Name: İşleme Loblolly Çam PtGen2 cDNA Mikroarray (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Öğrenin loblolly çam PtGen2 cDNA mikroarray işleme protokolünü; hibritleşme öncesi ve sonrası yıkama teknikleriyle sinyal kalitesini artırın ve arka plan gürültüsünü azaltın. Bu standart yöntem bitki biyolojisi araştırmalarında güvenilir gen ekspresyonu verileri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Etiketleme, hibridizasyon ve yıkama protokolleri burada bazı Dr. J. Quackenbush, Genom Araştırma (TIGR), Vanderbilt Mikroarray Paylaşımlı Kaynak (VMSR) Dr. Shawn Levy Enstitüsü&#39;nde ise daha önce geliştirilen bu modifikasyon, ve Dr. Içeren Rob Alba Boyce Thompson Enstitüsü, (BTI) Cornell Üniversitesi sırasında.

(Not 1 - 4 Bölüm Video kanıtlanmış değil) Cy-Etiketli Hedef cDNA hazırlanması Aşağıda biz döllemeler mikroarray önce Loblolly çam toplam RNA ve dolaylı cDNA etiketleme cDNA sentezi için kullanılan bir protokoldür. Olmayan birkaç önemsiz değişiklikler yapılmış olmasına rağmen, aşağıdaki protokol Invitrogen Üst Simge Dolaylı cDNA Etiketleme Kit ile birlikte verilen kullanım kılavuzuna benzer. Bölüm 1: İlk Strand cDNA Sentezi Reaksiyonu <ol><li> Mix ve kullanmadan önce kısaca her kiti bileşeni spin. </li><li> Reaksiyonlar aşağıdaki gibi hazırlayın: <ul><li> Xμl DEPC-H 2 O </li><li> Xμl toplam RNA, 20 mikrogram / reaksiyonu (Ambion Turbo DNaz ile ön işlem) </li><li> 2μl Ankrajlı Oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl) </li><li> 1μl Rastgele Hexamer Astar </li><li style="list-style:none;"> Toplam Hacim = 18μl </li></ul></li><li> 70 1-2 dakika boyunca buz üzerinde ° C, daha sonra 5 dakika yer ve tüpler inkübe edin. </li><li> Her reaksiyon tüpüne buz üzerinde aşağıdakileri ekleyin: <ul><li> 6μl 5X İlk Strand tampon </li><li> 1.5μl 0.1M DTT </li><li> 1.5μl 10mM dNTP mix </li><li> 1μl RNaseOUT (40U/μl) </li><li> 2μl Üst Simge III RT (400U/μl) </li></ul></li><li> Yavaşça karıştırın ve kısaca döndürün. Gecede tüp inkübe 45 ° C. </li><li> Her reaksiyon tüpüne 1M NaOH 15μl ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Tüp 70 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edin. </li><li> 1M HCl 15μl ekleyin, hafifçe karıştırın. </li><li> 20μl 3M sodyum asetat (pH 5.2) ekleyin; hafifçe karıştırın. </li></ol> Bölüm 2: Arındırıcı İlk Strand cDNA. <ol><li> CDNA (Adım 1.9) Tampon Yükleme 500μl ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> SNAP Arıtma Sütun (Dolaylı Etiketleme kiti ile birlikte) bir toplama tüpüne yerleştirin ve sütun cDNA yük. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika 14.000 g Spin, flow-through atın. </li><li> SNAP Sütun aynı toplama tüpü üzerine yerleştirin ve Wash Buffer 500μl eklemek. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika 14.000 g Spin, flow-through atın. </li><li> Toplam üç 500μl yıkar, Adımlar 2.4 ve 2.5 üç kez tekrarlayın. </li><li> 1 dakika saniye boyunca oda sıcaklığında bir kez daha 14.000 g Spin, flow-through atın. </li><li> SNAP Sütun 1.5ml yeni bir boru üzerine yerleştirin. </li><li> SNAP Sütun ve 1 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe sütun sıcak DEPC-su (50 ° C) 50μl ekleyin. 1 dakika 14.000 gr oda sıcaklığında bir spin ile cDNA Zehir. </li><li> DEPC sıcak su 100μl ve Eluent için aynı 1.5ml tüp kullanarak, Adım 2.9 tekrarlayın. </li><li> 20μl 3M sodyum asetat (pH 5.2), 2.9 ve 2.10 adımları Eluent ekleyin. </li><li> Glikojen (20mg/ml) tüp ve karıştırın 3μl ekleyin. </li><li> Buz gibi% 100 EtOH 500μl ekle, iyice karıştırın ve 1 saat için tüp -80 inkübe ° C </li><li> 14.000 g tüp Spin 4 ° C 20 dakika. Süpernatantı dikkatlice çıkartın. </li><li> Buz% 70 EtOH 500μl ekleyin ve 4 g 14.000 tüp spin ° C 5 dakika. Süpernatantı dikkatlice çıkartın. </li><li> 5 dakika boyunca örnek Hava kuru; tüm EtOH kaldırılmış olduğundan emin olun. </li><li> 5 dakika ° 37 ° C 2X Kaplin Tampon Sıcak ve ılık 2X Kaplin Tampon 5μl cDNA örnek yeniden askıya. </li><li> 50 / cDNA Kaplin tampon Isı ° C de 10 dakika ve vorteks için iyi. CDNA pelet tamamen 2X Kaplin Tampon yeniden askıya olduğundan emin olun. </li></ol> Bölüm 3: Floresan Boya Etiketleme Reaksiyon hazırlanırken, boya çözüm ışığa maruz kalma en aza indirmek için dikkatli olun. Ayrıca, DMSO higroskopik ve boya NHS ester ile reaksiyona ve kaplin reaksiyon verimi önemli ölçüde azaltacaktır hava, nem absorbe edecektir . -20 ° C&#39;de bir kehribar vidalı kapaklı flakon kiti verilen DMSO tutun ve yoğuşmayı önlemek için açmadan önce oda sıcaklığına kadar flakon sıcak sağlar. Sadece bu kit ile birlikte verilen DMSO kullanın. <ol><li> Cy-3 veya Cy-5 Boya bir paket açın ve boya flakon doğrudan DMSO, 75μl ekleyin. </li><li> Adım 2.18 tüp DMSO / boya çözüm 5μl ekleyin. </li><li> İyice karıştırın ve tüp, karanlık oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 3M sodyum asetat (pH 5.2) 20μl boya birleştiğinde cDNA çözüm ekleyin. </li><li> CDNA çözüm Tampon Yükleme 500μl ekle. Vorteks ile iyice karıştırın. </li><li> SNAP Sütun açık bir toplama tüpü üzerine yerleştirin ve cDNA / tampon çözelti yük. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika 14.000 g Spin, flow-through atın. </li><li> Aynı toplama SNAP Sütun yerleştirin.tüp; Yıkama Tamponu 500μl sütun ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika 14.000 g Spin, flow-through atın. </li><li> Tekrar 3 Adımlar. 8-3,9 üç kez, toplam üç 500μl yıkar. </li><li> 1 dakika boyunca oda sıcaklığında bir kez daha 14.000 g Spin, flow-through atın. </li><li> SNAP Sütun yeni bir kehribar toplama tüpü üzerine yerleştirin. </li><li> 1 dakika oda sıcaklığında SNAP Kolon ve inkübe sıcak DEPC-su (50 ° C) 65μl ekleyin. </li><li> 1 dakika 14.000 gr oda sıcaklığında Spin ve flow-through toplamak. Flow-through cDNA boya birleştiğinde saflaştırılmış 60μl içermelidir. </li></ol> Bölüm 4: Etiketleme Usul değerlendirilmesi. <ol><li> Her Cy-cDNA etiketleme değerlendirmek için bir spektrofotometre tahlil gerçekleştirin. Sentezlenen cDNA pmol toplam sayısını hesaplayın: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg / 324,5 pg / pmol. Her etiketleme reaksiyon için toplam dahil Cy-Boya pmol hesaplayın: pmol Cy3 = [OD 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. Sonra, her bir reaksiyon için pmol / nükleotid boya oranı pmol hesaplar. Optimal reaksiyonlar&gt; oluşturmak 6000pmol cDNA (kisi 60ul)&gt; 200pmol Cy-Boya (60ul başı), &lt;30 nükleotid / boya oranı. </li></ol> Bölüm 5: Slayt Ön Yıkama <ol><li> PtGen2 Array Corning UltraGaps slaytlar (amino-silan kaplı) yazdırılır ve cDNAs UV-çapraz bağlı. Baskı noktalar tampon yüksek tuz içeriği nedeniyle açıkça görülebilir. </li><li> Baskı alanı (isteğe bağlı) üst ve alt alanlar için slayt işaretlemek için bir elmas uçlu kalem kullanın. </li><li> Koyun yaklaşık 250 ml 43 önceden ısıtılmış ° C mikroskop lamı yıkama çanak (3 &quot;x 4&quot;) içine% 0.2 SDS çözüm. </li><li> Yeri slaytlar slayt slaytlar tuzları kaldırmak için 15-20 kez çok şiddetle SDS çözümü içine raf ve dalma-melezleşmiştir. </li><li> Forseps kullanarak dikkatli bir şekilde rafa slaytları çıkarın ve 43 ° C önceden ısıtılmış hibridizasyon Ön Tampon (5X SSC,% 0,1 SDS,% 1 BSA) içeren bir Coplin kavanoza koyun En az bir saat için 43 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> Bölüm 6: Pre-Hibridizasyon <ol><li> Beş slayt yıkama yemekleri, her biri millipure dH 2 O dolu ve moleküler sınıf izopropanol ile dolu bir Coplin kavanoz ayarlayın . Slaytları slayt rafa yerleştirin ve her biri 20 kez dunking beş yemekleri sıralı süreci. </li><li> Kaldır beşinci slayt mikrofuge&#39;de (Chipmate masa üstü, 2 pozisyon) içine slaytlar izopropanol ve hemen su ile yıkayınız ve daldırma 5-6 kez bir seferde iki slaytlar ve kuruması için 1 dakika döndürün. </li><li> Temizlik slaytlar sıkıştırılmış hava ile 0.22 mcM filtre kartuşu süzülür ve Genomik Çözümler Hibridizasyon Odası yukarı bakacak şekilde barkod koyun. </li><li> Temiz LifterSlips ™ filtreli hava ve aşağı bakacak şekilde beyaz şeritler ile slaytları pozisyon. Sarı bir pipetlemeyin ucu hafifçe slayt kaldırıcı kayma hizalamak için kullanın (% 70 etanol ™ ilk LifterSlips Yıkama isteğe bağlıdır. Gereksiz bulduk.) </li></ol> Bölüm 7: Hibridizasyon Karanlık veya düşük ışık yapılmalıdır. <ol><li> Melezleşmiştir her slayt için, Cy-5 miktarını hesaplamak ve CY-3, her bir hedef 50-75pmol vermek için cDNA etiketli. 37-45 tek bir tüp içine bu miktarda ısı ayarı ile birleştirin ve bir vakum desikatörde kuru ° C Tamamen kuruyan kaçının! </li><li> Kurutulmuş 60ml hibridizasyon tamponu sondalar (o gün taze yapılmış) ve vorteks kısaca tekrar </li><li> 5 dakika 30 saniye süreyle 95 ° C banyo ve daha sonra hızlı mikrofuge&#39;de yeniden süspanse cDNAs inkübe edin. </li><li> Yavaş yavaş slayt altındaki slayt LifterSlip ™ kavşağı (barkod sonu) pipetleme tamamını yeniden süspanse prob hacmi yükleyin. Slayt kapiler eylem yoluyla yük olacaktır. (Bazı slayt pipet ve yavaşça LifterSlip bindirme ™ bu kabarcıkları alırsanız LifterSlip ™ bulaşması eserler noktaya yol açabilir yerleştirildikten sonra hareket etmez, çünkü bir çekim yöntemi tercih edin) </li><li> Her nem 100 mM DTT Yeri 20uL odasının ucunda yer almaktadır. </li><li> Odanın en üst yerleştirin ve cam vidalarını sıkın. Kapak alüminyum folyo ve yavaşça sallanarak rpm&#39;de 50-60 ile 12-18 saat 48 ° C su banyosu içine batırmayın odası. </li></ol> Bölüm 8: Post-Hibridizasyon yıkar Tüm yıkar, karanlık veya düşük ışık yapılmalıdır . Slaytlar son adıma kadar kuruması için asla izin verilmemeli. <ol><li> 1) W: Yıkama Çözüm # 1 @ 53 ° C Aşağıdaki her 250 ml ile dolu ve dört slayt yıkama yemekleri ile dolu bir Coplin kavanozkül Çözüm # 1 @ 53 ° C, 2) Yıkama Çözüm # 2 @ oda sıcaklığında, 3 ve 4) Yıkama Çözüm # 3 @ oda sıcaklığında içeren iki çanak. </li><li> Dikkatle hibridizasyon odalarından slaytlar kaldırmak ve onları iki sırayı Coplin kavanoza bir seferde. 30 saniye boyunca bırakın, sonra yavaş yavaş slayt asansör ve kaldırıcı kayma kavanoz kalacaktır. Slaytlar slayt raf ve hemen Yıkama Çözeltisi # 1 (1X SSC,% 0.2 SDS, ön ısıtma 43 ° C) içine batırmayın. Tüm LifterSlips kaldırılır ve yıkanabilir tüm slaytlar Yıkama Çözeltisi # 1 tabak kadar tekrarlayın. Gayretle 10 kat kadar rafa batırın ve aşağı. </li><li> Yeri çanak 53 ° C de 10 dakika 50-100 rpm çalkalama hava çalkalayıcı. </li><li> Transferi, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında Çözüm # 2 (0.1x SSC,% 0.2 SDS), 10 kez dalma ve inkübe Wash raf sallayarak yavaş. </li><li> Dip raf ilk Yıkama Çözüm # 3 (0.1x SSC) içine 15 kez kaldırmak için herhangi bir kalıntı SDS Yıkama Çözüm # 2 üzerinde taşır. Ikinci Yıkama Çözüm Yeri raf # 3 çanak, dalma 10 kez ve daha sonra 10 dakika boyunca sallayarak yavaş. </li><li> Santrifüj 50ml Falcon kapaklı tüpler ve spin @ 1,500 rpm Yeri slaytlar sallanan bir kova rotor ile donatılmıştır. Yalıtımlı konteyner ışık slaytlar çıkarın (ozon seviyeleri yüksek olduğunda bu yaz özellikle Cy boyalar, Cy-5 oksidasyonu azaltır sıkıca alüminyum folyo kaplı başka Falcon tüp ve azot gazı tüpünden tasfiye hava, şapka kullanın .) Slaytlar, bir kaç saat önce azot tasfiye tüpler tarama süreyle saklanabilir; Ancak, hemen yıkandıktan sonra tarama bittiğinde iyi sinyal sonuçlar elde edilmektedir. </li></ol> Bölüm 9: Veri Toplama ve İstatistiksel Analiz <ol><li> Tarama görüntü verilerini Perkin Elmer ScanArray toplanır. Biz 10 mikron tarama ayarı ve dengesi Cy3 ve üreticinin talimatlarına göre satır ayarlama yöntemi kullanılarak Cy5 sinyalleri kullanırlar. </li><li> TIF dosyalarını ızgara ve ham sinyal veri ImaGene Sürüm 7.5 (BioDiscovery A.Ş., El Segundo, CA) ile toplanır ve süzülür. </li><li> Veri normalleşme ve istatistiksel olarak geçerli farklı ifade türlerin belirlemek için değerlendirme BRB Dizi araçları Ver ile yapılır. 3.7. </li><li> Gen İfadesi Örüntü Analizi Yazılımı (GEPAS) Ver koordineli olarak ifade edilen genlerin belirlenmesi kolaylaştırmak için desen analizi yapılır. 3.1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1182/Figure1_WWLorenz-1.png" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 PtGen2 dizi bu protoco l. kullanarak işleme örneği <img src="/files/ftp_upload/1182/Figure2_WWLorenz.png" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 standart hibridizasyon ve yıkama protokolleri kullanarak işlenmiş PtGen2 dizi örneği.

<ol><li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+%28Pinus+taeda%29+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li>
<li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.</li>
<li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li>
<li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESTs%2C+cDNA+microarrays%2C+and+gene+expression+profiling%3A+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li>
<li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. August 25-29, Quebec City, Quebec, , (2008).</li>
<li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).</li>
</ol>

PtGen2 öncelikle Loblolly çam araştırma topluluğu tarafından kullanılmak üzere tasarlanmış kısa bir süre önce geliştirilen, özel cDNA mikroarray. Üretilen ön sonuçları, bu nedenle çok değerli bir araç transkripsiyonel kuraklık stresine yanıt olarak ortaya çıkan olayların yanı sıra, deniz, çam, Pinus pinaster Şu anda 5,6 embriyo gelişimi sırasında meydana gelen değişiklikleri izleme gibi değerlendirilmesi için dizi göstermiştir yakın zamanda 5 PtGen2 olarak, Pinus ve diğer kozalakl...

<table><tbody><tr><td>Hibridizasyon Öncesi Tamponu</td><td>Tampon Çözelti</td><td></td><td></td><td>5X SSC, %0,1 SDS, %1 BSA</td></tr><tr><td>Hibridizasyon Tamponu</td><td>Tampon çözelti</td><td></td><td></td><td>%30 formamid, 5X SSC, 5X Denhardt&amp;rsquo;s, %1 PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), %0,1 SDS</td></tr><tr><td>Yıkama Solüsyonu #1</td><td>Tampon çözelti</td><td></td><td></td><td>1X SSC, %0,2 SDS, 43 dereceye ön ısıtma yapın&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Yıkama Çözeltisi #2</td><td>Tampon çözelti</td><td></td><td></td><td>0,1X SSC, %0,2 SDS</td></tr><tr><td>Yıkama Solüsyonu #3</td><td>Tampon çözelti</td><td></td><td></td><td>0.1X SSC</td></tr><tr><td>İzopropil Alkol</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34959-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik Tüpler</td><td>Diğer</td><td>Falcon BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konik Tüpler</td><td>Diğer</td><td>Falcon BD</td><td>352196</td><td>Santrifüjleme sırasında her bir 50 mL'lik konik tüpün altına yerleştirilen bu veya benzeri bir kapak kullanın</td></tr><tr><td>Coplin Kavanozu</td><td></td><td>Wheaton</td><td>900520</td><td></td></tr><tr><td>Boyama Kabı &amp;amp; Raf </td><td>Diğer</td><td>Wheaton</td><td>900200</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Diğer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9418</td><td></td></tr><tr><td>PolyA RNA</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>POLYA.GF</td><td></td></tr><tr><td>SuperScriptTM İndirekt cDNA İşaretleme </td><td>Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L1014-02</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>Sistem</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy-5 Boyası</td><td>Reaktif</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25001</td><td></td></tr><tr><td>Cy-3 Boyası</td><td>Reaktif</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23001</td><td></td></tr><tr><td>LifterSürgüleri&amp;#8482;</td><td>Diğer</td><td>Erie Scientific</td><td>25X601</td><td></td></tr><tr><td>Hibritleme Odaları</td><td>Ekipman</td><td>GeneMachines</td><td>JHYB200003</td><td></td></tr></tbody></table>

İşleme loblolly Çam ptgen2 cdna mikroarray

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 amplifiye Loblolly çam EST&#39;ler içeren 26.496 özelliği cDNA mikroarray. Dizi, çam ve diğer kozalaklı türlerin gen ekspresyonu eğitim araştırmacılar tarafından kullanılmak üzere laboratuvarda üretilir. PtGen2 Loblolly çam gen bulma çabalarının bir sonucu olarak geliştirilen ve öncelikle kök dokuları tespit dizileri oluşur, ama aynı zamanda iğne ve kök 1,2 PtGen2 farklı etiketli Cy-boya kozalaklı hedef cDNAs literatürde tarafından test edilmiştir amplifiye ve amplifikatör içermeyen dolaylı etiketleme yöntemleri ve hibridizasyon ve yıkama koşulları bir dizi test. Bu video bazı değişiklikler önceden geliştirilmiş yöntemler kullanılarak, hem de melezleme sonra, ön hibridizasyon öncesi ve sonrası slayt taşıma ve işleme üzerine odaklanmaktadır. 3,4 Ayrıca dahil olanlar, sadece metin biçiminde, üretim için kullanılan protokoller, etiketleme ve hedef cDNA s kadar temiz yanı sıra yazılım hakkında bilgi downstream veri işleme için kullanılır. PtGen2 tamamen kaldırmak için zor olabilir yüksek konsantrasyonlarda tuz içeren özel bir baskı tamponu ile yazdırılır. Slaytlar ön hibridizasyon için önce sıcak bir SDS çözümü ilk olarak yıkanır. Ön hibridizasyon sonra, slaytlar kalan tuzları kaldırma işleminin tamamlanması için çeşitli değişikliklere su kuvvetlice yıkanır. LifterSlips ™ sonra temizlenmiş ve slaytlar üzerinde konumlandırılmış ve cDNA etiketli dikkatle slaytta örnek eşit dağılımını sağlayan kılcal eylem yoluyla mikroarray üzerine yüklenen ve kabarcık esas şansını azaltır. Dizi hedefleri Hibridizasyon 48 ° C&#39;de yüksek nem koşullarında yapılır. Hibridizasyon sonra, bir dizi standart yıkar 53 yapılır ° C ve oda sıcaklığında uzun zamanlar için. İşleme PtGen2 slaytlar bu tekniği kullanarak tuz azaltır ve SDS-elde edilen eserler genellikle dizi daha titiz bir şekilde işlenir. Birkaç farklı kozalaklı RNA kaynaklardan elde edilen hedeflere literatürde, bu işlem protokolü, daha az eser, azaltılmış arka plan verdi ve dizilerin farklı deneysel gruplar arasında daha tutarlı.

CDNA mikroarray PtGen2 Loblolly çam gen ekspresyon çalışmaları için geliştirilmiştir<em&gt; S. taeda</em&gt; Ve diğer kozalaklı türler. Burada, öncesi ve sonrası hibridizasyon teknikleri, daha iyi bir tutarlılık, eserler, ve alt arka planlar verim için bu dizi ile birlikte kullanılabilir taşıma ve yıkama.

İşleme Loblolly Çam PtGen2 cDNA Mikroarray

PtGen2, amplifiye edilmiş loblolly çamı EST'lerini içeren 26.496 özellikli bir cDNA mikroarraydir. Bu array, araştırmacıların kullanımı için laboratuvarımızda üretilmiştir ...

Bu video, Georgia Üniversitesi Warnell Ormancılık ve Doğal Kaynaklar Okulu'ndaki araştırmacılar tarafından üretilmiştir. Bu eğitim videosunun amacı, hibritleşme öncesinde ve sonrasında dizinin yıkanmasına ve taşınmasına özel dikkat göstererek, LOB lolly pine pt, gen iki CDNA mikro-dizimizin nasıl işleneceğini detaylandırmaktır. Genel olarak protokollerimiz, dizilerimizin basıldığı Institute for Genomic Research Tiger ve Vanderbilt Mikro-dizi Ortak Kaynak Tesisi'nde (VMSR) geliştirilen protokolleri takip etmektedir.Sinyal kalitesinin tekdüzeliği ve düşük arka plan konusunda en yüksek düzeyde tutarlılık sağlamak için PT Gen two'nun daha sıkı bir işlemden geçirilmesi gerektiğini saptadık. İlk adım ön yıkamadır. Spotlama tamponumuz çok yüksek tuz içeriğine sahip olduğu için bu ön yıkama, söz konusu tuzu uzaklaştırmak amacıyla gereklidir.Lamlar bir mikroskop lam taşıyıcısına yerleştirilir ve 43 dereceye önceden ısıtılmış %0,2 SDS çözeltisine 15 ila 20 kez kuvvetlice daldırılır. SDS çözeltisinde yıkandıktan sonra lamlar, pensle dikkatlice alınarak hibridizasyon öncesi tamponu içeren bir Copeland kavanozuna aktarılır. Bu tampon; 5X SSC, %0,1 SDS ve %1 BSA içerir ve aynı şekilde 43 derecede ısıtılır.Copeland kavanozu parfüme batırılarak kapatılır ve bir saat boyunca 43 °C'lik bir inkübatöre yerleştirilir. Ön hibritleşmenin ardından lamlar bir mikroskop lam taşıyıcısına alınır ve her birinde 15 ila 20 kez daldırılarak ardışık olarak beş kez deiyonize su ile yıkanır. Son olarak lamlar izopropanole yerleştirilir, beş veya altı kez daldırılır ve ardından bir chip M mate santrifüjle kurutulana kadar santrifüj edilir.Santrifüj işleminden sonra, lamlara 0,2 mikronluk bir filtreden geçirilmiş basınçlı hava tutulur. Ardından lamların üzerine, yine basınçlı hava ile temizlenmiş olan kaldırma lamları yerleştirilir ve kaldırma lamını lam üzerindeki doğru konuma getirmek için küçük bir pipet ucu kullanılır.Kaldırıcı şeritler yerleştirildikten sonra, ancak hibridizasyon tamponu eklenmeden önce, odacığın uçlarında bulunan nem kuyucuklarına 20 µL 100 mM dihi, three atol ekliyoruz. Artık, hibridizasyon tamponunda yeniden süspande edilmiş olan hedef cDNA'ları eklemeye hazırız. Pipet ucu, kaldırıcı şeridin ve lamın kenarına yerleştirilir ve çözelti yavaşça pipetlenir.Dizileri yüklemek için kılcal etkiyi kullanmanın en yüksek tutarlılığı sağladığını ve istenmeyen hava kabarcıklarının oluşumunu önemli ölçüde azalttığını saptadık. Hedef materyal diziye eklendikten sonra, hibridizasyon odası monte edilir ve alüminyum folyo ile kapatılır. Ardından hibridizasyon odası, genellikle 14 ila 16 saat süren gece boyu inkübasyon için çalkalayıcı bir su banyosuna yerleştirilir.Su banyosu 48 dereceye ve çalkalayıcı 50 rpm'e ayarlanır. Hibritleme solüsyonunun eklendiği andan itibaren tüm hibrit sonrası yıkama işlemleri boyunca, foto-oksidasyonu önlemek için prosedürlerin düşük ışıkta gerçekleştirildiğini belirtmek önemlidir. Ertesi gün, lamlar hibritleme haznesinden çıkarılır ve 53 dereceye önceden ısıtılmış olan birinci yıkama solüsyonunu içeren bir Copeland kavanozuna yerleştirilir.Slaytların, kaldırıcı şeritler dökülene kadar yaklaşık bir dakika boyunca Copeland kavanozunda kalmasına izin verilir; bu noktada slaytlar pensle nazikçe çıkarılır ve yıkama işlemlerine geçmek üzere bir mikroskop slayt taşıyıcısına yerleştirilir. Ardından slaytlar, yine 53 °C'de birinci yıkama çözeltisi içeren ikinci bir kaba yaklaşık 15 ila 20 kez kuvvetlice daldırılır. Kap daha sonra parafilm ile kapatılır ve 53 °C'ye ve 100 RPM'e ayarlanmış bir inkübatör hava çalkalayıcıya yerleştirilir.10 dakikalık inkübasyon ve 1 numaralı yıkama solüsyonundan sonra, lamlar oda sıcaklığındaki 2 numaralı yıkama solüsyonu içeren bir kaba 15 ila 20 kez kuvvetlice daldırılır. Kap parafilm ile kapatılır ve 10 dakikalık bir inkübasyon için oda sıcaklığında tekrar bir çalkalayıcıya yerleştirilir. Son olarak, lamlar 2 numaralı yıkama solüsyonundan çıkarılır ve 3 numaralı yıkama solüsyonu içeren bir kaba 15 ila 20 kez kuvvetlice daldırılır.Lamlar daha sonra Parafilm ile kapatılmış üçüncü yıkama çözeltisi içeren ikinci bir kaba alınır ve tekrar 10 dakika boyunca çalkalayıcıya yerleştirilir. Son yıkamanın ardından, tam kuruma sağlamak için lamları santrifüj ederiz. Bunu yapmak için, 50 ml'lik konik tüpün içine 15 ml'lik bir Falcon kapak yerleştiririz ve dizileri barkod tarafı aşağı gelecek şekilde konik tüpe koyarız.Ardından tüpler, oda sıcaklığında 1500 RPM hızında, salınımlı kova rotorlu bir santrifüjde döndürülür. Santrifüjden sonra lamlar, alüminyum folyo ile kaplanmış ikinci bir 50 ml'lik konik tüp setine aktarılır. Daha sonra tüpler, 0.22 mikronluk bir filtreden geçirilmiş azot gazı ile temizlenir ve taşıma için veya tarama işlemine kadar saklanmak üzere kapatılır.Tarama verilerini bir PerkinElmer scan array 5, 000 cihazı ile topluyoruz. Array görüntüsü ızgaralandırılır, ham tarama verileri işlenir ve ilk veri analizi bio discovery'nin görüntüleme yazılım paketi ile gerçekleştirilir. Ardından, spot sinyal yoğunluğu verileri normalize edilir ve istatistiksel analizler, National Cancer Institute üzerinden indirilebilen, güçlü ve ücretsiz bir microarray istatistik paketi olan BRB array tools ile yapılır.Diğer istatistiksel analizler ve gen ekspresyon paterni aramaları, ücretsiz olarak sunulan web tabanlı bir analiz paketi olan gen ekspresyon paterni ve analiz seti Jeep PPAs ile gerçekleştirilir. Lob lolly çamı PT Gen iki mikro-diziliminin nasıl işleneceğine dair videomuzu izlediğiniz için teşekkür ederiz.Aşağıdaki kişiler, bu eğitim videosunun içeriğinden ve prodüksiyonundan sorumludur.

processing-the-loblolly-pine-ptgen2-cdna-microarray

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Loblolly çam ksilem ve floem de dahil olmak üzere birçok bitki dokularında,...

RNA İzolasyonu Loblolly Çam Daha İyi Bir Yöntem ( S. taeda L.) ve Diğer Conifer Türler

Hücre biyolojisinde temel bir arayış ökaryotik hücrelerin yapmak organellerin kimliği altında yatan mekanizmaları belirlemektir. Burada floresan mikroskobu ve yeni nesil dizileme araçlarını kullanarak bitki organel morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğü sorumlu genleri tanımlamak için bir yöntem öneriyoruz.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

Bu el yazması, DNA mikrodizileri tarafından sağlanan en son teknolojinin kullanımını açıklamaktadır. Mikrodiziler, belirli bir koşul altında bakterilerde meydana gelen transkriptomik değişikliklere genel bir bakış sağlar. Ayrıca, şirket içinde geliştirilen uygun yazılım paketleri kullanılarak büyük miktarda verinin analiz edilebilmesinin kolaylığını vurguluyoruz.

Bakteriyel Transkriptom Analizi Vaka çalışması için A Hızlı ve Güvenilir Boru Hattı: Serin bağımlı Gen Yönetmelik<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Mikroarray teknolojisi, transkriptlerin genom çapında kantitatif ölçümüne ve gen ekspresyon profiline izin verir. Bu nedenle, bu protokol, düşük miktarda toplam RNA kullanmanın fizibilitesini göstermek için 7. gün sığır embriyolarını kullanan iki renkli özel yapım bir sığır dizisinde optimize edilmiş bir teknik prosedür sağlar.

Transcriptome Profil In-vivo Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Bu makale, yani terroir kavramının, içgörü kazanmak için üzüm berry transkript ve metabolitleri hedefsiz metabolomik, transkriptomik ve çok değişkenli istatistiksel analiz uygulamasını açıklar, dut kalite özellikleri çevrenin etkisi.

Üzüm Berry metabolomik ve transkriptomik aracılığıyla yorumlanır Terroir Kavramı

Bu makalede tanımlama ve asma Arabidopsis Tóxicos Levadura içinde (ATL) E3 Ubikuitin ligazlar aile için uygulanan bir gen aile karakterizasyonu için yordam açıklanır.

Genom kapsamındaki bir tanımlama ve ifade Meta-Analizi ATL E3 Ubikuitin ligaz gen ailesinin asma için kapsamlı iş akışı

Bu iletişim kuralı genel işlemlerini açıklar ve kalite kontrol sağlıklı yetişkin memeli tek hücreleri damlacık-esaslı, yüksek üretilen iş tek hücre RNA-Seq hazırlıkları hazırlanması için gerekli denetler. Sıralama parametreleri, okuma hizalama ve aşağı akım tek hücreli bioinformatic analiz da sağlanır.

Damlacık tek hücre barkodlama tabanlı Transcriptomics yetişkin memeli dokuların

Bu çalışma, bir doku kesitinin doğrudan uzamsal barkodlamasını tek hücreli çoklu analiz ile birleştiren bir uzamsal Trekker–CUT&amp;Tag çoklu protokolü sunmaktadır. Bu yaklaşım, gen ekspresyonunun ve histon H3K27ac modifikasyonunun aynı anda mekansal olarak çözülen tek hücreli profillenmesini sağlar ve doku mikroanatomisi bağlamında gen düzenlemesine mekanik içgörüler sunar.

Donmuş doku kesitlerinde transkriptom ve epigenomik hedeflerin mekansal çözülmüş, entegre tek hücreli multiomik profillenmesi

Steril koşullar altında toplanması için bir prosedür Gibberella zeae ascospores gelişim süreçleri incelemek için en üst düzeyde protokol açıklamasına bilgi üretmek için filme. Bu deney, çok önemli bir yönü tam genom ekspresyon profil testleri uygulanmaktadır tekrarlanabilirlik kolaylaştırmak gerekir.

Gibberella zeae Ascospore Üretim ve Tahsilat Mikroarray deneyler için.

Öğrenin loblolly çam PtGen2 cDNA mikroarray işleme protokolünü; hibritleşme öncesi ve sonrası yıkama teknikleriyle sinyal kalitesini artırın ve arka plan gürültüsünü azaltın. Bu standart yöntem bitki biyolojisi araştırmalarında güvenilir gen ekspresyonu verileri sağlar.

İşleme Loblolly Çam PtGen2 cDNA Mikroarray

Daha fazla video keşfet