Summary
سلطعون الأمريكية حدوة حصان ، الليمول polyphemus ، يمكن القول إن المصدر الأكثر ملاءمة لكميات كبيرة من الدم من أي اللافقارية. دم بسيط في التركيب ، مع نوع واحد فقط في خلية تداول العام ، وخلية أميبية الشكل المحبب ، وثلاثة فقط من البروتينات وفرة في البلازما ، هيموسيانين ، والبروتينات سي التفاعلي ، وα2 macroglobulin. ويتم جمع الدم من القلب ويتم فصل خلايا الدم والبلازما بواسطة الطرد المركزي.
Abstract
سلطعون حدوة حصان لديها أفضل نظام المناعة ويتميز أي اللافقارية طويلة الأمد. وقد سهلت هذه الدراسة من الحصانة في سرطان حدوة حصان من سهولة في جمع كميات كبيرة من الدم والبساطة من الدم. سرطان حدوة حصان فقط إظهار نوع خلية واحدة في التداول العام ، وخلية أميبية الشكل المحبب. البلازما ومحتوى الملح من مياه البحر وثلاثة فقط من البروتينات وفيرة ، هيموسيانين وهو البروتين الجهاز التنفسي ، والبروتينات سي التفاعلي ، والتي تعمل في تدمير لحل الخلايا من الخلايا الخارجية ، بما في ذلك الخلايا البكتيرية ، وα2 macroglobulin ، مما يحول دون البروتياز غزو الجراثيم. ويتم جمع الدم من خلال ثقب في القلب مباشرة في ظل الظروف التي تقلل من التلوث lipopolysaccharide (الملقب ، الذيفان الداخلي ، LPS) ، وهو منتج من البكتيريا سالبة الجرام. ويمكن أن تسفر الحيوانات الكبيرة 200-400 مليلتر من الدم. لدراسة البلازما ، وعلى الفور إزالة خلايا الدم من البلازما بواسطة الطرد المركزي والبلازما ويمكن بعد ذلك مجزأة الى البروتينات المكونة لها. ودرس ملائم خلايا الدم مجهريا عن طريق جمع كميات صغيرة من الدم إلى LPS خالية متساوي التوتر المالحة (0.5 M كلوريد الصوديوم) في ظل الظروف التي تسمح الفحص المجهري المباشر من خلال وضع واحدة من أكثر LPS خالية coverglasses على الثقافة السطحية الطبق ، ثم تصاعد تلك coverglasses في غرف الملاحظة البسيطة التالية مرفق الخلية. والثانية لإعداد الملاحظة المباشرة هو جمع 3 -- في طبق الجنين LPS خالية 5 مل من الدم ومن ثم explanting شظايا amebocytes المجمعة إلى الدائرة التي السندويشات في النسيج الفاصل بين شريحة وساترة ملف. في هذا التحضير ، وترحيل amebocytes متحركة على سطح ساترة ، حيث يمكن بسهولة أن تكون الملاحظة. نظام تخثر الدم ينطوي على تجميع amebocytes وتشكيل لتجلط خارج الخلية من البروتين ، coagulin ، والتي يتم تحريرها من حبيبات إفرازية من خلايا الدم. التحليل الكيميائي الحيوي لخلايا الدم يتطلب أن تغسل التجميع وتحبب لا يحدث ، والذي يمكن أن يتحقق عن طريق جمع الدم إلى 0.1 وحدات التخزين من 2 ٪ توين - 20 ، 0.5 M LPS خالية من كلوريد الصوديوم ، M تليها الطرد المركزي من الخلايا والغسيل مع 0.5 كلوريد الصوديوم.
Protocol
التشريحية ملامح السلطعون حدوة حصان ذات الصلة إلى نزيف (الشكل 1)
الشكل 1
- الشعب الثلاث الرئيسية في الجسم ، من الأمامي إلى الخلفي ، هي prosoma (P) ، وopisthosoma (O) ، والدبير (T) 1.
- الهوامش الأمامية والجانبية الخالية من prosoma هو شفة.
- المسافة البادئة الخلفي ، معظم opisthosoma ، حيث يعبر الدبير ، هو خليج المحطة.
- المشترك حيث prosoma وopisthosoma في التعبير هو المفصلي (H).
- يقع في قلب خط الوسط على طول ظهري ، تماما تحت درع من مسم الأريمة و 2 opisthosoma (الشكل 2).
الشكل 2
اعتبارات عامة ، والعقم ، والحماية من التعرض لlipopolysaccharide (الذيفان الداخلي)
- العدو الرئيسي للالتسييل الناجح هو تكتل الخلية ، إيماس ، وتشكيل جلطة coagulin. يتم تحفيز الخلايا والتجميع بواسطة إيماس lipopolysaccharide (الملقب ، الذيفان الداخلي ، LPS) ، وهو منتج من البكتيريا سالبة الجرام. تركيز على عتبة LPS إيماس للخلايا هو غسلها 0،1-1 ملغ / مل ولكن يتم تنشيط خلايا البلازما التي علقت في تركيزات أقل بكثير 3. ليس المعطل الذيفان الداخلي بواسطة التعقيم بسيطة ويمكن الافتراض أن يكون حاضرا على السطوح ، وفي الحلول والكواشف التي لم يصدق أن يكون خال من الذيفان الداخلي
- للحد من احتمالات تخثر الدم خلال جمع ، حدد الكمال فقط ، والحيوانات غير التالفة لوقف نزيف. قبل البرد الحيوانات 02/01 ساعة في غرفة 4 درجات مئوية. ممارسة أسلوب عقيم. الذيفان الداخلي مع تجنب التلوث.
- يستخدم LPS خالية من الملوحة 3 ٪ في مجال الطب السريري ، ويمكن شراؤها من الموردين الطبية (انظر الجدول الكواشف المتخصصة واللوازم). ويمكن إزالة LPS من الأواني الزجاجية والمعدنية بنسبة الحضانة عند 180 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. المحاقن المعقمة إبر تستخدم مرة واحدة ، أطباق بتري على غرار الثقافة ، وأنابيب الطرد المركزي المسمار الحد الأقصى LPS كلها خالية ، ويمكن استخدامها بدون تعديل ما دام يمارس تقنية معقمة مناسبة.
- استقرار خلايا الدم من الحيوانات المختلفة يختلف ، مع بعض خلايا الحيوانات الفردية التي تمر تحبب عفوية ، مما أدى إلى تشكيل الجلطة coagulin ، حتى عندما يكون الحيوان هو نزف بأكبر قدر من الرعاية. خلايا الدم من السرطانات الأخرى حدوة الفردية هي أكثر استقرارا بكثير ، وعندما يتم اتباع الاجراءات السليمة ، لا تزال الحبيبية بالكامل خلال النزيف وفصل الخلايا من البلازما.
- وقد تم الإبلاغ عن عدة عوامل لتحقيق الاستقرار في خلايا الدم ينزف التالية ، بما في ذلك الكافيين (0.25 تنزف في مجلدات من الكافيين 10 مم في LPS الحرة كلوريد الصوديوم 3 ٪) 4 ، بروبرانولول (1 ملي تركيز النهائي) 5 ، 6 dimethylsulfoxide ، ثنائي التكافؤ استخلاب الموجبة ( تنزف في حجم مساو من الدكستروز M 0.1 ، 0.03 سيترات الصوديوم M ، 0.026 M حامض الستريك ، 10 ملي ethylenediaminetetraacetic الصوديوم حمض (نا 2 EDTA) ، ودرجة الحموضة 4.6) 7 ، مثبطات البروتين - G ومسارات فسفوليباز - C (الكوليرا و pertussus السموم ، U73122) 8 ، والاستعاضة من كلوريد مع أنيون isethionate 9 ، حاصرات قنوات كلوريد 9 ، دوري 9 - AMP الخصوم والكواشف سلفهيدريل (5 ملي N - إيثيل maleimide ، NEM) 5 ، وغشاء النشطة المنظفات توين - 20 ( تنزف إلى 0.1 ٪ حجم توين 2 - 20 في LPS خالية من كلوريد الصوديوم 0.5 M).
اللوازم والمواد الكاشفة لوقف نزيف السلطعون حدوة حصان : جمع كميات كبيرة من الدم
- واحد أو أكثر من ذلك ، لم يلحق بها أذى كبير السلطعون حدوة حصان
- بخ زجاجة تحتوي على 70 ٪ من الإيثانول
- Kimwipes
- إبرة قياس 14
- قوي ملقط
- دلو الثلج مع الثلج
- 50 مل المسمار الحد الأقصى المتاح أنابيب بلاستيكية الطرد المركزي
- رف لعقد أنابيب سعة 50 مل
- قمة مكافحة الطرد المركزي
- ماصات معقمة 50 مل المصلية
- لمبة من نوع حشو ماصة
- المتاح جهاز تصفية العقيمة
- فراغ مضخة
- LPS خالية حل كلوريد الصوديوم 3 ٪ (لمجموعة من خلايا الدم)
- توين - 20 (لجمع خلايا الدم)
استعدادات واسعة لحجم النزيف
- لوقف نزيف ، واستخدام كبير ، والحيوانات غير التالفة. البرد الحيوان لمدة 1 ساعة في غرفة باردة قبل النزيف.
- وضع ترتيب مريح مع دعم استقرار لدلو الجليد الذي يعادل نحو 0.3 مترا عالية (الستايروفوم شحن الحاويات المتاح للالبريدية الكواشف الباردة أو المجمدة غير مناسبة) وكرسي منخفض للمشغل. يتم وضع دلو الثلج على هيكل الدعم ويوجه الرئيسيصل إلى هذه الوحدة. يجب أن تكون مريحة الجلوس لفترة طويلة في كرسي مع مرفقيك يستريح على الفخذين ، وباليد اليسرى عقد تكافح السرطان حدوة المتمركزة فوق أنابيب جمع الدم في رأسي مسنود على سرير من الجليد في دلو الجليد
- قبل البرد 4-6 في 50 مل من البلاستيك القابل للتصرف أنابيب الطرد المركزي مع إغلاق المسمار في حمام جليدي. يتم تعيين أنابيب تستقيم في الجليد تراوحت حول محيط من الجليد حاوية الحمام. قبل البدء في عملية النزيف وتنزع الأغطية من الأنابيب وأغطية مكان على طاولة مجاورة ، والتمسك تقنية معقمة.
- إزالة الغطاء إبرة الجا 14 و استخدام ملقط قوي لتخفيف إبرة في جعبتها ، ولكن لا تقم بإزالة الإبرة من الأكمام. بحفظ العقم. ولا تلمس أي جزء من الإبرة مع الأصابع. رفع الأكمام مكان مع الإبرة على مكافحة المتاخمة مع بعقب المكشوفة من الإبرة من الاتصال مع أي سطح للحفاظ على عقم والخمسين.
- بلل a Kimwipe مع الايثانول 70 ٪.
نزيف الحيوان (وتحديدا للمشغل اليد اليمنى)
- عقد لوقف نزيف الحيوان : الحيوانات في متناول اليد اليسرى مع الاصابع الاربعة في اتصال مع شفة الأمامي من prosoma والإبهام استيعاب الجزء الخلفي من opisthosma عند قاعدة الذيل (خليج النهائي). السطح البطني للحيوان تواجه راحة يدك. والدبير تقع على طول قاعدة الإبهام والمشاريع على المعصم. العطف على الحيوان برفق حتى أن prosoma وopisthosoma وبزاوية قائمة مع بعضها البعض (3A الشكل).
الشكل 3 - تنظيف المفصلي يتعرض prosoma المشتركة التي تربط وopisthosoma مع الايثانول 70 ٪ مع تطبيق الايثانول مبلل Kimwipe (الشكل 3B).
- تدوير اليد اليسرى بحيث أصابع 2-4 تحتل مكان الصدارة والسطح الظهري للحيوان ينبري. مع اليد اليمنى ، وإدراج الحقنة الجا 14 إبرة ، ولا يزال في جعبتها الواقية ، بين 2 و 3 أصابع من اليد اليسرى. اتخاذ ملقط في اليد اليمنى وإزالة الإبرة من جعبتها الوقائية التي استيعاب بعقب مع ملقط (الشكل 3C). تدوير اليد اليسرى بحيث السطح الظهري من ناحية الوجوه الإبهام ، والسبابة اليسرى هي الأعلى ، وهذا الحيوان هو رأسا على عقب ، مع سطحه الظهري التي تواجه اليد اليمنى. موقف بعقب الإبرة أعلاه أول من أنابيب جمع 50 مل وتوجيه الحيوان بحيث يتم أشار نهاية حادة من الإبرة في المفصل المشتركة وبحيث رمح الإبرة موازية للخط الوسط الظهرية (الشكل 3D). إدراج نهاية حادة من الإبرة من خلال مشترك المفصلي في تجويف القلب ، والحفاظ على الإبرة في وضع مواز للخط الوسط الظهرية وإدراجه في خط الوسط وبعقب الإبرة وضعه لا يزال أعلى من افتتاح أنبوب جمع. يتم إدخال الإبرة 1 -- 2 سم عمق جزء من القلب في prosoma. بمجرد ثقب القلب ، سوف تدفق الدم بسرعة (الشكل 4A ، السهم) ، ولذلك فمن الأهمية بمكان ضمان أن يتم وضع نهاية تسليم إبرة حقنة فوق فوهة أنبوب جمع لجمع تلك الطفرة الأولي من الدم.
- وخروج الدم في القلب في البداية في تيار مستمر ، بعد حوالي 30 -- تم جمع 50 مل من الدم ، وسيتباطأ إلى قطرات الفردية (الشكل 4B). لتحسين تدفق الدم ، قد يكون سياسة جيدة لترجيح كفة إعادة توجيه من الإبرة قليلا. إمالة إبرة صعودا أو هبوطا ، يمينا أو يسارا ؛ الشريحة طرفها أعمق في القلب أو تسحبه إلى أقرب إلى المفصلي مشتركة للعثور على الموقف الذي يحسن من تدفق الدم. لا ضغط مفرط على الحيوان ، لأن هذه المخاطر المدمرة الحيوان ويمكن أن يتسبب في الدم خارج الأوعية لبدء تخثر الدم.
الشكل 4 - كما جمع كل أنبوب يملأ مع الدم ، وتدوير حمام الثلج لإحضار أنبوب فارغ المقبل تحت نهاية التسليم من الإبرة.
- كما يبطئ النزيف ، كنت عرضة لخطر وجود تدفق الهواء في اتجاه رجعي الى إبرة والى القلب. وهذا يمكن أن يحدث عندما يكون الحيوان يعدل بها ، مما يؤدي إلى خفض ضغط الدم. محاولة لمنع هذا عن طريق الحفاظ على الحيوانات في الموقف مثنى أو بالسماح لاستقامة يحدث إلا ببطء.
- عندما توقف عن التبرع بالدم الحيوانية ، وإزالة الإبرة نزيف من القلب. إعادة رسملة جمع أنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي على الفور في جدول أعلى ، 1000 دورة في الدقيقة ، 5 دقائق. وخلايا الدم شكل الكريات المضغوط في قيعان من أنابيب جمع. لأن ترد كافة المكونات لتخثر الدم داخل الحويصلات الإفرازية للخلايا الدم ، ويتم فصل البلازما في أقرب وقت من الخلايا ،يتم التخلص من مخاطر تخثر الدم من البلازما.
- لا بد من تجنب تجلط الدم خارج الأوعية. التدابير التالية للحد من مخاطر تخثر الدم : مرحلة ما قبل التبريد للحفاظ على الحيوانات وأنابيب جمع في حمام الثلج ؛ التعامل مع طيف من الحيوان ، والحد من السرعة التي يتدفق الدم من إبرة حقنة ؛ الطرد المركزي للدم فورا بعد جمعها ، وتجنب تلوث الإبر والأنابيب الذيفان الداخلي مع جمع وصيانة الداخلي العقيم. كما ذكر أعلاه ، وبعض الحيوانات الفردية قد تعكر المزاج وخاصة خلايا الدم التي تبدأ إيماس حتى عندما يتم اتباع هذه الاحتياطات.
- بعد الطرد المركزي ، وفحص الأنابيب بحثا عن علامات على تخثر الدم -- خيوط من الخلايا والمواد الهلامية تجلط تعلق على الجدران من الأنبوب ، المادة الهلامية في الجزء العلوي من جلطة ، أو ما هو أسوأ ، كميات كبيرة من تجلط الدم مع الخلايا في شرك عمود السائل (الشكل 4C ، السهم). المواد من هذه الأنابيب هو المصل ، وليس البلازما ، ويحتوي على منتجات يفرز من خلايا الدم.
- نقل البلازما في أنابيب معقمة مع 50 مل المصلية ماصة معقمة. ممارسة الحذر عند pipetting الشفط لتجنب أي من الخلايا من خلية بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. فمن الأفضل أن تترك مل قليل من البلازما فوق بيليه لتجنب تعكير بيليه الخلية.
- ويهدف الإجراء المذكورة أعلاه لجمع كميات كبيرة من البلازما غير ملوثة من منتجات إفرازية من خلايا الدم. لجمع كميات كبيرة من خلايا الدم يغسل ، وجمع الدم إلى 0.1 وحدات التخزين من 2 ٪ توين - 20 الذائب في محلول LPS خالية من كلوريد الصوديوم 3 ٪. الطرد المركزي الخلايا برفق لمدة 10 دقائق لإنشاء فضفاضة بيليه الخلية ، ثم تغسل الخلايا مع عدة تغييرات من LPS الحرة كلوريد الصوديوم 3 ٪. يمكن تحضير مستخرج من الخلايا التي تحتوي على منتجات إفرازي الخلايا في الدم عن طريق الخلايا lysing غسلها في LPS خالية من الماء المقطر. هذا lysate يحتوي على مجموعة متنوعة من البروتينات والببتيدات التي تعمل في مكافحة الجراثيم الدفاع المناعي 10،11 ويحتوي أيضا على coagulogen ، وشكل مولد الإنزيم من البروتين الهيكلي للتجلط الدم خارج الخلية ، وجمع من البروتياز التي تحول إلى coagulogen coagulin ، شكل البروتين الذي polymerizes في ال 12 من ييفات الجلطة. هذا مشابه لاستخراج المنتج المتوفر تجاريا ، الليمول lysate خلية أميبية الشكل أو LAL ، الذي يستخدم لفحص وجود lipopolysaccharide 13. تنشيط تتالي البروتيني المسؤول عن تعديل بروتين من coagulogen لcoagulin بواسطة LPS 14.
- التخلص من الحيوانات بعد النزيف. النزيف الذي أجراه الطرق المحددة أعلاه هو جيد التحمل من قبل الحيوانات. عند العمل في المختبر البيولوجي البحري في وودز هول ، أعود إلى الحيوانات في المحيط بعد النزيف مع توقع أنها سوف البقاء على قيد الحياة. إذا تمسك الحيوانات في أحواض بعيدة عن المعدل الطبيعي للسرطان حدوة الحصان ، ويمكن أن ينزف بشكل متكرر مرة أو مرتين في الشهر. كما هو موضح أدناه ، والحيوانات في الأسر تتطلب الحفاظ على المياه ذات الجودة العالية والتغذية بشكل متكرر للحفاظ على صحتهم. يمكن إنجازه من خلال القتل الرحيم تدمير العقدة ظهري ، والتي تقع في المنتصف بين ظهراني العينين.
تجهيز وتخزين البلازما
- الحماية من البروتياز. إذا البلازما هي لاستخدامها في تنقية البروتين ، ينبغي التعامل معها مع مثبطات الأنزيم البروتيني مباشرة بعد جمعها. إضافة phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) إلى التركيز النهائي من 1 ملم. يتم الاحتفاظ PMSF كحل 0.1 M الأسهم في DMSO أو الايثانول. فمن غير مستقر تماما في المياه 15 ، لذلك لا يمكن الاعتماد على حماية دائمة ، ولكن بالإضافة إلى ذلك مباشرة بعد فصل البلازما عن خلايا الدم يعطل كميات صغيرة من البروتياز التي قد أفرج عنهم من الخلايا.
- الترشيح العقيمة : تعقيم بواسطة البلازما الفائق تحت فراغ باستخدام المتاح المتوسطة الترشيح جهاز مزودة تصفية 0.22 ملم المسام. هذه الفلاتر لديهم ميل لتسد. فإنه من المستحسن أن أجهزة الطرد المركزي في البلازما قبل التصفية للحد من هذه المشكلة. إذا تتم معالجة كميات كبيرة من البلازما ، ويستحسن قبل تصفية البلازما أولا باستخدام عامل تصفية ميليبور مع حجم المسام ملم 1 ، ثم مع 0،45 ملم حجم المسام ميليبور التصفية.
- يمكن حمايتها من التلوث الجرثومي البلازما إما عن طريق إضافة نان 3 إلى تركيز النهائي من 0.2 ملغ / مل أو عن طريق الترشيح العقيمة. لا ينبغي أبدا أن تكون غير معقمة البلازما المخزنة لفترات أطول من 2 يوما من دون واحدة أو الأخرى التي يجري اتخاذها لهذه التدابير المضادة للبكتيريا.
- تخثر الدم. على عكس نظام تخثر الثدييات ، والبلازما الليمول يحتوي على أي من العناصر اللازمة لتجلط الدم. بدلا من ذلك ، آلية كاملة لتشكيل الجلطة ، والبروتينات الهيكلية للتجلط (coagulogen) ونظام البروتياز تلك العملية coagulogeتم العثور على n لجعلها قادرة على البلمرة في تجلط غير قابلة للذوبان في الحبيبات الإفرازية للخلايا الدم 16. إذا كان الأمر كذلك تتم إزالة خلايا الدم قبل أن تتاح لهم الفرصة للخضوع لإيماس ، والبلازما هي خالية تماما من البروتينات لتخثر الدم والسوائل ستبقى إلى أجل غير مسمى.
- تنقية البروتين. هيموسيانين موجود في 40 ملغ / مل في البلازما ويشكل 48 مير من 70 كيلو دالتون الوحيدات. يمكن عزلها بواسطة تنبيذ فائق (40،000 X ز ، ح 8) أو هلام الترشيح مع الراتنج المسام الكبيرة الحجم مثل الاستبعاد A5m BioGel 17. البروتينات سي التفاعلي موجودة في 1 -- يمكن أن تكون معزولة 5 ملغ / مل ، والعزلة على تقارب phosphorylethanolamine - Sepharose ، وشطف مع خالب الكالسيوم 18. وقد تم تنقية مثبط البروتياز واسع الطيف ، وهو 2 - macroglogulin ، عن طريق الترشيح في هلام Sephacryl S - 300 الراتنج بعد أن تمت إزالة هيموسيانين والبروتينات المتفاعلة C - 19.
الفحص المجهري للخلايا الدم متحركة في الثقافة
- يضاف LPS خالية من كلوريد الصوديوم 3 ٪ حل لأطباق بلاستيكية معقمة على غرار الثقافة بيتري (1 مل عن طبق 35 ملم ، 2.5 مل عن طبق 60 ملم و 6 مل عن صحن مل 90) : إنشاء خلية أميبية الشكل المروج في المختبر. ثم يتم الحصول على الدم عن طريق ثقب القلب باستخدام الطريقة الموصوفة أعلاه ، ولكن مع التعديل الذي يستخدم قياس 23 ، 1 في إبر المحاقن المعقمة بدلا من إبرة قياس 14 يتدفق الدم من خلال الانقطاع عن الإفلات من إبرة قياس 23 و يتم جمعها 1 تسقط في صحن 35 ملم ، 3 قطرات في صحن 60 ملم ، و 9 نقاط في طبق بقطر 100 ملم. ثم يتم خلط خلايا الدم بشكل موحد في الحل كلوريد الصوديوم 3 ٪ بحلول طيف الأول ، يحوم في نمط دائري ، ثم ذهابا وإيابا. والمحتضنة لإعداد لمدة 5 دقائق في غرفة T للسماح لخلايا الدم نعلق على سطح الطبق ، ثم يتم استبدال المالحة مبدئي مع منطقة عازلة في الاختيار 3.
- إذا كان من المرغوب فيه للحفاظ على خلايا الدم التحتية المرفقة في حالة undegranulated ، يتم استبدال الأولية خليط الدم البلازما المالحة مع LPS الطازجة الخالية من كلوريد الصوديوم 3 ٪. البلازما يسرع تحبب عفوية من خلايا الدم حتى في غياب LPS ، وزواله استقرار الدولة undegranulated الخلايا.
- إذا كان يتم استبدال المالحة أولية مع البلازما العقيمة ، وخلايا الدم تتحول من شكل بيضوي الشكل من الخلية الدموية (الشكل 5) ، وتتسطح على الطبقة التحتية ، ومن ثم الشروع في تحبب وتشكيل طبقة من تجلط الدم coagulin خارج الخلية فوق العشب من amebocytes بالارض 20.
الشكل 5 - إنشاء الثقافات يزدرع من amebocytes المجمعة. عندما يتم جمع الدم تحت ظروف معقمة LPS خالية ، وخلايا الدم تترسب من الايقاف والإجمالي لتشكيل كتلة النسيج مثل. وعاء مناسب لهذا الطبق الجنين زجاج المقدمة LPS خالية من الحضانة لمدة 4 ساعات في 180 جيم 0 وحضنت الدم التي تم جمعها في هذه الحاوية بواسطة ثقب القلب باستخدام إبرة قياس 19 ل1-2 ح تي في الغرفة ، ثم يتم قص قطعة مربعة طول ضلعها 1 من مجموع خلية أميبية الشكل مع إبرة معقمة قياس 18 المحاقن وتقع بين اثنين أو coverglasses ساترة وشريحة مفصولة شظايا coverglasses لتكون بمثابة الفواصل. بعد حوالي نصف ساعة ، تبدأ amebocytes المهاجرة من هامش يزدرع على ساترة ل(الشكل 6A) ، حيث يمكن أن ينظر إليها على النقيض مع المرحلة أو البصريات مدينة دبي للإنترنت 21. في البداية ، والخلايا المهاجرة يتم التعاقد مع pseudopods الهياليني (الشكل 6B (م)) أن تمتد فوق الطبقة التحتية والهجرة ، والتي ثم يتم إنزالها في اتصال مع السطح والحركة إلى الأمام ينطوي على تدفق السيتوبلازم الحبيبية في 22 قدم كاذبة . في وقت لاحق ، وتتسطح الخلايا (الشكل 6B (و)) والشروع في تحبب (الشكل 6B (د)) ، ووقف تنقل 23. الغرفة الثقافة وصفها هنا يسمح للنضح من وكلاء تجريبية مختلفة في غرفة للتحقيق ثقافة آثارها على حركية الخلية وإيماس الحبيبية 9. ويمكن العثور على مراجعة منهجية موسعة للثقافة خلية أميبية الشكل للفحص المجهري في 24.
الشكل 6
صيانة سرطان حدوة الكبار في الأحواض المائية
سرطان حدوة الحصان تتطلب عالية الجودة ومياه البحر ويمكن الاحتفاظ بها في أحواض مزودة نظام لتنقية المياه التي تقدم للترشيح الجسيمات ، والتهوية ، ونزع النتروجين من المياه 25. ويجب أن تغذى الحيوانات أو 2 أو 3 مرات في الأسبوع على الروبيان وسرطان البحر والسمك ، أو الحبار. ويتم إنجاز التغذية عن طريق إزالة الحيوان من الزينة ، وجيش التحرير الشعبى الصينىالوراثة على ظهرها ، ووضع الطعام على الفم. إذا كان جائعا ، وسوف تبدأ قريبا الحيوان بلع الطعام. تبعا لتطور نظام مياه البحر ، ينبغي الحفاظ على الحيوان لمدة ساعة أو نحو ذلك حتى يتبرز في وعاء منفصل من مياه البحر أو يمكن إرجاعها إلى الحوض بعد الرضاعة قد بدأت. على المدى الطويل الصيانة ، ينبغي أن يوضع الحيوان بعيدا عن الضوء لمنع نمو الطحالب الخضراء أو الزرقاء الخضراء على سطح درع. الطحالب تآكل درع ومنذ طرح أخلاقي لا ، وهذا سوف يسبب الموت للحيوان 26. في البرية ، والحيوانات تنفق الكثير من الوقت مدفونة جزئيا في الرمل ، ولكن الرمال أو الحصى في الحوض يمثل صعوبة في المحافظة على مستوى النظافة مهمة على المدى الطويل الصيانة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك أربعة أنواع من سرطان حدوة الحصان ، polyphemus الليمول من الساحل الشرقي لأمريكا الشمالية وثلاثة من الأنواع التي تتراوح من اليابان إلى خليج البنغال. يتم التعرف على الحيوانات باعتبارها "حفرية حية" لأنه تم العثور على نماذج مماثلة من حفريات وتشريحيا 445000000 27 عاما مضت. سلطعون حدوة حصان تمثل حيوان طويل الأمد ، وتتطلب 10-13 سنة لتصل إلى مرحلة النضج والمعيشية لا يقل عن 20 سنة 28. وإن كان قد تعرض لحصاد واسعة كطعم لصيد الأسماك ، وثعبان البحر محارة 29 ، سلطعون الأمريكية حدوة حصان لا تزال وفيرة ومعقول يسمح للجمع غير مدمرة من 50 مل من الدم من شخص بالغ الصغيرة وبقدر 400 مل من كبيرة من الإناث. يمكن أن تكتمل جمع الدم هذا بكثير حتى في أقل من 10 دقيقة. أنا لا أعرف أي اللافقاريات الأخرى المتاحة بسهولة أن يوفر الكثير من الدماء حتى مع القليل من الجهد لذلك.
وقد حفزت على أهمية اختبار LAL لالذيفان الداخلي ، وهو مؤشر لوجود البكتيريا سالبة الجرام ، والفائدة في النظام المناعي للسرطان حدوة الحصان 13. اختبار LAL يعتمد على تفعيل المبادرة البروتيني للنظام تخثر الدم بواسطة LPS 14 ، مع قراءة للخروج من تشكيل جلطة أو لمقايسة اللونية للنشاط الأنزيم البروتيني. وقد اثنين من عناصر الحصانة التي تلقت أكبر قدر من الاهتمام للبروتينات البلازما والعديد من البروتينات والببتيدات من حبيبات إفرازية من خلايا الدم. كانت النتيجة ارتفاع السلطعون حدوة حصان في حالة وجود أفضل وصف للنظام المناعي لأي اللافقارية المعمرة 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد البحوث الأصلي الموصوفة أعلاه ، منح NSF 0344630.
References
- Lochhead, J. H. Selected Invertebrate Types. Brown, F. A. , John Wiley and Sons, Inc. New York, NY. 360-381 (1950).
- Shuster, C. N. The circulatory system and blood of the horseshoe crab Limulus polyphemus L.: a review. US Dept Energy, Fed Regul. Comm. , Washington. (1978).
- Conrad, M. L., Pardy, R. L., Wainwright, N., Child, A., Armstrong, P. B. Response of the blood clotting system of the American horseshoe crab, Limulus polyphemus, to a novel form of lipopolysaccharide from a green alga. Comp Biochem. Physiol A Mol. Integr. Physiol. , 144-423 (2006).
- Nakamura, T., Morita, T., Iwanaga, S. Intracellular proclotting enzyme in limulus (Tachypleus tridentatus) hemocytes: its purification and properties. J. Biochem. (Tokyo. 97, 1561-1574 (1985).
- Levin, J., Ornberg, R. L. Blood Cells of Marine Invertebrates: Experimental Systems in Cell Biology and Comparative Physiology. Cohen, W. D. , Alan R. Liss, Inc.. New York, NY. 259-260 (1985).
- Liang, S. M., Liu, T. Y. Studies on the Limulus coagulation system: inhibition of activation of the proclotting enzyme, by dimethyl sulfoxide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 105, 553-559 (1982).
- Soderhall, K., Smith, V. J. Separation of the haemocyte populations of Carcinus maenas and other marine decapods, and prophenoloxidase distribution. Dev. Comp Immunol. 7, 229-239 (1983).
- Solon, E., Gupta, A. P., Gaugler, R. Signal transduction during exocytosis in Limulus polyphemus granulocytes. Dev. Comp. Immunol. 20, 307-321 (1996).
- Armstrong, P. B., Rickles, F. R. Endotoxin-induced degranulation of the Limulus amebocyte. Exp. Cell Res. 140, 15-24 (1982).
- Iwanaga, S., Kawabata, S. Evolution and phylogeny of defense molecules associated with innate immunity in horseshoe crab. Front Biosci. Shuster, C. N., Barlow, R. B., Berkman, L., Brockmann, H. J. 3, (1998).
- Armstrong, P. B. The American Horseshoe Crab. , Harvard University Press. Cambridge, MA. 288-309 (2003).
- Iwanaga, S. The limulus clotting reaction. Curr. Opin. Immunol. 5, 74-82 (1993).
- Levin, J. The Limulus amebocyte lysate test: perspectives and problems. Prog. Clin. Biol. Res. 231, 1-23 (1987).
- Koshiba, T., Hashii, T., Kawabata, S. A structural perspective on the interaction between lipopolysaccharide and factor C, a receptor involved in recognition of Gram-negative bacteria. J. Biol. Chem. 282, 3962-3967 (2007).
- James, G. T. Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers. Anal. Biochem. 86, 574-579 (1978).
- Murer, E. H., Levin, J., Holme, R. Isolation and studies of the granules of the amebocytes of Limulus polyphemus, the horseshoe crab. J. Cell Physiol. 86, 533-542 (1975).
- Decker, H., Ryan, M., Jaenicke, E., Terwilliger, N. SDS induced phenoloxidase activity of hemocyanins from Limulus polyphemus, Eurypelma californicum and cancer. , 276-17796 (2001).
- Armstrong, P. B. A cytolytic function for a sialic acid-binding lectin that is a member of the pentraxin family of proteins. J. Biol. Chem. 271, 14717-14721 (1996).
- Armstrong, P. B., Melchior, R., Quigley, J. P. Humoral immunity in long-lived arthropods. J. Insect Physiol. 42, 53-64 (1996).
- Armstrong, P. B., Armstrong, M. T. The decorated clot: Binding of agents of the innate immune system to the fibrils of the limulus blood clot. Biol. Bull. 205, 201-203 (2003).
- Armstrong, P. B. Interaction of the motile blood cells of the horseshoe crab, Limulus. Studies on contact paralysis of pseudopodial activity and cellular overlapping in vitro. Exp. Cell Res. 107, 127-138 (1977).
- Armstrong, P. B. Motility of the Limulus blood cell. J. Cell Sci. 37, 169-180 (1979).
- Armstrong, P. B. Adhesion and spreading of Limulus blood cells on artificial surfaces. J. Cell Sci. 44, 243-262 (1980).
- Armstrong, P. B. Blood Cells of Marine Invertebrates. Lab. Animal. Cohen, W. D. , A.R. Liss. New York, NY. 253-258 (1985).
- Smith, S. A., Berkson, J. Laboratory culture and maintenance of the horseshoe crab (Limulus polyphemus). Lab. Animal. 34, 27-34 (1980).
- Leibovitz, L., Lewbart, G. A. The American Horseshoe Crab. Shuster, C. N., Barlow, R. B., Brockmann, H. J. , Harvard University Press. Cambridge, MA. 245-275 (2003).
- Rudkin, D. M., Young, G. A., Nowlan, G. S. The oldest horseshoe crab: a new xiphosurid from Late Ordovician Konservat-Lagerstatten deposits. Palaeontology. 51, Manitoba, Canada. 1-9 (2008).
- Shuster, C. N., Sekiguchi, K. The American Horseshoe Crab. Shuster, C. N., Barlow, R. B., Brockmann, J. J. , Harvard University Press. Cambridge, MA. 103-132 (2003).
- Walls, E. A., Berkam, J., Smith, S. A. The horseshoe crab, Limulus polyphemus, 200 million years of existence, 100 years of study. Rev. Fisheries Sci. 10, 39-73 Forthcoming.
- Patten, W. The Evolution of the Vertebrates and Their Kin. P. Blakiston's Son and Co. , Philadelphia, PA. 195-209 (1912).
