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Biology

Extracción de sangre del cangrejo herradura de América, Limulus polyphemus

Published: October 13, 2008 doi: 10.3791/958
Automatic Translation
1,2, 3
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Davis, 2Marine Biological Laboratory - MBL- woods hole, 3Department of Biological Sciences, Hunter College of CUNY

Summary

El cangrejo de herradura de América, Limulus polyphemus, es sin duda la fuente más conveniente para grandes cantidades de sangre de cualquier invertebrado. La sangre es simple en su composición, con un solo tipo de células en la circulación general, los amebocitos granular, y sólo tres abundantes proteínas en el plasma, la hemocianina, la proteína C-reactiva, y la α2-macroglobulina. La sangre se recoge desde el corazón y las células de la sangre y el plasma se separa por centrifugación.

Abstract

El cangrejo de herradura tiene el mejor sistema caracterizado inmune de cualquier invertebrado de larga duración. El estudio de la inmunidad de los cangrejos de herradura ha sido facilitada por la facilidad en la recolección de grandes volúmenes de sangre y de la simplicidad de la sangre. Los cangrejos de herradura mostrar sólo un solo tipo de células en la circulación general, los amebocitos granular. El plasma tiene el contenido de sal del agua del mar y sólo tres abundantes proteínas, hemocianina, la proteína de las vías respiratorias, las proteínas C-reactivas, que funcionan en la destrucción citolítica de las células extranjeras, incluyendo las células bacterianas, y α2-macroglobulina, que inhibe las proteasas de los patógenos invasores. La sangre se recoge mediante punción cardíaca directa en las condiciones que reduzcan al mínimo la contaminación por lipopolisacárido (endotoxina aka, LPS), un producto de las bacterias Gram-negativas. Un animal grande puede producir 200 a 400 ml de sangre. Para el estudio del plasma, células de la sangre inmediatamente eliminado del plasma por centrifugación y el plasma puede ser fraccionado en sus proteínas constituyentes. Las células sanguíneas se encuentran convenientemente estudiado microscópicamente mediante la recopilación de pequeños volúmenes de sangre en LPS libres de solución salina isotónica (0,5 M NaCl) bajo condiciones que permitan el examen microscópico directo mediante la colocación de uno de los más LPS libres de cubres en la superficie del plato de cultivo, y luego montar los cubres en las cámaras de la simple observación después de la adhesión celular. Una segunda preparación para la observación directa es recoger 3 a 5 ml de sangre en un plato de embriones libres de LPS y luego explantar fragmentos de amebocytes agregados a una cámara que sandwiches el tejido entre un portaobjetos y cubreobjetos uno. En esta preparación, el amebocytes móviles migran hacia la superficie cubre objetos, donde fácilmente se puede observar. El sistema de coagulación de la sangre consiste en la agregación de amebocytes y la formación de un coágulo extracelular de una proteína, coagulin, que se libera de los gránulos secretores de las células sanguíneas. El análisis bioquímico de las células de sangre lavada requiere que la agregación y degranulación no se produce, lo cual puede lograrse mediante la recolección de sangre en 0,1 volúmenes de 2% de Tween-20, 0,5 M LPS sin NaCl, seguido de centrifugación de las células y el lavado con 0,5 M NaCl.

Protocol

Las características anatómicas del cangrejo herradura correspondiente a la hemorragia (Fig. 1)

Figura 1

Figura 1

  1. Las tres divisiones principales del cuerpo, de adelante hacia atrás, son el prosoma (P), el opistosoma (O), y el telson (T) 1.
  2. Los márgenes de libertad anterior y lateral del prosoma es la brida.
  3. El sangrado posterior-la mayoría de los opistosoma, donde se articula el telson, es la bahía de terminales.
  4. La articulación donde el prosoma y opistosoma la articulación es la bisagra (H).
  5. El corazón se encuentra a lo largo de la línea media dorsal, justo debajo de la caparazón del opistosoma prostoma y 2 (Fig. 2).


    Figura 2

    Figura 2

Consideraciones generales, la esterilidad y la protección contra la exposición al lipopolisacárido (endotoxina)

  1. El mayor enemigo del éxito es sangrar aglutinación de células, la exocitosis y la formación del coágulo coagulin. La agregación de células y la exocitosis son estimulados por lipopolisacárido (endotoxina aka, LPS), un producto de las bacterias Gram-negativas. El umbral de concentración de LPS para la exocitosis de células lavadas es de 0,1 - 1 mg / ml, pero las células suspendidas en el plasma son activados por concentraciones significativamente más bajas 3. Endotoxina no se inactiva en autoclave simple y se puede suponer que se presente en las superficies y en las soluciones y reactivos que no están certificados como libres de endotoxinas.
  2. Para reducir las posibilidades de la coagulación durante la recolección de sangre, seleccione sólo perfecto, los animales en buen estado para el sangrado. Pre-enfriamiento de los animales 01.02 h en la sala de 4 ° C. Práctica de una técnica estéril. Evitar la contaminación con endotoxinas.
  3. LPS solución salina libre de 3% se utiliza en la medicina clínica y pueden ser adquiridos de proveedores médicos (ver tabla de reactivos especializados y suministros). LPS puede ser removido de vidrio y metal de incubación a 180 º C durante 4 horas. Estéril de un solo uso agujas de jeringas, Petri estilo placas de cultivo, y con tapa de rosca tubos de centrifugación son LPS libre y puede ser utilizado sin modificaciones, siempre y cuando la técnica estéril apropiada se practica.
  4. La estabilidad de las células de sangre de diferentes animales es diferente, con las células de algunos animales individuales sometidos a la degranulación espontánea, lo que resulta en la formación del coágulo coagulin, incluso cuando el animal está desangrado con el mayor cuidado. Las células de la sangre de otros cangrejos de herradura individuales son mucho más estables y, cuando los procedimientos adecuados se siguen, siguen siendo plenamente granular durante el sangrado y la separación de las células del plasma.
  5. Varios agentes han sido reportados para estabilizar las células de sangre después de la hemorragia, incluyendo la cafeína (sangrado de 0,25 volúmenes de cafeína de 10 mm en LPS libres de 3% de NaCl) 4, propranolol (1 mM concentración final) 5, 6 dimetilsulfóxido, la quelación de cationes divalentes ( sangre en un volumen igual de 0,1 M de dextrosa, citrato de sodio 0,03 M, 0,026 M de ácido cítrico, 10 mM de ácido etilendiaminotetracético disódico (Na 2 EDTA), pH 4,6) 7, los inhibidores de la proteína G y las vías de la fosfolipasa C (el cólera y la pertussus toxinas, U73122) 8, la sustitución de cloruro con el anión isetionato 9, bloqueadores del canal de cloruro 9 de AMP cíclico antagonistas 9, reactivos sulfhidrilo (5 mM de N-etil maleimida, NEM) 5, y el detergente de membrana activa Tween-20 ( sangrar en 0,1 volúmenes de 2% Tween-20 en LPS sin NaCl 0,5 M).

Suministros y reactivos para el sangrado del cangrejo de herradura: la recopilación de grandes volúmenes de sangre

  1. uno o más grandes cangrejos de herradura en buen estado
  2. botella con atomizador que contiene 70% de etanol
  3. Kimwipes
  4. Calibre 14 agujas
  5. pinza robusta
  6. cubo de hielo con hielo
  7. 50 ml con tapa de rosca de tubos de plástico desechables centrífuga
  8. bastidor para sostener el tubos de 50 ml
  9. encimera centrífuga
  10. estéril de 50 mL Pipetas serológicas
  11. bombilla de tipo pipeta de llenado
  12. desechables aparato de filtro estéril
  13. la bomba de vacío
  14. LPS sin solución de NaCl al 3% (para la recolección de las células de la sangre)
  15. Tween-20 (para la recolección de las células de la sangre)

Los preparativos para gran volumen de sangrado

  1. Por hemorragia, animales de gran tamaño, sin daños. Frío del animal durante 1 hora en un cuarto frío antes del sangrado.
  2. Establecer un acuerdo cómodo con un soporte estable para un cubo de hielo que es de aproximadamente 0,3 metros de altura (el envase desechable de espuma de poliestireno de envío de correo reactivos fríos o congelados es apropiado) y una silla baja para el operador. El cubo de hielo se coloca en la estructura de soporte y la silla se dibujaa esta unidad. Usted debe ser cómoda sala de estar durante un largo periodo en la silla con los codos apoyados en los muslos, y con la mano izquierda sostiene un cangrejo de herradura que luchan coloca por encima de los tubos de recogida de sangre en posición vertical apoyado en una cama de hielo en el cubo de hielo.
  3. Pre-frío 4 - 6 de los 50 ml desechables tubos de plástico de centrífuga con cierres a rosca en el baño de hielo. Los tubos se colocará en posición vertical en el hielo a distancia en todo el perímetro del recipiente de baño de hielo. Justo antes de iniciar la operación de sangrado, quite las tapas de los tubos y las tapas de lugar en la mesa de al lado, la adhesión a una técnica estéril.
  4. Retire la tapa de una aguja calibre 14 y el uso de las pinzas fuertes para soltar la aguja en la manga, pero no retire la aguja de la manga. Mantener la esterilidad. NO toque ninguna parte de la aguja con los dedos. Manga lugar con una aguja en un contador junto con la culata expuesta de la aguja elevada por el contacto con cualquier superficie para mantener su esterilidad.
  5. Humedezca un Kimwipe con etanol al 70%.

Sangrado del animal (en concreto, para el operador de la derecha)

  1. La celebración de los animales de sangre: animal captar en la mano izquierda con los cuatro dedos en contacto con el reborde anterior del prosoma y el pulgar agarrar la parte posterior de la opisthosma en la base de la cola (la bahía de terminales). La superficie ventral del animal se enfrenta a la palma de su mano. El telson está sobre la base del pulgar y los proyectos sobre la muñeca. Flex el animal con cuidado para que prosoma y opistosoma son perpendiculares entre sí (Figura 3a).

    Figura 3

    Figura 3

  2. Limpie la bisagra expuestos conjunta prosoma y opistosoma conectar con etanol al 70% aplicado con una mezcla de etanol-humedecido Kimwipe (Figura 3b).
  3. Gire la mano izquierda de modo que los dedos 2 a 4 son preponderantes, y la superficie dorsal del animal hacia arriba. Con la mano derecha, inserte la aguja calibre 14 jeringa, aún en su funda de protección, entre los dedos 2 y 3 de la mano izquierda. Tome las pinzas en la mano derecha y retire la aguja de la manga de protección agarrando el culo con las pinzas (Figura 3c). Gire la mano izquierda para que la superficie dorsal de la mano se enfrenta a su dedo pulgar izquierdo, y el índice están en alza, y el animal está al revés, con su superficie dorsal frente a la mano derecha. Coloque el extremo de la aguja sobre el primero de los tubos de 50 ml de recogida de animales y orientar de modo que la punta de la aguja está apuntando a la articulación en bisagra y para que el eje de la aguja es paralela a la línea media dorsal (Figura 3d). Inserte la punta de la aguja a través de la articulación de bisagra en la luz del corazón, manteniendo la aguja colocada en paralelo a la línea media dorsal y se inserta en la línea media y con la culata de la aguja colocada encima de la abertura del tubo de colección. La aguja se introduce de 1 a 2 cm de profundidad en la parte del corazón en el prosoma. Tan pronto como el corazón se perfora, la sangre fluirá rápidamente (Figura 4, flecha), lo que es importante para asegurar que la entrega final de la aguja de la jeringa se coloca sobre la boca del tubo de recogida para recoger esa oleada inicial de la sangre.
  4. La sangre sale del corazón inicialmente en una corriente continua que, después de unos 30 a 50 ml de sangre se han recogido, se reducirá a gotas individuales (Figura 4b). Para mejorar el flujo sanguíneo, puede ser una buena política para reorientar la punta de la aguja ligeramente. Inclinación de la aguja hacia arriba o abajo, derecha o izquierda, deslice la punta más profundamente en el corazón o tire de ella para acercarse a la articulación en bisagra para encontrar la posición que optimiza el flujo de sangre. No comprima el animal en exceso, ya que este riesgo de dañar al animal y puede causar que la sangre extravasada para iniciar la coagulación.

    Figura 4

    Figura 4

  5. A medida que cada tubo de recogida se llena de sangre, gire el baño de hielo para que el tubo de vacío al lado de debajo de la entrega final de la aguja.
  6. Dado que el sangrado disminuye, se corre el riesgo de tener un flujo de aire en una dirección retrógrada en la aguja y en el corazón. Esto puede ocurrir cuando el animal se endereza, lo que reduce la presión arterial. Tratar de evitar esto manteniendo al animal en la posición de flexión o permitiendo que enderezar a ocurrir lentamente.
  7. Cuando el animal deja de dar sangre, retire la aguja sangrado desde el corazón. Vuelva a tapar la colección de tubos y centrifugar inmediatamente en la centrifugadora de mesa, 1000 RPM, 5 min. Las células sanguíneas se forman bolitas compactas en el fondo de los tubos de recolección. Debido a que todos los componentes de coagulación de la sangre están contenidas dentro de vesículas secretoras de las células de la sangre, tan pronto como se separa el plasma de las células,el riesgo de coagulación del plasma se elimina.
  8. Es imprescindible para evitar la coagulación de la sangre extravasada. Las siguientes medidas de reducir el riesgo de coagulación: Pre-enfriamiento de los animales y el mantenimiento de los tubos de recolección en un baño de hielo, un manejo suave del animal, la reducción de la rapidez con que la sangre fluye hacia fuera de la aguja de la jeringa, la centrifugación de la sangre inmediatamente después de la recolección; evitar la contaminación de las agujas y tubos de recolección con la endotoxina, el mantenimiento del procedimiento estéril. Como se mencionó anteriormente, algunos animales individuales tienen células de la sangre especialmente irritable que iniciar la exocitosis, incluso cuando estas precauciones son seguidos.
  9. Después de la centrifugación, inspeccionar los tubos para detectar signos de coagulación de la sangre - los filamentos de las células y material de coágulo gelatinoso fijados a las paredes del tubo, el material gelatinoso en la parte superior de la coagulación, o, peor aún, una gran cantidad de coágulos sanguíneos con células atrapado en el columna de líquido (Figura 4c, flecha). El material de estos tubos es suero no, plasma, y ​​contiene los productos secretada de las células sanguíneas.
  10. Transferir el plasma a tubos estériles con 50 ml pipeta serológica estéril. Tenga cuidado al pipetear para evitar la aspiración de cualquiera de las células del pellet de células en la parte inferior del tubo. Lo mejor es dejar unos pocos mL de plasma por encima de la pastilla para no molestar el pellet de células.
  11. El procedimiento descrito anteriormente está diseñado para recoger grandes volúmenes de plasma contaminado por los productos de secreción de las células sanguíneas. Para recoger grandes cantidades de células de la sangre lavada, recoger la sangre en 0,1 volúmenes de 2% de Tween-20 disuelto en una solución libre de LPS 3% de NaCl. Centrifugar las células suavemente durante 10 minutos para establecer un pellet de células sueltas, y luego se lavan las células con varios cambios de LPS libres de NaCl al 3%. Un extracto de las células que contiene los productos de secreción de las células de la sangre puede ser preparado por lisis de las células se lavan en LPS libres de agua destilada. Este lisado contiene una gran variedad de proteínas y péptidos que actúan en el anti-microbiana de defensa inmunológica 10,11 y también contiene coagulogen, la forma de zimógeno de la proteína estructural de la coagulación de la sangre extracelular, y la colección de las proteasas que convierten a coagulogen coagulin, la forma de la proteína que se polimeriza en las fibrillas de las 12 de coágulos. Este extracto es similar a la del producto disponible en el mercado, de amebocitos de Limulus lisado o LAL, que se utiliza para ensayar la presencia de lipopolisacárido 13. La cascada de la proteasa responsable de la modificación proteolítica de coagulogen a coagulin es activado por LPS 14.
  12. Disposición de los animales después de la hemorragia. Sangrado llevada a cabo por los métodos mencionados anteriormente es bien tolerado por el animal. Cuando se trabaja en el Laboratorio de Biología Marina en Woods Hole, vuelvo a los animales del mar después de la hemorragia con la expectativa de que puedan sobrevivir. Si los animales se mantienen en acuarios lejos de los límites normales de los cangrejos de herradura, que pueden ser sangrados en repetidas ocasiones una o dos veces al mes. Como se describe a continuación, los animales mantenidos en cautiverio requieren de agua de alta calidad y la alimentación frecuente para mantener su salud. La eutanasia se puede lograr la destrucción del ganglio dorsal, que se sitúa en la línea media dorsal entre los ojos.

Procesamiento y almacenamiento de plasma

  1. La protección de las proteasas. Si el plasma se va a utilizar para la purificación de proteínas, que deben ser tratados con inhibidores de la proteasa inmediatamente después de la recolección. Añadir phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) a una concentración final de 1 mM. PMSF se mantiene como una solución 0,1 M en DMSO o etanol. Es muy inestable en el agua 15, por lo que no puede ser invocado para una protección duradera, sino que además inmediatamente después de la separación del plasma de los glóbulos se inactivan las pequeñas cantidades de proteasas que podrían haber sido liberados de las células.
  2. Filtración estéril: esterilizar el plasma por ultrafiltración bajo vacío usando un medio de filtración desechables dispositivo equipado con un filtro de 0,22 mm de poro. Estos filtros tienen una tendencia a obstruir. Se aconseja centrifugar el plasma antes de la filtración para reducir este problema. Si grandes cantidades de plasma son procesados, es aconsejable pre-filtro del primer plasma utilizando un filtro Millipore con un tamaño de 1 mm de poro, luego con un 0,45 mm de tamaño de poro del filtro Millipore.
  3. El plasma puede ser protegida de la contaminación bacteriana mediante la adición de NaN 3 a una concentración final de 0,2 mg / ml o por filtración estéril. Sin esterilizar plasma nunca deben almacenarse por períodos de más de 2 días sin una u otra de estas medidas anti-bacterianas que se están adoptando.
  4. Coagulación de la sangre. A diferencia del sistema de coagulación de mamíferos, el plasma Limulus no contiene ninguno de los elementos necesarios para la coagulación sanguínea. En cambio, toda la maquinaria para la formación del coágulo, la proteína estructural del coágulo (coagulogen) y el sistema de las proteasas que procesan coagulogen para que sea capaz de polimerización en el coágulo insoluble, se encuentra en los gránulos secretores de las 16 células de la sangre. Así que si las células sanguíneas se eliminan antes de que tengan la oportunidad de someterse a la exocitosis, el plasma es totalmente libre de las proteínas de la coagulación y seguirá siendo líquido por tiempo indefinido.
  5. De purificación de proteínas. Hemocianina está presente en 40 mg / ml en plasma y es un 48-mer de una subunidad de 70 kDa. Puede ser aislada por ultracentrifugación (40.000 X g, 8 h) o filtración en gel con una resina de la exclusión de los poros de gran tamaño como BioGel A5M 17. Las proteínas C reactiva están presentes en 1 a 5 mg / ml y puede ser aislado por el aislamiento de afinidad en phosphorylethanolamine-Sepharose, con elución con un quelante de calcio 18. El inhibidor de la proteasa de amplio espectro, un 2-macroglogulin, ha sido purificada por filtración en gel en Sephacryl S-300 de resina después de hemocianina y las proteínas C-reactivas se han retirado 19.

El examen microscópico de las células de sangre móviles en la cultura

  1. Establecimiento de praderas amebocitos in vitro: LPS sin solución al 3% de NaCl se añade a los platos de plástico estéril cultura de estilo de Petri (1 ml para un plato de 35 mm, 2,5 ml de un plato de 60 mm, 6 mL por un plato de 90 ml). La sangre se obtiene por punción cardíaca usando el método descrito anteriormente, pero con la salvedad de que una de calibre 23, una de aguja de la jeringa estéril se utiliza en lugar de la aguja de calibre 14. La sangre fluye gota a gota de la aguja de calibre 23 y 1 gota se recoge en el plato de 35 mm, 3 gotas en el plato de 60 mm, y 9 gotas en el plato de 100 mm. Las células de la sangre se mezclan uniformemente en la solución de NaCl al 3% por primera suave remolino, en un patrón circular, luego de vuelta y vuelta. La preparación se incuba durante 5 min a T ambiente para permitir que las células de la sangre para unirse a la superficie de la placa, entonces la solución salina inicial se reemplaza con un buffer de la opción 3.
  2. Si se desea mantener las células de la sangre unida sustrato en una condición undegranulated, la inicial de solución salina sangre mezcla de plasma se sustituye por LPS libre fresco 3% de NaCl. Plasma acelera la degranulación espontánea de las células de la sangre, incluso en ausencia de LPS, y su eliminación se estabiliza el estado undegranulated de las células.
  3. Si la solución salina inicial se reemplaza con plasma estéril, las células sanguíneas a partir de transformar la forma ovoide de las células de la sangre circulante (Fig. 5) y se aplanan en el sustrato, y luego iniciar la degranulación y la formación de una capa de la coagulación de la sangre coagulin extracelular sobre el césped de amebocytes plana 20.

    Figura 5

    Figura 5

  4. Establecimiento de cultivos de explantes de amebocytes agregados. Cuando la sangre se recoge en estériles, LPS sin condiciones, las células sanguíneas se asientan de suspensión y se agregan para formar una masa de tejido-como. Un recipiente adecuado para este plato es el embrión de vidrio prestados LPS libres de una incubación de 4 horas a 180 0 C. De sangre recogidas en este contenedor por punción cardiaca con una aguja de calibre 19 se incuba durante 1 a 2 horas a T ambiente, y después las piezas se cortan un cuadrado mm del agregado de amebocitos con una aguja de la jeringa estéril de calibre 18 y se encuentra entre dos cubres o un cubreobjetos y una diapositiva separados por fragmentos de cubres de actuar como separadores. Después de aproximadamente media hora, amebocytes empezar a migrar desde la periferia del explante en el cubre objetos (Fig. 6a), donde se puede ver con contraste de fase o la óptica DIC 21. Inicialmente, las células que migran son compactos con seudópodos hialinos (Fig. 6b (m)) que se extienden por encima del sustrato de migración, y que luego se introducen en contacto con la superficie y el movimiento hacia adelante implica el flujo del citoplasma granular en el seudópodo 22 . Después, las células se aplanan (Fig. 6b (f)) e iniciar la degranulación (Fig. 6b (d)) y dejar de locomoción 23. La cámara de cultivo aquí descrito permite la perfusión de los diferentes agentes experimentales en la cámara de cultivo para investigar sus efectos sobre la motilidad celular y la exocitosis de gránulos 9. Una revisión ampliada metodológicos de la cultura de amebocitos para el examen microscópico se puede encontrar en 24.

    Figura 6

    Figura 6

Mantenimiento de adultos cangrejos en acuarios

Los cangrejos de herradura requieren agua de alta mar, la calidad y se puede mantener en acuarios equipados con un sistema de purificación de agua que proporciona la filtración de partículas, la aireación y la desnitrificación del agua 25. Los animales deben ser alimentados con 2 o 3 veces a la semana en el camarón, langosta, pescado o calamar. La alimentación se logra mediante la eliminación de los animales del acuario, plaCing que en su parte posterior, y colocar el alimento en la boca. Si hambrientos, a los animales pronto comenzará a tragar la comida. Dependiendo de la sofisticación del sistema de agua de mar, el animal debe ser mantenido durante una hora o más hasta que defeque en un recipiente separado del agua de mar o puede ser devuelto al acuario después de la alimentación ha comenzado. De mantenimiento a largo plazo, el animal debe mantenerse alejado de la luz para evitar el crecimiento de las algas verdes o azul-verde en la superficie del caparazón. Algas erosionar el caparazón y desde el adulto no mudan, esto hará que la muerte del animal 26. En la naturaleza, los animales pasan la mayor parte de las veces parcialmente enterrado en la arena, pero la arena o la grava en el acuario presenta una dificultad para mantener el nivel de limpieza importante de mantenimiento a largo plazo.

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Discussion

Hay cuatro especies de cangrejo de herradura, Limulus polyphemus de la costa este de América del Norte y tres especies que van desde Japón a la Bahía de Bengala. El animal es identificado como un "fósil viviente" porque las formas anatómicas similares se han encontrado fósiles de 445 millones de años 27. El cangrejo de herradura representa un animal de larga vida, que requieren 10 - 13 años para alcanzar la madurez y la vida al menos 20 años 28. A pesar de que ha sido sometido a la cosecha extensa como cebo para la pesca de la anguila y la concha 29, el cangrejo de herradura de América sigue siendo razonablemente abundante y permite la recolección no destructivos de 50 ml de sangre de un adulto pequeño y de hasta 400 ml de una hembra de gran tamaño. Colección de igualar esta cantidad de sangre se puede completar en menos de 10 minutos. No sé de ningún otro invertebrado fácilmente disponibles que ofrece tanta sangre con tan poco esfuerzo.

La importancia de la prueba LAL para la endotoxina, un indicador de la presencia de bacterias Gram-negativas, ha estimulado el interés en el sistema inmunitario del cangrejo herradura 13. La prueba LAL depende de la activación de la proteasa del inicio del sistema de coagulación de la sangre por LPS 14, con una lectura de la formación de coágulos o de un ensayo colorimétrico para la actividad de la proteasa. Los dos elementos de la inmunidad que han recibido la mayor atención han sido las proteínas del plasma y las proteínas y los péptidos de varios de los gránulos de secreción de las células sanguíneas. El resultado ha sido la elevación de los cangrejos de herradura a la condición de tener mejor describe el sistema inmunológico de los invertebrados de larga duración 11

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Acknowledgments

La investigación original se ha descrito anteriormente fue apoyado por NSF conceder 0344630.

References

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Extracción de sangre del cangrejo herradura de América, Limulus polyphemus
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Armstrong, P., Conrad, M. Blood… More

Armstrong, P., Conrad, M. Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus. J. Vis. Exp. (20), e958, doi:10.3791/958 (2008).

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