתה מפעיל את הסיכון שיש זרימת אוויר בכיוון נסוג לתוך מחט אל תוך הלב. זה יכול להתרחש כאשר החיה מתיישר, ובכך להפחית את לחץ הדם. נסו למנוע זאת על ידי שמירה על בעלי חיים במצב מכווצת או על ידי מתן יישור להתרחש רק לאט.
  7. כאשר בעל החיים מפסיק לתת דם, להוציא את המחט דימום מהלב. Re-כובע אוסף צינורות צנטריפוגה מיד בצנטריפוגה שולחן העליון, 1000 סל"ד, 5 דקות. כדוריות הדם יהוו כדורי קומפקטי בקצה התחתון של הצינורות האוסף. בגלל כל הרכיבים עבור קרישת הדם נמצאים בתוך שלפוחיות הפרשה של כדוריות הדם, ברגע פלזמה מופרד תאים,הסיכון של קרישת הפלזמה מסולק.
  8. זה הכרחי כדי למנוע קרישת הדם extravasated. הצעדים הבאים להפחית את הסיכון של קרישת: טרום מצמרר החי ושמירה על צינורות אוסף באמבט קרח; טיפול עדין של החיה: הפחתת המהירות שבה הדם זורם מתוך מחט מזרק; צנטריפוגה הדם מיד לאחר איסוף: הימנעות זיהום של מחטים וצינורות אוסף עם רעלן פנימי; ותחזוקה של הליך סטרילי. כפי שהוזכר לעיל, כמה חיות אדם יש כדוריות דם עצבני במיוחד ליזום exocytosis גם כאשר אלה הם אמצעי הזהירות אחריו.
  9. לאחר צנטריפוגה, לבדוק את הצינורות סימנים של קרישת דם - גדילי של תאים חומר קריש ג'לטיני מחוברים לקירות של הצינור, חומר ג'לטיני, בחלק העליון של קריש דם, או, גרוע מכך, כמויות גדולות של קריש דם עם כדוריות דם וממולכד נוזל עמוד (איור 4c, חץ). חומר הצינורות האלה הוא נסיוב, לא פלסמה, והוא מכיל את המוצרים המופרש מתאי דם.
  10. מעבירים את הפלזמה אל צינורות סטרילי עם פיפטה 50 מ"ל סרולוגיות סטרילית. נקוט משנה זהירות בעת pipetting להימנע aspirating כל התאים מן גלולה התא התחתון של הצינור. עדיף להשאיר כמה מ"ל של פלסמה מעל גלולה להימנע מטריד התא גלולה.
  11. ההליך המתואר לעיל נועד כדי לאסוף כמויות גדולות של פלסמה נוגעו המוצרים הפרשה של כדוריות הדם. כדי לאסוף כמויות גדולות של כדוריות דם שטף, לאסוף את הדם לתוך 0.1 כרכים של 2% Tween-20 מומסים בתמיסה LPS-free 3% NaCl. צנטריפוגה התאים בעדינות במשך 10 דקות להקים תא גלולה משוחרר, ולאחר מכן לשטוף את התאים עם כמה שינויים של LPS-free NaCl 3%. תמצית של תאים המכיל את המוצרים הפרשה של כדוריות דם יכול להיות מוכן על ידי lysing התאים נשטף במים מזוקקים LPS-free. Lysate זו מכילה מערך מגוון של חלבונים ופפטידים הפועלים הגנה אנטי מיקרוביאליים החיסון 10,11 ו מכיל גם coagulogen, הטופס אב תסס של החלבון המבני של קריש דם תאיים, ואת אוסף של פרוטאזות כי כדי להמיר coagulogen coagulin, הצורה של החלבון כי polymerizes לתוך הסיבים של 12 קריש. תמצית זו דומה למוצר זמין מסחרית, Limulus amebocyte lysate או לאל, אשר משמש assay נוכחות של lipopolysaccharide 13. מפל פרוטאז אחראים שינוי פרוטאוליטי של coagulogen כדי coagulin מופעל על ידי LPS 14.
  12. Disposition של בעלי חיים לאחר הדימום. דימום שנערך על ידי שיטות זיהו לעיל הוא נסבל היטב על ידי החיה. כאשר עובד המעבדה לביולוגיה ימית בוודס הול, אני חוזר חיות לאוקיינוס ​​לאחר דימום תוך ציפייה כי הם יוכלו לשרוד. אם בעלי החיים נשמרים באקווריום רחוקים בטווח הנורמלי של סרטני פרסה, הם יכולים להיות דימם שוב ושוב פעם או פעמיים בחודש. כפי שיפורטו להלן, חיות שמרו בשבי דורשים מים באיכות גבוהה האכלה תכופה כדי לשמור על בריאותם. המתת חסד יכול להתבצע על ידי הרס של הגנגליון הגבי, אשר ממוקם קו האמצע הגבי בין העיניים.

עיבוד ואחסון של פלזמה

  1. הגנה מפני פרוטאזות. אם הפלזמה היא לשמש לטיהור חלבון, זה צריך להיות מטופלים עם מעכבי פרוטאז מיד לאחר האיסוף. הוסף phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) לריכוז סופי של 1 מ"מ. PMSF נשמר כפתרון M 0.1 DMSO המניות או אתנול. הוא יציב למדי מים 15, כך שלא ניתן לסמוך על הגנה מתמשכת, אך בנוסף מיד לאחר הפרדת פלזמה מתאי דם יהיה להשבית את כמויות קטנות של פרוטאזות שאולי שוחרר מן התאים.
  2. סינון סטרילי: לעקר את הפלזמה על ידי ultrafiltration תחת ואקום באמצעות מכשיר חד פעמי בינוני סינון מצויד במסנן נקבוביות 0.22 מ"מ. מסננים אלה יש נטייה להיסתם. מומלץ צנטריפוגות פלזמה לפני סינון כדי להפחית את הבעיה הזו. אם כמויות גדולות של פלסמה מעובדים, רצוי לסנן מראש את הפלזמה הראשון באמצעות מסנן Millipore עם נקבוביות בגודל 1 מ"מ, אז עם 0.45 מ"מ גודל הנקבוביות Millipore הסינון.
  3. פלזמה יכול להיות מוגן מפני זיהום חיידקי או על ידי הוספת NaN 3 לריכוז סופי של 0.2 מ"ג / מ"ל או על ידי סינון סטרילי. Unsterile פלזמה לא צריך להיות מאוחסן לפרקי זמן ארוכים יותר מ 2 ימים בלי אחד מהשניים האלה אנטי בקטריאלי האמצעים הננקטים.
  4. קרישת הדם. שלא כמו במערכת קרישת יונקים, פלזמה Limulus אינו מכיל את האלמנטים של קרישת הדם. במקום זאת, המנגנון כולו היווצרות קריש דם, החלבון המבני של הקריש (coagulogen) ומערכת של פרוטאזות כי תהליך coagulogen כדי להבהיר את זה מסוגל polymerizing לתוך הקריש מסיסים, נמצא את גרגרי הפרשה של כדוריות הדם 16. אז אם את כדוריות הדם יוסרו לפני שיהיה להם סיכוי לעבור exocytosis, הפלזמה חופשי לחלוטין של חלבונים עבור קרישת יישאר נוזל ללא הגבלת זמן.
  5. חלבון טיהור. Hemocyanin נוכח 40 מ"ג / מ"ל ​​בפלסמה היא 48-mer של למקטע 70 kDa. זה יכול להיות מבודד על ידי ultracentrifugation (40,000 X גרם, 8 שעות) או סינון ג'ל עם שרף הדרה גדול גודל הנקבוביות כגון BioGel A5m 17. C-reactive חלבונים נוכחים 1-5 מ"ג / מ"ל ו - יכול להיות מבודד על ידי בידוד זיקה על phosphorylethanolamine-Sepharose, עם elution עם chelator סידן 18. מעכבי פרוטאז ספקטרום רחב, 2-macroglogulin, טוהרו באמצעות סינון ג'ל על Sephacryl S-300 שרף לאחר hemocyanin ואת C-reactive חלבונים הוסרו 19.

בבדיקה מיקרוסקופית של כדוריות הדם ניעתי בתרבות

  1. הקמת מדשאות amebocyte במבחנה: LPS ללא פתרון 3% NaCl מתווסף סטרילי פטרי מנות בסגנון פלסטיק תרבות (1 מ"ל למנה 35 מ"מ, 2.5 מ"ל למנה 60 מ"מ, 6 מ"ל למנה 90 מ"ל). הדם מתקבל אז לנקב לב בשיטת שתוארו לעיל, אך עם השינוי, כי מד 23, 1 ב מחט מזרק סטרילי משמש במקום מחט מד 14. דם זורם טיפה אחר טיפה של מחט מד 23 ו 1 טיפה נאסף לתוך צלחת 35 מ"מ, 3 טיפות לתוך צלחת 60 מ"מ, 9 טיפות לתוך צלחת 100 מ"מ. בתאי הדם מעורבבים באופן אחיד אז בפתרון NaCl 3% על ידי עדינה מתערבל, תחילה דפוס חוזר, ואז חזרה-and-הלאה. ההכנה היא מודגרות דקות 5 ב T החדר כדי לאפשר כדוריות דם לצרף אל פני השטח את המנה, ואז מלוחים הראשונית מוחלף חיץ של בחירה 3.
  2. אם הוא הרצוי כדי לשמור על תשתית המצורפת כדוריות הדם במצב undegranulated, תערובת הראשונית מלוחים דם פלזמה מוחלף LPS-free טרי NaCl 3%. פלזמה מאיץ את degranulation ספונטנית של כדוריות הדם גם בהעדר של LPS, והסרה שלה מייצב את המדינה undegranulated של התאים.
  3. אם מלוחים הראשונית מוחלף פלזמה סטרילית, את כדוריות הדם להפוך מהצורה הסגלגלה של תא דם במחזור (איור 5) ולשטח על גבי תשתית, ולאחר מכן ליזום degranulation ויצירת שכבת הקריש coagulin תאי דם מעל הדשא של amebocytes שטוח 20.

    איור 5

    איור 5

  4. הקמת תרבויות explant של amebocytes מצטברים. כאשר הדם נאסף תחת סטרילי, LPS ללא תנאי, את כדוריות הדם ולהתיישב מן המתלים המצטברים כדי ליצור מסה רקמה דמוית. מיכל נוח זה עובר צלחת זכוכית שניתנו LPS-free ידי הדגירה של 4 שעות ב 180 0 C. הדם נאסף במיכל זה על ידי לנקב לב באמצעות מחט מד 19 הוא מודגרות עבור 1-2 שעות ב T החדר, ואז חתיכות 1 מ"מ מרובע נחתכים מן במצטבר amebocyte עם מחט מזרק סטרילי 18 מד והם דחוקה בין שתי coverglasses או coverglass ו שקופיות מופרדות שברי coverglasses לשמש מפרידי. לאחר כחצי שעה, amebocytes להתחיל נודדות מהפריפריה של explant על ​​coverglass (איור 6 א), שם ניתן לצפות עם ניגודיות שלב או אופטיקה DIC 21. בתחילה, הם תאים נודדים קומפקטי עם hyaline pseudopods (איור 6 ב (מ)), כי הם המורחבת מעל תשתית ההגירה, וכי לאחר מכן הם הוריד במגע עם המשטח תנועה קדימה כרוך בזרימת הציטופלסמה פרטנית לתוך 22 מדומה . מאוחר יותר, התאים לשטח (איור 6 ב (ו)) וליזום degranulation (איור 6 ב (ד)) לבין הפסקת תנועה 23. חדר תרבות המתואר כאן מאפשר זלוף של סוכני ניסויים שונים לתא תרבות לחקור את השפעתם על תנועתיות התא exocytosis גרגיר 9. סקירה מתודולוגית המורחבת של התרבות amebocyte לבדיקה מיקרוסקופית ניתן למצוא 24.

    איור 6

    איור 6

תחזוקה של סרטנים פרסה מבוגר באקווריום

סרטנים Horseshoe דורשים מים גבוה ים באיכות יכול להישמר באקווריום מצויד במערכת טיהור מים המספק סינון חלקיקים, אוורור, ו denitrification המים 25. בעלי חיים צריכים להיות מוזן 2 או 3 פעמים בשבוע על שרימפס, לובסטר, דג או דיונון. האכלה מושגת על ידי הסרת חיה מן האקווריום, PLAcing אותו על הגב שלה, הצבת מזון על פיה. אם רעבים, החיה יתחיל בקרוב בליעת המזון. בהתאם התחכום של מערכת מי הים, החיה צריך להישמר במשך כשעה עד שהוא עושה את צרכיו מיכל נפרד של מי ים או שזה יכול להיות שב באקווריום לאחר ההנקה החלה. עבור אחזקה לטווח ארוך, בעל החיים צריך להישמר מן האור כדי למנוע את צמיחת אצות ירוקות או כחולות ירוקות על פני השטח של שריון. אצות לשחוק את שריון ומאז מבוגר אינו הנשירה, זה יגרום למוות החיה 26. בטבע, בעלי חיים מבלים רוב הזמן קבור בחלקו בחול, אבל חול או חצץ באקווריום מציג קושי לשמור על רמת ניקיון ותחזוקה חשוב לטווח הארוך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם ארבעה מינים של סרטנים פרסה, פוליפמוס Limulus מן החוף המזרחי של צפון אמריקה שלושת המינים נע בין יפן מפרץ בנגל. החיה מזוהה "מאובן חי" בגלל צורות דומות מבחינה אנטומית נמצאו מאובנים כמו 445,000,000 שנים 27. סרטן פרסה מייצג חיה חיים ארוכים, הדורשים 10-13 שנים כדי להגיע לבגרות חיים לפחות 20 שנים 28. אמנם זה כבר נתון נרחב קצירת כפיתיון צלופח ועל דיג קונכיה 29, פרסה את הסרטן האמריקאי עדיין בשפע סביר ומאפשר אוסף בלתי הרסניות של 50 מ"ל של דם מבוגר קטן כמו 400 מ"ל מתוך הנקבה גדולה. איסוף דם זה אפילו הרבה יותר ניתן להשלים בתוך פחות מ 10 דקות. אני יודע של חסרי חוליות לא זמינים אחרים מאפשר כל כך הרבה דם במאמץ מועט כל כך.

חשיבותה של הבדיקה LAL עבור רעלן פנימי, אינדיקטור לנוכחות של חיידקים גראם שליליים, עורר עניין במערכת החיסונית של הסרטן פרסה 13. בדיקת LAL תלוי ההפעלה של פרוטאז ייזום של מערכת קרישת הדם על ידי LPS 14, עם קריאה מתוך היווצרות קריש דם או של assay colorimetric לפעילות פרוטאז. שני אלמנטים של חסינות כי קיבלו את מירב תשומת הלב היו החלבונים של הפלזמה ועל כמה חלבונים ופפטידים של גרגרי הפרשה של כדוריות הדם. התוצאה הייתה העלאת הסרטן פרסה למעמד של צורך ביותר תיאר מערכת החיסון של חסרי חוליות חיים ארוכים כל 11

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

מחקר מקורי שתוארו לעיל נתמך על ידי NSF מענק 0344630.

References

  1. Lochhead, J. H. Selected Invertebrate Types. Brown, F. A. , John Wiley and Sons, Inc. New York, NY. 360-381 (1950).
  2. Shuster, C. N. The circulatory system and blood of the horseshoe crab Limulus polyphemus L.: a review. US Dept Energy, Fed Regul. Comm. , Washington. (1978).
  3. Conrad, M. L., Pardy, R. L., Wainwright, N., Child, A., Armstrong, P. B. Response of the blood clotting system of the American horseshoe crab, Limulus polyphemus, to a novel form of lipopolysaccharide from a green alga. Comp Biochem. Physiol A Mol. Integr. Physiol. , 144-423 (2006).
  4. Nakamura, T., Morita, T., Iwanaga, S. Intracellular proclotting enzyme in limulus (Tachypleus tridentatus) hemocytes: its purification and properties. J. Biochem. (Tokyo. 97, 1561-1574 (1985).
  5. Levin, J., Ornberg, R. L. Blood Cells of Marine Invertebrates: Experimental Systems in Cell Biology and Comparative Physiology. Cohen, W. D. , Alan R. Liss, Inc.. New York, NY. 259-260 (1985).
  6. Liang, S. M., Liu, T. Y. Studies on the Limulus coagulation system: inhibition of activation of the proclotting enzyme, by dimethyl sulfoxide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 105, 553-559 (1982).
  7. Soderhall, K., Smith, V. J. Separation of the haemocyte populations of Carcinus maenas and other marine decapods, and prophenoloxidase distribution. Dev. Comp Immunol. 7, 229-239 (1983).
  8. Solon, E., Gupta, A. P., Gaugler, R. Signal transduction during exocytosis in Limulus polyphemus granulocytes. Dev. Comp. Immunol. 20, 307-321 (1996).
  9. Armstrong, P. B., Rickles, F. R. Endotoxin-induced degranulation of the Limulus amebocyte. Exp. Cell Res. 140, 15-24 (1982).
  10. Iwanaga, S., Kawabata, S. Evolution and phylogeny of defense molecules associated with innate immunity in horseshoe crab. Front Biosci. Shuster, C. N., Barlow, R. B., Berkman, L., Brockmann, H. J. 3, (1998).
  11. Armstrong, P. B. The American Horseshoe Crab. , Harvard University Press. Cambridge, MA. 288-309 (2003).
  12. Iwanaga, S. The limulus clotting reaction. Curr. Opin. Immunol. 5, 74-82 (1993).
  13. Levin, J. The Limulus amebocyte lysate test: perspectives and problems. Prog. Clin. Biol. Res. 231, 1-23 (1987).
  14. Koshiba, T., Hashii, T., Kawabata, S. A structural perspective on the interaction between lipopolysaccharide and factor C, a receptor involved in recognition of Gram-negative bacteria. J. Biol. Chem. 282, 3962-3967 (2007).
  15. James, G. T. Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers. Anal. Biochem. 86, 574-579 (1978).
  16. Murer, E. H., Levin, J., Holme, R. Isolation and studies of the granules of the amebocytes of Limulus polyphemus, the horseshoe crab. J. Cell Physiol. 86, 533-542 (1975).
  17. Decker, H., Ryan, M., Jaenicke, E., Terwilliger, N. SDS induced phenoloxidase activity of hemocyanins from Limulus polyphemus, Eurypelma californicum and cancer. , 276-17796 (2001).
  18. Armstrong, P. B. A cytolytic function for a sialic acid-binding lectin that is a member of the pentraxin family of proteins. J. Biol. Chem. 271, 14717-14721 (1996).
  19. Armstrong, P. B., Melchior, R., Quigley, J. P. Humoral immunity in long-lived arthropods. J. Insect Physiol. 42, 53-64 (1996).
  20. Armstrong, P. B., Armstrong, M. T. The decorated clot: Binding of agents of the innate immune system to the fibrils of the limulus blood clot. Biol. Bull. 205, 201-203 (2003).
  21. Armstrong, P. B. Interaction of the motile blood cells of the horseshoe crab, Limulus. Studies on contact paralysis of pseudopodial activity and cellular overlapping in vitro. Exp. Cell Res. 107, 127-138 (1977).
  22. Armstrong, P. B. Motility of the Limulus blood cell. J. Cell Sci. 37, 169-180 (1979).
  23. Armstrong, P. B. Adhesion and spreading of Limulus blood cells on artificial surfaces. J. Cell Sci. 44, 243-262 (1980).
  24. Armstrong, P. B. Blood Cells of Marine Invertebrates. Lab. Animal. Cohen, W. D. , A.R. Liss. New York, NY. 253-258 (1985).
  25. Smith, S. A., Berkson, J. Laboratory culture and maintenance of the horseshoe crab (Limulus polyphemus). Lab. Animal. 34, 27-34 (1980).
  26. Leibovitz, L., Lewbart, G. A. The American Horseshoe Crab. Shuster, C. N., Barlow, R. B., Brockmann, H. J. , Harvard University Press. Cambridge, MA. 245-275 (2003).
  27. Rudkin, D. M., Young, G. A., Nowlan, G. S. The oldest horseshoe crab: a new xiphosurid from Late Ordovician Konservat-Lagerstatten deposits. Palaeontology. 51, Manitoba, Canada. 1-9 (2008).
  28. Shuster, C. N., Sekiguchi, K. The American Horseshoe Crab. Shuster, C. N., Barlow, R. B., Brockmann, J. J. , Harvard University Press. Cambridge, MA. 103-132 (2003).
  29. Walls, E. A., Berkam, J., Smith, S. A. The horseshoe crab, Limulus polyphemus, 200 million years of existence, 100 years of study. Rev. Fisheries Sci. 10, 39-73 Forthcoming.
  30. Patten, W. The Evolution of the Vertebrates and Their Kin. P. Blakiston's Son and Co. , Philadelphia, PA. 195-209 (1912).

Tags

אימונולוגיה גיליון 20 סרטן הפרסה Limulus פוליפמוס Limulus amebocyte Limulus דם פלזמה אוסף דם
דם אוסף של סרטן הפרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Armstrong, P., Conrad, M. Blood… More

Armstrong, P., Conrad, M. Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus. J. Vis. Exp. (20), e958, doi:10.3791/958 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter