İşleme Loblolly Çam PtGen2 cDNA Mikroarray

Bu video, Georgia Üniversitesi Warnell Ormancılık ve Doğal Kaynaklar Okulu'ndaki araştırmacılar tarafından hazırlandı. Bu eğitim videosunun amacı, hibridizasyondan önce ve sonra dizinin yıkanmasına ve işlenmesine özellikle dikkat ederek LOB lolly çam pt, gen iki CDNA, mikro dizimizin nasıl işleneceğini detaylandırmaktır. Genel olarak, protokollerimiz Tiger Genomik Araştırma Enstitüsü ve dizilerimizin basıldığı Vanderbilt Mikrodizi Paylaşılan Kaynak Tesisi'nde (VMSR) geliştirilenleri takip eder.

Sinyal kalitesinin tekdüzeliği ve düşük arka planlar açısından en yüksek tutarlılığı sağlamak için PT Gen two'nun daha sıkı bir şekilde işlenmesinin gerekli olduğunu bulduk. İlk adım bir ön yıkamadır. Bunu yapıyoruz çünkü lekelenme tamponumuz çok yüksek tuz içeriği içeriyor ve bu ön yıkama bu tuzu çıkarmak için gerekli.

Slaytlar bir mikroskop lam taşıyıcısına yerleştirilir ve 43 dereceye kadar önceden ısıtılmış %0,2'lik bir SDS çözeltisine 15 ila 20 kez kuvvetlice daldırılır. Slaytlar SDS solüsyonunda yıkandıktan sonra, forseps ile ön hibridizasyon tamponu içeren bir Copeland kavanozuna dikkatlice çıkarılır. Bu tampon beş XSSC %0.1 SDS ve %1 BSA içerir ve ayrıca 43 derecede ısıtılır.

Copeland kavanozu parfüm ile kaplanır ve bir saat boyunca 43 derecelik bir inkübatöre yerleştirilir. Ön hibridizasyonun ardından, slaytlar bir mikroskop lam taşıyıcısına çıkarılır ve her değişimde 15 ila 20 kez daldırılan beş deiyonize su değişikliği yoluyla art arda işlenir. Son olarak, slaytlar izopropanol içine yerleştirilir ve bir çip M mate santrifüjünde kuruyana kadar santrifüjlenmeden önce beş veya altı kez daldırılır.

Santrifüjleme işleminden sonra lamlar 0,2 mikronluk bir filtreden geçirilen basınçlı hava ile üflenir. Kızaklar daha sonra yine basınçlı hava ile temizlenmiş olan kaldırıcı kızakları ile kaplanır ve kaldırıcı kızağını doğru konuma ayarlamak için küçük bir pipet ucu kullanırız. Slaytta.

Kaldırıcı kızakları yerleştirildikten sonra, ancak hibridizasyon tamponu eklenmeden önce, odanın uçlarında bulunan nem kuyularına 20 mikrolitre 100 milimolar dihi, üç atol ekliyoruz. Artık hibridizasyon arabelleğinde yeniden askıya alınan hedef CDNA'ları eklemeye hazırız. Pipet ucu, kaldırıcı kızağının ve sürgüsünün kenarına yerleştirilir ve çözelti yavaşça pipetlenir.

Dizileri yüklemek için kılcal efektin kullanılmasının en fazla tutarlılığı sağladığını ve istenmeyen baloncukların dahil edilmesini büyük ölçüde azalttığını bulduk. Hedef malzeme diziye eklendikten sonra, hibridizasyon odası monte edilir ve alüminyum folyo ile kaplanır. Hibridizasyon odası daha sonra, tipik olarak 14 ila 16 saat olmak üzere gece boyunca inkübasyon için çalkalanan bir su banyosuna yerleştirilir.

Su banyosu 48 dereceye ve çalkalayıcı 50 rpm'ye ayarlanmıştır. Ayrıca, hibridizasyon çözeltisinin eklendiği noktadan tüm hibridizasyon sonrası yıkamalara kadar, foto oksidasyonu önlemek için prosedürlerin düşük ışıkta gerçekleştirildiğine dikkat etmek önemlidir. Ertesi gün, slaytlar hibridizasyon odasından çıkarılır ve 53 dereceye kadar önceden ısıtılmış bir numaralı yıkama solüsyonu içeren bir Copeland kavanozuna yerleştirilir.

Slaytların, kaldırıcı kızakları düşene kadar yaklaşık bir dakika Copeland kavanozunda kalmasına izin verilir, bu noktada slaytlar forseps ile nazikçe çıkarılır ve yıkamalara devam etmek için bir mikroskop slayt taşıyıcısına yerleştirilir. Slaytlar daha sonra ikinci bir kapta yaklaşık 15 ila 20 kez kuvvetlice daldırılır ve ayrıca 53 derecede bir numaralı yıkama solüsyonu içerir. Kap daha sonra parfüm ile kaplanır ve 53 derece ve yüz RPM'ye ayarlanmış bir inkübatör hava çalkalayıcısına yerleştirilir.

Bir numaralı 10 dakikalık inkübasyon ve yıkama solüsyonundan sonra, slaytlar, kabın oda sıcaklığında olan iki numaralı yıkama solüsyonu olan bir kaba 15 ila 20 kez kuvvetlice daldırılır. Bu, para film ile kaplanır ve 10 dakikalık bir inkübasyon için oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerine tekrar yerleştirilir. Son olarak, slaytlar iki numaralı yıkama solüsyonundan çıkarılır ve üç numaralı yıkama solüsyonu olan bir kaba 15 ila 20 kez kuvvetlice daldırılır.

Slaytlar daha sonra perfil ile kaplanmış üç numaralı ikinci bir yıkama solüsyonu kabına çıkarılır ve tekrar 10 dakika boyunca çalkalayıcı üzerine yerleştirilir. Son yıkamadan sonra, kuruluğu tamamlamak için slaytları santrifüj ediyoruz. Bunu yapmak için, 50 mil'lik bir konik tüpe 15 mil'lik bir Falcon kapağı yerleştiriyoruz ve dizileri barkod tarafı aşağı bakacak şekilde konik tüpe yerleştiriyoruz.

Tüpler daha sonra oda sıcaklığında 1500 RPM'de sallanan bir kova kafasında döndürülür. Santrifüjlemeden sonra, slaytlar, alüminyum folyo ile kaplanmış ikinci bir 50 mil konik tüp setine çıkarılır. Tüpler daha sonra nitrojen gazı ile temizlenir ve bu gaz 0,22 mikronluk bir filtre ve kapaktan süzülür ve tarama yapılana kadar taşınması veya saklanması için saklanır.

Tarama verilerini 5.000 PerkinElmer tarama dizisinde topluyoruz. Dizi görüntüsü ızgaralanır ve ham tarama verileri işlenir ve ilk veri analizi bio discovery'nin görüntüleme yazılım paketi ile yapılır. Daha sonra, Ulusal Kanser Enstitüsü'nden indirilebilen sağlam ve ücretsiz olarak kullanılabilen bir mikrodizi istatistiksel paketi olan BRB dizi araçlarıyla istatistiksel analiz yapıldığından, spot sinyal yoğunluğu verileri normalleştirilir.

Diğer istatistiksel analiz ve gen ekspresyon paterni aramaları, gen ekspresyon paterni ve analiz paketi Jeep PPA'ları ile gerçekleştirilir. Ücretsiz olarak kullanılabilen başka bir web tabanlı analiz paketi. Lob lolly pine PT Gen two mikrodizisinin nasıl işleneceğine dair videomuzu izlediğiniz için teşekkür ederiz.

Bu eğitim videosunun içeriğinden ve üretiminden aşağıdaki kişiler sorumluydu.