Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

अमेरिकी घोड़े की नाल केकड़े, Limulus Polyphemus से रक्त संग्रह

Published: October 13, 2008 doi: 10.3791/958
Automatic Translation
1,2, 3
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Davis, 2Marine Biological Laboratory - MBL- woods hole, 3Department of Biological Sciences, Hunter College of CUNY

Summary

अमेरिकी घोड़े की नाल केकड़े, Limulus polyphemus, यकीनन किसी भी invertebrate के रक्त की एक बड़ी मात्रा के लिए सबसे सुविधाजनक स्रोत है. रक्त केवल एक सामान्य परिसंचरण, दानेदार amebocyte, और प्लाज्मा, hemocyanin, सी प्रतिक्रियाशील प्रोटीन, और α2 macroglobulin में केवल तीन प्रचुर मात्रा में प्रोटीन में सेल प्रकार के साथ संरचना में सरल है. दिल से रक्त एकत्र किया जाता है और रक्त कोशिकाओं और प्लाज्मा centrifugation द्वारा अलग कर रहे हैं.

Abstract

घोड़े की नाल केकड़े सबसे विशेषता किसी भी लंबे समय रहते invertebrate की प्रतिरक्षा प्रणाली है. खून की बड़ी मात्रा में इकट्ठा करने में आसानी और रक्त की सादगी से घोड़े की नाल केकड़े में प्रतिरोधक क्षमता के अध्ययन में मदद की है. घोड़े की नाल केकड़े सामान्य परिसंचरण, दानेदार amebocyte में केवल एक एकल कोशिका प्रकार दिखा. प्लाज्मा समुद्र के पानी के नमक सामग्री है और केवल तीन प्रचुर मात्रा में प्रोटीन, hemocyanin, श्वसन प्रोटीन, सी प्रतिक्रियाशील प्रोटीन, बैक्टीरियल कोशिकाओं सहित जो विदेशी कोशिकाओं के cytolytic विनाश समारोह में, और α2 macroglobulin, जो proteases रोकता रोगज़नक़ों हमलावर की. रक्त की शर्तों के तहत सीधे हृदय पंचर है कि lipopolysaccharide (उर्फ, endotoxin, LPS), ग्राम - नकारात्मक जीवाणुओं की एक उत्पाद के द्वारा संदूषण कम से कम द्वारा एकत्र की है. खून की 400 एमएल - एक बड़े जानवर 200 उपज कर सकते हैं. प्लाज्मा के अध्ययन के लिए, रक्त कोशिकाओं तुरंत centrifugation द्वारा प्लाज्मा से हटा दिया और प्लाज्मा फिर अपने घटक प्रोटीन में fractionated किया जा सकता है. रक्त कोशिकाओं सुविधा LPS मुक्त isotonic खारा (0.5 एम NaCl) में स्थिति है कि संस्कृति डिश की सतह पर अधिक के LPS मुक्त coverglasses रखकर प्रत्यक्ष सूक्ष्म परीक्षण की अनुमति के तहत रक्त की छोटी मात्रा में इकट्ठा करके microscopically अध्ययन, तो उन coverglasses बढ़ते सेल लगाव निम्नलिखित सरल अवलोकन कक्षों में. प्रत्यक्ष प्रेक्षण के लिए एक दूसरे की तैयारी के लिए 3 इकट्ठा है - भ्रूण LPS मुक्त पकवान में रक्त के 5 एमएल और फिर एक कक्ष में एकत्रित amebocytes के टुकड़े explanting कि सैंडविच एक स्लाइड और एक coverglass के बीच ऊतक. इस तैयारी में, चलता - फिरता amebocytes coverglass सतह, जहां वे आसानी से देखा जा सकता है पर विस्थापित. रक्त के थक्के प्रणाली amebocytes का एकत्रीकरण और एक प्रोटीन, coagulin, जो रक्त कोशिकाओं के स्रावी granules से जारी है एक बाह्य थक्का के गठन शामिल है. धोया रक्त कोशिकाओं की बायोकेमिकल विश्लेषण कि एकत्रीकरण और degranulation नहीं होती है, जो 2% बीच-20, 0.5 एम NaCl LPS मुक्त, कक्षों की centrifugation द्वारा पीछा किया और 0.5 के साथ धोने एम 0.1 मात्रा में रक्त इकट्ठा करके पूरा किया जा सकता है की आवश्यकता है NaCl.

Protocol

खून बह रहा करने के लिए प्रासंगिक घोड़े की नाल केकड़े की शारीरिक विशेषताएं (1 छवि)

चित्रा 1

चित्रा 1

  1. शरीर के तीन प्रमुख डिवीजनों, पीछे पूर्वकाल से, (पी) prosoma, opisthosoma (का.), और Telson (टी) 1.
  2. prosoma की पूर्वकाल और पार्श्व मुक्त हाशिये निकला हुआ किनारा है.
  3. opisthosoma के पीछे सबसे इंडेंटेशन, जहां Telson articulates टर्मिनल बे है.
  4. संयुक्त जहां prosoma और opisthosoma मुखर काज (एच) है.
  5. दिल पृष्ठीय midline के किनारे स्थित है, बस prostoma और opisthosoma 2 (छवि 2) के कछुवे की पीठ की हड्डी के नीचे है.


    चित्रा 2

    चित्रा 2

जनरल विचार, बाँझपन और जोखिम से lipopolysaccharide संरक्षण (endotoxin)

  1. सफल खून के प्रमुख दुश्मन सेल clumping, exocytosis और coagulin थक्का का गठन है. सेल एकत्रीकरण और exocytosis lipopolysaccharide (उर्फ, endotoxin, LPS), ग्राम - नकारात्मक जीवाणुओं की एक उत्पाद के द्वारा प्रेरित कर रहे हैं. 1 मिलीग्राम / एमएल लेकिन प्लाज्मा में निलंबित कोशिकाओं को काफी कम 3 सांद्रता द्वारा सक्रिय कर रहे हैं - धोया कोशिकाओं के लिए exocytosis लिए LPS की दहलीज एकाग्रता 0.1 है . Endotoxin सरल autoclaving द्वारा निष्क्रिय नहीं है और सतहों पर उपस्थित होने के लिए ग्रहण किया जा सकता है है और समाधान और अभिकर्मकों कि endotoxin मुक्त होना प्रमाणित नहीं कर रहे हैं.
  2. रक्त का संग्रह दौरान थक्के की संभावना को कम करने के लिए, रक्तस्राव के लिए ही सही, undamaged जानवरों का चयन करें. 4 ° सी कमरे में 1-2 घंटे जानवरों पूर्व ठंडा. बाँझ तकनीक का अभ्यास करें. Endotoxin के साथ संदूषण से बचें.
  3. LPS मुक्त 3% खारा नैदानिक ​​चिकित्सा में प्रयोग किया जाता है और चिकित्सा आपूर्तिकर्ताओं से खरीदा जा सकता है है (विशेष अभिकर्मकों और आपूर्ति के तालिका देखें). LPS ऊष्मायन द्वारा कांच के बने पदार्थ और धातु से 180 ° C 4 घंटे के लिए हटाया जा सकता है. बाँझ एकल उपयोग सिरिंज सुई, पेट्री शैली संस्कृति व्यंजन, और पेंच टोपी अपकेंद्रित्र ट्यूबों सभी LPS मुक्त और इतने लंबे समय के रूप में उचित बाँझ तकनीक अभ्यास है संशोधन के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. विभिन्न जानवरों के रक्त कोशिकाओं की स्थिरता कुछ व्यक्ति सहज degranulation के दौर से गुजर जानवरों की कोशिकाओं के साथ अलग है, coagulin थक्का के गठन में जिसके परिणामस्वरूप, जब भी जानवरों की सबसे बड़ी देखभाल के साथ लहूलुहान है. अन्य व्यक्ति घोड़े की नाल केकड़े की रक्त कोशिकाओं काफी अधिक स्थिर हैं और जब उचित प्रक्रिया का पालन कर रहे हैं, खून बह रहा है और प्लाज्मा कोशिकाओं से जुदाई के दौरान पूरी तरह से बारीक रहते हैं.
  5. कई एजेंटों के लिए खून बह रहा निम्न रक्त कोशिकाओं (LPS मुक्त 3% NaCl में 10 मिमी कैफीन के 0.25 मात्रा में खून) कैफीन 4 propranolol (1 मिमी अंतिम एकाग्रता) 5, dimethylsulfoxide 6, द्विसंयोजक कटियन केलेशन सहित, स्थिर सूचित किया गया है ( 0.1 एम dextrose, 0.03 एम सोडियम साइट्रेट, 0.026 एम साइट्रिक एसिड, 10 मिमी disodium ethylenediaminetetraacetic एसिड (ना 2 EDTA), 4.6 पीएच) 7, जी प्रोटीन और phospholipase - सी रास्ते inhibitors (हैजा और एक बराबर मात्रा में खून विषाक्त पदार्थों pertussus, U73122) 8, क्लोराइड की isethionate 9 आयनों, क्लोराइड चैनल 9 ब्लॉकर्स, चक्रीय एएमपी 9 गरम, sulfhydryl अभिकर्मकों (5 मिमी एन एथिल maleimide NEM) 5, और झिल्ली सक्रिय डिटर्जेंट बीच 20 के साथ प्रतिस्थापन ( 0.1 मात्रा 2% बीच में LPS मुक्त 0.5 एम NaCl-20) में खून.

आपूर्ति और घोड़े की नाल केकड़े खून बह रहा करने के लिए अभिकर्मकों: खून की बड़ी मात्रा का संग्रह

  1. एक या एक से अधिक बड़े, undamaged घोड़े की नाल केकड़े
  2. धार 70% इथेनॉल युक्त बोतल
  3. Kimwipes
  4. 14 गेज सुई
  5. मजबूत संदंश
  6. बर्फ के साथ बर्फ बाल्टी
  7. 50 एमएल पेंच टोपी प्लास्टिक डिस्पोजेबल अपकेंद्रित्र ट्यूबों
  8. 50 एमएल ट्यूबों पकड़ रैक
  9. काउंटर शीर्ष अपकेंद्रित्र
  10. बाँझ 50 एमएल सीरम वैज्ञानिक pipettes
  11. बल्ब प्रकार विंदुक भराव
  12. डिस्पोजेबल बाँझ फिल्टर तंत्र
  13. वेक्यूम - पंप
  14. LPS मुक्त 3% NaCl समाधान (रक्त कोशिकाओं के संग्रह के लिए)
  15. बीच 20 (रक्त कोशिकाओं के संग्रह के लिए)

बड़ी मात्रा रक्तस्राव के लिए तैयारी

  1. खून बह रहा है के लिए, बड़े, undamaged जानवरों का उपयोग करें. जानवर खून बह रहा से पहले एक ठंडे कमरे में 1 घंटे के लिए शांत रहो.
  2. एक बर्फ बाल्टी है कि लगभग 0.3 मीटर (ठंड या जमे हुए अभिकर्मकों मेलिंग के लिए डिस्पोजेबल स्टायरोफोम शिपिंग कंटेनर उपयुक्त है) उच्च और ऑपरेटर के लिए एक कम कुर्सी के लिए एक स्थिर समर्थन के साथ एक आरामदायक व्यवस्था स्थापित करना. बर्फ बाल्टी का समर्थन संरचना पर रखा गया है और कुर्सी तैयार की हैइस इकाई के लिए. आप अपनी कोहनी को अपनी जांघों पर आराम के साथ कुर्सी पर एक विस्तारित अवधि के लिए आराम से बैठे होना चाहिए, और बाएँ हाथ के साथ एक संघर्ष घोड़े की नाल रक्त संग्रह ट्यूब बर्फ बाल्टी में बर्फ की एक बिस्तर में सीधा खड़ा ऊपर तैनात केकड़ा पकड़.
  3. प्री - सर्द 4 - 50 एमएल बर्फ स्नान में पेंच closures के साथ डिस्पोजेबल प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूबों के 6. ट्यूबों ईमानदार बर्फ स्नान कंटेनर की परिधि के चारों ओर बर्फ लेकर में स्थापित कर रहे हैं. बस खून बह रहा है आपरेशन शुरू करने से पहले, और ट्यूबों बगल की मेज पर जगह टोपियां टोपी निकालने के लिए, बाँझ तकनीक का पालन.
  4. एक 14 गा सुई की टोपी निकालें और तगड़ा संदंश का उपयोग करने के लिए अपनी आस्तीन में सुई ढीला है, लेकिन आस्तीन से हटाने सुई नहीं है. बाँझपन बनाए रखने. उंगलियों के साथ सुई के किसी भी हिस्से को छूना मत. सुई के बट उजागर के साथ एक आसन्न काउंटर पर सुई के साथ प्लेस आस्तीन किसी को अपनी बाँझपन बनाए रखने की सतह के साथ संपर्क से ऊंचा.
  5. 70% इथेनॉल के साथ एक Kimwipe गीला.

रक्तस्राव जानवर (विशेष रूप से दाएँ हाथ के ऑपरेटर के लिए )

  1. समझ जानवर बाएं हाथ में prosoma के पूर्वकाल निकला हुआ किनारा और पूंछ (टर्मिनल बे) के आधार पर opisthosma के पीछे भाग लोभी अंगूठे के साथ चार उंगलियों के साथ संपर्क में रक्तस्राव के लिए: पशु होल्डिंग. जानवर के ventral सतह अपने हाथ की हथेली का सामना कर रहा है. Telson अंगूठे और कलाई पर परियोजनाओं के आधार के साथ निहित है. जानवर धीरे इतना है कि prosoma और opisthosoma सही कोण पर एक दूसरे (चित्रा 3a) हैं फ्लेक्स.

    चित्रा 3

    चित्रा 3

  2. साफ उजागर काज संयुक्त जोड़ने prosoma और 70% इथेनॉल के साथ opisthosoma के साथ लागू एक इथेनॉल सिक्त Kimwipe (चित्रा 3b).
  3. 4 ऊपरवाला और जानवर की पृष्ठीय सतह ऊपर चेहरे हैं - बाएँ ऐसे हाथ में है कि 2 उंगलियों घुमाएँ. दाहिने हाथ के साथ, 14 गा सिरिंज सुई डालने अभी भी अपनी सुरक्षात्मक आस्तीन में 2 बाएं हाथ की उंगलियों और 3 के बीच. दाहिने हाथ में संदंश ले लो और अपने सुरक्षात्मक आस्तीन से सुई संदंश (चित्र -3 सी) के साथ बट लोभी द्वारा हटायें. बाएं हाथ घुमाएँ इतना कि हाथ की पृष्ठीय सतह अपने बाएँ अंगूठे, चेहरे और तर्जनी और पशु उल्टा अपने पृष्ठीय सतह के साथ दाहिने हाथ का सामना करना पड़. ऊपर 50 एमएल संग्रह ट्यूबों और पूरबी जानवर इतना है कि सुई के तेज अंत संयुक्त और इतना है कि सुई शाफ्ट पृष्ठीय midline (चित्रा 3 डी) के समानांतर है काज पर बताया है की पहली सुई की बट स्थिति. काज संयुक्त के माध्यम से दिल के लुमेन में सुई के तेज अंत सम्मिलित सुई के समानांतर पृष्ठीय midline तैनात है और midline और अभी भी संग्रह ट्यूब के उद्घाटन के ऊपर तैनात सुई के बट के साथ सम्मिलित रखने. 2 सेमी prosoma में दिल के हिस्से में गहरी सुई के बारे में 1 डाला जाता है. जैसे ही दिल हवा निकाल है, रक्त तेजी से प्रवाह (चित्रा 4a, तीर) होगा, तो यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि सिरिंज सुई की डिलीवरी अंत संग्रह ट्यूब के मुँह पर तैनात है खून की है कि प्रारंभिक उछाल लेने है.
  4. के 50 एमएल रक्त एकत्र किया गया है, व्यक्तिगत बूँदें (चित्रा 4b) के लिए धीमी हो जाएगी - रक्त एक सतत स्ट्रीम है कि, के बारे में 30 के बाद हृदय में शुरू में बाहर निकल जाएगा. रक्त प्रवाह में सुधार करने के लिए, यह फिर उन्मुख थोड़ा सुई की नोक के लिए अच्छी नीति हो सकता है. सुई झुकाएँ ऊपर या नीचे, बाएँ या दाएँ, इसके टिप गहरा दिल में या स्लाइड यह स्थिति है कि रक्त के प्रवाह का अनुकूलन खोजने के लिए संयुक्त काज के लिए करीब खींच. जरूरत से ज्यादा जानवर सेक, क्योंकि इस जोखिम जानवर हानिकारक और extravasated रक्त के थक्के आरंभ करने के लिए कारण हो सकता है मत करो.

    चित्रा 4

    चित्रा 4

  5. के रूप में प्रत्येक संग्रह ट्यूब खून से भर जाता है, बर्फ स्नान बारी बारी से करने के लिए सुई की डिलीवरी अंत नीचे अगले खाली ट्यूब लाने.
  6. के रूप में खून बह रहा धीमा कर देती है, तो आप सुई में और दिल में एक प्रतिगामी दिशा में हवा का प्रवाह होने के जोखिम को चलाते हैं. यह तब होता है जब पशु बाहर straightens होते हैं, जिससे रक्तचाप को कम कर सकते हैं. Flexed स्थिति में जानवर को बनाए रखने के द्वारा या केवल धीरे धीरे होते सीधे अनुमति देकर इस को रोकने की कोशिश करो.
  7. जब जानवर खून देने बंद हो जाता है, दिल से खून बह रहा सुई को हटा दें. पुनः टोपी संग्रह ट्यूब और टेबल टॉप अपकेंद्रित्र, RPM को 1000, 5 मिनट में तुरंत अपकेंद्रित्र. रक्त कोशिकाओं संग्रह ट्यूबों के नीचे कॉम्पैक्ट छर्रों बनेगी. क्योंकि रक्त के थक्के के लिए घटकों के सभी रक्त कोशिकाओं की स्रावी vesicles भीतर समाहित कर रहे हैं, के रूप में प्लाज्मा के रूप में जल्द ही कोशिकाओं से अलग है,प्लाज्मा के थक्के के जोखिम को समाप्त हो रहा है.
  8. यह extravasated रक्त के थक्के से बचने के जरूरी है. जानवर के कोमल से निपटने; तेज़ी के साथ जो रक्त सिरिंज सुई से बाहर बहती है की कमी, रक्त की centrifugation तुरंत पूर्व द्रुतशीतन जानवर और एक बर्फ स्नान में संग्रह ट्यूबों को बनाए रखने: निम्नलिखित उपायों के थक्के के जोखिम को कम करने बाद संग्रह, endotoxin के साथ और सुई संग्रह ट्यूबों के संक्रमण से बचाव, बाँझ प्रक्रिया के रखरखाव. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया था, कुछ व्यक्तिगत पशुओं, विशेष रूप से चिड़चिड़ा रक्त कोशिकाओं है कि exocytosis भी आरंभ जब इन सावधानियों का पालन कर रहे हैं.
  9. Centrifugation के बाद, रक्त के थक्के के लक्षण के लिए ट्यूबों का निरीक्षण - कोशिकाओं और पतला थक्का सामग्री की किस्में ट्यूब की दीवारों से जुड़ी, थक्का के शीर्ष पर चिपचिपा सामग्री, या बुरा, में फँस रक्त कोशिकाओं के साथ थक्का की बड़ी मात्रा में द्रव स्तंभ (चित्रा 4c, तीर). इन ट्यूबों से सामग्री, प्लाज्मा नहीं सीरम है, और रक्त कोशिकाओं के secreted उत्पादों शामिल हैं.
  10. बाँझ ट्यूबों 50 एमएल बाँझ सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ प्लाज्मा स्थानांतरण. जब सेल गोली से ट्यूब के तल में कक्षों की किसी aspirating से बचने pipetting देखभाल व्यायाम. यह सबसे अच्छा है सेल गोली परेशान करने से बचने के लिए गोली के ऊपर एक प्लाज्मा की कुछ एमएल छोड़.
  11. ऊपर वर्णित की प्रक्रिया प्लाज्मा के बड़ी मात्रा में रक्त कोशिकाओं की स्रावी उत्पादों द्वारा पवित्र इकट्ठा करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. धोया रक्त कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में एकत्र करने के लिए, 3% के LPS मुक्त NaCl समाधान में भंग 2% बीच 20 के 0.1 मात्रा में रक्त एकत्र. कोशिकाओं को धीरे से 10 मिनट के लिए एक ढीला सेल गोली स्थापित अपकेंद्रित्र, तो LPS मुक्त 3% NaCl के कई परिवर्तनों के साथ कोशिकाओं को धो लो. कोशिकाओं है कि रक्त कोशिकाओं की स्रावी उत्पादों की एक निकालने LPS मुक्त आसुत पानी में धोया कोशिकाओं lysing द्वारा तैयार किया जा सकता है. यह lysate प्रोटीन और पेप्टाइड्स है कि विरोधी माइक्रोबियल प्रतिरक्षा 10,11 रक्षा में संचालित की एक विविध सरणी में शामिल है और भी coagulogen, कोशिकी खून का थक्का के संरचनात्मक प्रोटीन के zymogen रूप, और proteases कि coagulin coagulogen में कनवर्ट का संग्रह होता है, प्रोटीन है कि थक्का 12 के तंतुओं में polymerizes के रूप में . यह निकालने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पाद, Limulus amebocyte lysate या लाल, जो 13 lipopolysaccharide की उपस्थिति के लिए परख करने के लिए प्रयोग किया जाता है समान है. protease coagulogen के proteolytic coagulin संशोधन के लिए जिम्मेदार झरना 14 LPS द्वारा सक्रिय है .
  12. पशुओं के खून बह रहा है के बाद अधिकार है. ऊपर की पहचान की विधियों द्वारा आयोजित रक्तस्राव अच्छी तरह से जानवर द्वारा सहन है. जब समुद्री जैव प्रयोगशाला में वुड्स होल पर काम कर रहे हैं, मैं उम्मीद है कि वे बच जाएगा के साथ खून बह रहा करने के बाद सागर के लिए पशुओं वापसी. यदि जानवरों घोड़े की नाल केकड़े की सामान्य श्रेणी से दूर aquaria में रखा जाता है, वे बार - बार लहूलुहान किया जा सकता है एक या दो बार एक महीने. जैसा कि नीचे वर्णित है, कैद में रखे पशुओं के उच्च गुणवत्ता वाले पानी और अक्सर खिला उनके स्वास्थ्य बनाए रखने के लिए आवश्यकता होती है. इच्छामृत्यु पृष्ठीय नाड़ीग्रन्थि है, जो आंखों के बीच पृष्ठीय midline में स्थित है के विनाश के द्वारा पूरा किया जा सकता है.

और प्लाज्मा प्रसंस्करण और भंडारण

  1. Proteases से संरक्षण. यदि प्लाज्मा प्रोटीन शुद्धीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, यह संग्रह के तुरंत बाद protease inhibitors के साथ इलाज किया जाना चाहिए. 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) जोड़ें. PMSF DMSO या इथेनॉल में 0.1 एम शेयर समाधान के रूप में रखा है. यह 15 पानी में काफी अस्थिर है, इसलिए स्थायी सुरक्षा के लिए पर भरोसा नहीं कर सकते हैं, लेकिन प्लाज्मा के रक्त कोशिकाओं से जुदाई के बाद तुरंत अलावा proteases की छोटी मात्रा में है कि कोशिकाओं से जारी किया गया हो सकता है निष्क्रिय करेगा.
  2. बाँझ निस्पंदन: वैक्यूम के अंतर्गत एक डिस्पोजेबल मध्यम निस्पंदन 0.22 मिमी ताकना फिल्टर के साथ फिट डिवाइस का उपयोग ultrafiltration द्वारा प्लाज्मा बाँझ. इन फिल्टर एक प्रवृत्ति को रोकना है. यह सलाह दी जाती है इस समस्या को कम करने के लिए फ़िल्टरिंग से पहले प्लाज्मा अपकेंद्रित्र है. यदि प्लाज्मा की बड़ी मात्रा में संसाधित कर रहे हैं, यह पूर्व फिल्टर प्लाज्मा पहले एक 1 मिमी रोमकूप आकार के साथ एक Millipore फिल्टर का उपयोग करते हुए, फिर 0.45 मिमी ताकना आकार Millipore फिल्टर के साथ करने के लिए सलाह दी जाती है.
  3. प्लाज्मा बैक्टीरियल संक्रमण से बचाया जा सकता है या तो 0.2 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता NaN 3 जोड़ने या बाँझ निस्पंदन द्वारा . Unsterile प्लाज्मा इन विरोधी बैक्टीरियल कदम उठाए जा रहा है एक या दूसरे के बिना 2 दिनों की तुलना में लंबी अवधि के लिए कभी नहीं रखना चाहिए.
  4. रक्त के थक्के. स्तनधारी थक्के प्रणाली के विपरीत, Limulus प्लाज्मा रक्त के थक्के के लिए तत्वों में से कोई भी शामिल हैं. इसके बजाय, थक्का गठन, थक्का के संरचनात्मक प्रोटीन (coagulogen) और proteases की व्यवस्था के लिए पूरे तंत्र कि प्रक्रिया coagulogeयह अघुलनशील थक्का में polymerizing में सक्षम सौंपनेवाला n, रक्त 16 कोशिकाओं के स्रावी granules में पाया जाता है. तो अगर रक्त कोशिकाओं को हटा रहे हैं इससे पहले कि वे एक मौका exocytosis गुजरना है, प्लाज्मा थक्के के लिए प्रोटीन की पूरी तरह से स्वतंत्र है और तरल पदार्थ अनिश्चित काल रहेगा.
  5. प्रोटीन शुद्धि. Hemocyanin 40 मिलीग्राम / एमएल प्लाज्मा में में मौजूद है और एक 70 केडीए सबयूनिट के 48 मेर है. यह ultracentrifugation (+४०,००० एक्स जी, 8 घंटे) या एक बड़े जैसे BioGel 17 A5m ताकना आकार अपवर्जन राल के साथ जेल निस्पंदन द्वारा अलग किया जा सकता है . सी प्रतिक्रियाशील प्रोटीन 1 में मौजूद हैं - 5 मिलीग्राम / एमएल और phosphorylethanolamine Sepharose पर आत्मीयता अलगाव से अलग किया जा सकता है, एक कैल्शियम 18 chelator के साथ elution के साथ. व्यापक स्पेक्ट्रम protease अवरोध करनेवाला, एक 2 macroglogulin, Sephacryl पर जेल छानने का काम किया गया है द्वारा शुद्ध hemocyanin और सी प्रतिक्रियाशील प्रोटीन 19 S-300 राल के बाद हटा दिया गया है.

चलता - फिरता संस्कृति में रक्त कोशिकाओं का सूक्ष्म परीक्षण

  1. इन विट्रो में amebocyte लॉन की स्थापना: LPS मुक्त 3% NaCl समाधान बाँझ प्लास्टिक पेट्री शैली संस्कृति व्यंजन (35 मिमी पकवान, एक 60 मिमी पकवान के लिए 2.5 एमएल, एक 90 एमएल डिश के लिए 6 एमएल के लिए 1 एमएल) के लिए जोड़ा जाता है. रक्त तो हृदय की विधि ऊपर वर्णित का उपयोग पंचर के द्वारा प्राप्त की है, लेकिन संशोधन है कि एक 23, बाँझ सिरिंज सुई में गेज 1 के बजाय 14 गेज सुई के प्रयोग किया जाता है के साथ. रक्त 23 गेज सुई से ड्रॉप द्वारा ड्रॉप बहती है और 1 ड्रॉप 35 मिमी पकवान, 60 मिमी डिश में 3 बूँदें, और 100 मिमी डिश में 9 बूँदें में एकत्र किया जाता है. रक्त कोशिकाओं तो 3% कोमल घूमता एक परिपत्र पैटर्न में पहला है, तो वापस और आगे NaCl समाधान में समान रूप से मिश्रित. तैयारी कमरा टी पर 5 मिनट के लिए incubated रक्त कोशिकाओं पकवान की सतह को संलग्न करने की अनुमति है, तो प्रारंभिक खारा 3 पसंद का एक बफर के साथ बदल दिया है.
  2. यदि यह बुनियाद संलग्न एक undegranulated हालत में रक्त कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए वांछित है, प्रारंभिक प्लाज्मा खारा रक्त मिश्रण ताजा LPS मुक्त 3% NaCl के साथ बदल दिया है. प्लाज्मा LPS के अभाव में भी रक्त कोशिकाओं की सहज degranulation accelerates, और उसके हटाने कक्षों की undegranulated स्थिति स्थिर है.
  3. यदि प्रारंभिक खारा बाँझ प्लाज्मा के साथ प्रतिस्थापित किया गया है, रक्त कोशिकाओं परिसंचारी रक्त कोशिका (छवि 5) के ovoid आकार से बदलने और बुनियाद पर समतल, और फिर degranulation और coagulin कोशिकी खून का थक्का की एक परत के गठन आरंभ चपटा 20 amebocytes के लॉन के ऊपर है.

    चित्रा 5

    चित्रा 5

  4. एकत्रित amebocytes के explant संस्कृतियों की स्थापना. जब रक्त, बाँझ, LPS मुक्त शर्तों के तहत एकत्र किया जाता है, रक्त कोशिकाओं निलंबन और कुल से बाहर बसने के लिए ऊतक की तरह एक बड़े पैमाने पर फार्म. इस के लिए एक सुविधाजनक कंटेनर कांच भ्रूण पकवान ऊष्मायन द्वारा LPS - मुक्त 180 सी 0 में 4 घंटे के लिए प्रदान की गई है हृदय पंचर द्वारा एक 19 गेज सुई का उपयोग कर इस कंटेनर में एकत्र रक्त के 1 के लिए incubated है - कमरा टी, तो टुकड़े 1 मिमी वर्ग एक बाँझ 18 गेज सिरिंज सुई के साथ amebocyte कुल से काट रहे हैं पर 2 घंटे रहे हैं और दो coverglasses या एक के बीच sandwiched coverglass और एक coverglasses के टुकड़े द्वारा अलग स्लाइड spacers के रूप में कार्य. लगभग आधे घंटे के बाद, amebocytes explant की परिधि से coverglass (6a छवि), जहाँ वे चरण विपरीत या डीआईसी 21 प्रकाशिकी के साथ देखा जा सकता है पर पलायन शुरू. प्रारंभ में, पलायन कोशिकाओं कि प्रवास बुनियाद के ऊपर बढ़ा रहे हैं Hyaline pseudopods (छवि 6b (एम)) के साथ कॉम्पैक्ट है, और तो है कि सतह के साथ संपर्क में कम कर रहे हैं और आगे गति pseudopod 22 में दानेदार cytoplasm से प्रवाह शामिल . बाद में, कोशिकाओं (छवि 6b (च)) समतल और degranulation आरंभ (छवि 6b (घ)) और 23 हरकत संघर्ष. संस्कृति चैम्बर यहाँ वर्णित संस्कृति कक्ष में विभिन्न प्रयोगात्मक एजेंटों के छिड़काव सेल गतिशीलता और ग्रेन्युल 9 exocytosis पर उनके प्रभाव की जांच करने के लिए अनुमति देता है. सूक्ष्म परीक्षा के लिए एक विस्तारित amebocyte संस्कृति के methodological समीक्षा 24 में पाया जा सकता है है .

    चित्रा 6

    चित्रा 6

Aquaria में वयस्क घोड़े की नाल केकड़े का रखरखाव

घोड़े की नाल केकड़े उच्च गुणवत्ता समुद्र के पानी की आवश्यकता होती है और एक जल शोधन प्रणाली है कि कण निस्पंदन, वातन और 25 पानी की अनाइट्रीकरण प्रदान करता है के साथ फिट aquaria में बनाए रखा जा सकता है. पशु चिंराट, झींगा, मछली, या विद्रूप पर 2 या 3 बार एक हफ्ते खिलाया जाना चाहिए. दूध पिलाने से मछलीघर, पीएलए जानवर को हटाने के द्वारा पूरा किया हैइसे अपनी पीठ पर cing, और मुँह पर खाना रखने. भूख अगर, पशु को जल्द ही भोजन निगलने शुरू हो जाएगा. समुद्र के पानी की व्यवस्था के परिष्कार पर निर्भर करता है, जानवर या तो एक घंटे के लिए बनाए रखा जाना चाहिए जब तक यह समुद्र के पानी की एक अलग कंटेनर में defecates या यह एक्वैरियम के लिए लौटा जा सकता है के बाद खिला शुरू कर दिया है. लंबी अवधि के रखरखाव के लिए, पशु प्रकाश से दूर रखा चाहिए कछुवे की पीठ की हड्डी की सतह पर हरे या नीले हरे शैवाल के विकास को रोकने. शैवाल इरोड कछुवे की पीठ की हड्डी और के बाद से वयस्क गिरना नहीं करता है, इस मौत 26 पशु के लिए कारण होगा. जंगली जानवरों आंशिक रूप से रेत में दफन समय की बहुत खर्च करते हैं, लेकिन मछलीघर में रेत या बजरी के लंबी अवधि के रखरखाव के लिए सफाई का स्तर महत्वपूर्ण बनाए रखने में कठिनाई प्रस्तुत.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

वहाँ घोड़े की नाल केकड़े की चार प्रजातियां, उत्तर अमेरिका के पूर्वी तट और तीन है कि जापान से बंगाल की खाड़ी सीमा प्रजातियों से Limulus polyphemus हैं. जानवर एक "जी" जीवाश्म के रूप में पहचान की है, क्योंकि इसी तरह रूपों anatomically 445 मिलियन साल पहले से 27 किया गया है जीवाश्म के रूप में पाया. घोड़े की नाल केकड़े एक लंबे समय रहते जानवर का प्रतिनिधित्व करता है, की आवश्यकता है 10 - 13 साल के लिए परिपक्वता तक पहुँच और कम से कम 20 28 साल के रहने वाले हैं. हालांकि यह मछली और शंख 29 मत्स्य पालन के लिए चारे के रूप में व्यापक कटाई के अधीन किया गया है, अमेरिकी घोड़े की नाल केकड़े अभी भी यथोचित बहुतायत है और एक छोटे से वयस्क से खून की 50 एमएल की गैर विनाशकारी संग्रह और एक से के रूप में ज्यादा के रूप में 400 एमएल की अनुमति देता है बड़े महिला. यह भी ज्यादा खून का संग्रह कम से कम 10 मिनट में पूरा किया जा सकता है. मैं कोई अन्य आसानी से उपलब्ध invertebrate है कि इतने कम प्रयास के साथ इतना खून परमिट के बारे में पता.

endotoxin के लिए लाल परीक्षण के महत्व को, ग्राम नकारात्मक जीवाणुओं की उपस्थिति के लिए एक संकेतक, घोड़े की नाल केकड़े 13 की प्रतिरक्षा प्रणाली में ब्याज उत्तेजित है . लाल परीक्षण बाहर पढ़ने के थक्का बनने की या protease गतिविधि के लिए एक वर्णमिति परख के साथ, 14 LPS द्वारा रक्त के थक्के प्रणाली की शुरुआत protease के सक्रियण पर निर्भर करता है. रोगक्षमता है कि सबसे बड़ा ध्यान प्राप्त हुआ है के दो तत्वों प्लाज्मा प्रोटीन और रक्त कोशिकाओं की स्रावी granules के कई प्रोटीन और पेप्टाइड किया गया है. परिणाम किसी भी लंबे समय रहते 11 invertebrate के लिए सबसे अच्छा वर्णित प्रतिरक्षा प्रणाली होने की स्थिति के लिए घोड़े की नाल केकड़े के उन्नयन किया गया है

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ऊपर वर्णित मूल अनुसंधान NSF अनुदान 0344630 द्वारा समर्थित किया गया.

References

  1. Lochhead, J. H. Selected Invertebrate Types. Brown, F. A. , John Wiley and Sons, Inc. New York, NY. 360-381 (1950).
  2. Shuster, C. N. The circulatory system and blood of the horseshoe crab Limulus polyphemus L.: a review. US Dept Energy, Fed Regul. Comm. , Washington. (1978).
  3. Conrad, M. L., Pardy, R. L., Wainwright, N., Child, A., Armstrong, P. B. Response of the blood clotting system of the American horseshoe crab, Limulus polyphemus, to a novel form of lipopolysaccharide from a green alga. Comp Biochem. Physiol A Mol. Integr. Physiol. , 144-423 (2006).
  4. Nakamura, T., Morita, T., Iwanaga, S. Intracellular proclotting enzyme in limulus (Tachypleus tridentatus) hemocytes: its purification and properties. J. Biochem. (Tokyo. 97, 1561-1574 (1985).
  5. Levin, J., Ornberg, R. L. Blood Cells of Marine Invertebrates: Experimental Systems in Cell Biology and Comparative Physiology. Cohen, W. D. , Alan R. Liss, Inc.. New York, NY. 259-260 (1985).
  6. Liang, S. M., Liu, T. Y. Studies on the Limulus coagulation system: inhibition of activation of the proclotting enzyme, by dimethyl sulfoxide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 105, 553-559 (1982).
  7. Soderhall, K., Smith, V. J. Separation of the haemocyte populations of Carcinus maenas and other marine decapods, and prophenoloxidase distribution. Dev. Comp Immunol. 7, 229-239 (1983).
  8. Solon, E., Gupta, A. P., Gaugler, R. Signal transduction during exocytosis in Limulus polyphemus granulocytes. Dev. Comp. Immunol. 20, 307-321 (1996).
  9. Armstrong, P. B., Rickles, F. R. Endotoxin-induced degranulation of the Limulus amebocyte. Exp. Cell Res. 140, 15-24 (1982).
  10. Iwanaga, S., Kawabata, S. Evolution and phylogeny of defense molecules associated with innate immunity in horseshoe crab. Front Biosci. Shuster, C. N., Barlow, R. B., Berkman, L., Brockmann, H. J. 3, (1998).
  11. Armstrong, P. B. The American Horseshoe Crab. , Harvard University Press. Cambridge, MA. 288-309 (2003).
  12. Iwanaga, S. The limulus clotting reaction. Curr. Opin. Immunol. 5, 74-82 (1993).
  13. Levin, J. The Limulus amebocyte lysate test: perspectives and problems. Prog. Clin. Biol. Res. 231, 1-23 (1987).
  14. Koshiba, T., Hashii, T., Kawabata, S. A structural perspective on the interaction between lipopolysaccharide and factor C, a receptor involved in recognition of Gram-negative bacteria. J. Biol. Chem. 282, 3962-3967 (2007).
  15. James, G. T. Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers. Anal. Biochem. 86, 574-579 (1978).
  16. Murer, E. H., Levin, J., Holme, R. Isolation and studies of the granules of the amebocytes of Limulus polyphemus, the horseshoe crab. J. Cell Physiol. 86, 533-542 (1975).
  17. Decker, H., Ryan, M., Jaenicke, E., Terwilliger, N. SDS induced phenoloxidase activity of hemocyanins from Limulus polyphemus, Eurypelma californicum and cancer. , 276-17796 (2001).
  18. Armstrong, P. B. A cytolytic function for a sialic acid-binding lectin that is a member of the pentraxin family of proteins. J. Biol. Chem. 271, 14717-14721 (1996).
  19. Armstrong, P. B., Melchior, R., Quigley, J. P. Humoral immunity in long-lived arthropods. J. Insect Physiol. 42, 53-64 (1996).
  20. Armstrong, P. B., Armstrong, M. T. The decorated clot: Binding of agents of the innate immune system to the fibrils of the limulus blood clot. Biol. Bull. 205, 201-203 (2003).
  21. Armstrong, P. B. Interaction of the motile blood cells of the horseshoe crab, Limulus. Studies on contact paralysis of pseudopodial activity and cellular overlapping in vitro. Exp. Cell Res. 107, 127-138 (1977).
  22. Armstrong, P. B. Motility of the Limulus blood cell. J. Cell Sci. 37, 169-180 (1979).
  23. Armstrong, P. B. Adhesion and spreading of Limulus blood cells on artificial surfaces. J. Cell Sci. 44, 243-262 (1980).
  24. Armstrong, P. B. Blood Cells of Marine Invertebrates. Lab. Animal. Cohen, W. D. , A.R. Liss. New York, NY. 253-258 (1985).
  25. Smith, S. A., Berkson, J. Laboratory culture and maintenance of the horseshoe crab (Limulus polyphemus). Lab. Animal. 34, 27-34 (1980).
  26. Leibovitz, L., Lewbart, G. A. The American Horseshoe Crab. Shuster, C. N., Barlow, R. B., Brockmann, H. J. , Harvard University Press. Cambridge, MA. 245-275 (2003).
  27. Rudkin, D. M., Young, G. A., Nowlan, G. S. The oldest horseshoe crab: a new xiphosurid from Late Ordovician Konservat-Lagerstatten deposits. Palaeontology. 51, Manitoba, Canada. 1-9 (2008).
  28. Shuster, C. N., Sekiguchi, K. The American Horseshoe Crab. Shuster, C. N., Barlow, R. B., Brockmann, J. J. , Harvard University Press. Cambridge, MA. 103-132 (2003).
  29. Walls, E. A., Berkam, J., Smith, S. A. The horseshoe crab, Limulus polyphemus, 200 million years of existence, 100 years of study. Rev. Fisheries Sci. 10, 39-73 Forthcoming.
  30. Patten, W. The Evolution of the Vertebrates and Their Kin. P. Blakiston's Son and Co. , Philadelphia, PA. 195-209 (1912).

Tags

इम्यूनोलॉजी 20 अंक घोड़े की नाल केकड़े Limulus polyphemus Limulus amebocyte Limulus रक्त प्लाज्मा रक्त संग्रह
अमेरिकी घोड़े की नाल केकड़े, Limulus Polyphemus से रक्त संग्रह
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Armstrong, P., Conrad, M. Blood… More

Armstrong, P., Conrad, M. Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus. J. Vis. Exp. (20), e958, doi:10.3791/958 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter