Name: Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Öğrenin bitki organellerinin morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğünü sağlayan genleri floresans mikroskobu ve yeni nesil dizileme kullanarak belirleme yöntemini. Bu yaklaşım genetik mutasyonların haritalanmasını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Kimyasal Bilimler, Yer Bilimleri ve Biyolojik Bilimler Bölümü, Temel Enerji Bilimler, Fen Dairesi, ABD Enerji Bakanlığı (ödül sayısı DE-FG02-91ER20021) ve Ulusal Bilim Vakfı (MCB 0.948.584) (FB) Müdürlüğü tarafından destek için minnettarım. Biz yazının düzenleme için Bayan Karen Kuş minnet borçluyuz.

1. EMS Tedavi Arabidopsis thaliana tohumu T / A mutasyonlar 5-7 C / G elde genomunun C-etmek-T içinde değişikliklerin indüklemektedir mutajen madde etil metan sülfonat (EMS) 3,4 olarak kullanılarak mutagenized edilir. <ol><li> Organel floresan işaretleyici (özellikle, bu çalışmada ssGFPHDEL (sinyal sekansı-GFP-HDEL tetrapeptide) bir ER belirteç olarak kullanılmıştır) taşıyan 0.8 g Arabidopsis tohumları (~ 40.000 tohum) tartılır. </li><li> 50 ml falcon tüp tohumları aktarın, sonra 25 ml saf su ekleyin. </li><li> % 0.2 (v / v) etil metan sülfonat ekleyin. </li><li> Düşük hızda karıştırıcı nutating 16 saat boyunca inkübe. </li><li> Sıvı aspire ve 1.0 M NaOH EMS inaktive içeren bir şişeye içine atın. </li><li> Yakın, tohum içeren Falcon tüpüne 25 ml su ekleyin ve 5 kez ters tohum yıkamak, tüm tohumları çökene kadar bekleyin, sonra 1.0 M Na içine su aspire ve atın<html> Şişesi OH. </li><li> 10 kata kadar yıkama işlemi tekrarlayın. </li><li> Nihai yıkamadan sonra, su minimal miktarda tohumların yeniden askıya. </li><li> % 10 çamaşır suyu 25 ml ekleyerek tohum sterilizasyon geçin, 30 saniye boyunca kuvvetlice çalkalanır. Daha sonra çamaşır suyu dökünüz ve steril su 25 ml ile yıkayın, tohumlar dibe edelim. Steril suyu dökün ve 25 ml% 70 etanol ekleyin. 30 s için tüpleri çalkalayın. Tohumlar dibe edelim. Etanol kapalı dökün ve steril su 25 ml ile yıkayın. Sonra 3 MM filtre kağıdı içeren plastik Petri tabağına tohumları dökün ve kaputun altında kurumaya bırakın, iki kez steril su ile yıkama tekrarlayın. 2 gün süre ile 4 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir. </li><li> ½ MS phytagel (Murashige ve Skoog orta yarısı konsantrasyonu), 150 mm petri (plaka için ~ 250-300 tohumları) üzerine Plaka tohumları. </li><li> 2 hafta için plaka üzerinde M1 tohumlar büyüyecek, daha sonra toprağa nakli. </li><li> M2 hatları (1000 bağımsız hat) oluşturmak için bireysel M1 bitkilerden M2 tohumlar toplayın. </li></ol>M2 ve M3 Populasyonlarının ove_title &quot;&gt; 2. Konfokal Tarama Bu bölümde daha önce 8 açıklandığı gibi bir konfokal veya floresan mikroskobu ile fide gözlem açıklar. <ol><li> Her M2 hattan altmış tohumları plastik Petri, 7 ila 10 gün, ½ MS phytagel için yetiştirilen; aynı plaka üzerinde de (kontrol), EMS-tedavi edilmemiş 5 fideleri yetiştirilmektedir. </li><li> Beş on kotiledon bir mikroskop lamı üzerine objektif (40X) doğru eksen dışı tarafı ile monte edilmiş ve bir coverslip ile birlikte verilmektedir. </li><li> Her kotiledon organelidir işaretleyici her değişmiş Subselüler dağıtılması için floresans altında, kortikal gelen medyal bölgeye, görülmektedir. </li><li> Pozitif bitkiler toprak nakil vardır ve bunların tohumları toplanır ve M3 nesil mutant fenotip onaylamak için tekrar taranmaktadır. </li><li> Muhtemelen birlikte bir yabani tip genomuna backcrossing yoluyla mutasyonlar arka kirletici en az üç kez çıkarınİstediğiniz organel floresan işaretleyici ntaining. <ol><li> Anne bitki, ince makas veya forseps kullanarak olgun siliques kaldırmak ve açık çiçekler. </li><li> Meristemlerinde çok küçük tomurcuklar çıkarın. </li><li> Yaprakları ve bir çiçek tomurcuğu açın ve tüm anter kaldırmak için çanak yaprakları arasında forseps bir çift ucu yerleştirin. </li><li> Forseps bir çift kullanarak baba bitki açık bir olgun çiçek alıp hadım bitkinin tepeciklerdeki anter ovalayın. </li></ol></li></ol> 3. Haritalama Bu bölümde, geleneksel haritalama yöntemleri 10,11 ile kıyaslandığında daha hızlı Borevitz 9 değiştirilmiş bir protokolü kullanan bir resesif mutasyon eşlemek aslında açıklamaktadır. Bu yaklaşım tek bir tahlil 12 sayısız tek özelliği polimorfizmleri (SFP) tespit etme yeteneğine sahip yüksek yoğunluklu oligonükleotid diziler kullanın. Affymetrix Arabidopsis ATH1 GeneChip dizi kullanmak mümkünyaklaşık 24.000 gen analiz. Mutasyon gösteren F 2 bireylerin bir havuz aynı ayırma nüfus içinde toplanan yabani tip F 2 bitkilerin bir havuz ile karşılaştırılır. Daha sonra, mutasyon mutant havuzu mutant genotip allelleri için zenginleştirilmiş bölgede eşlenecek ve dolayısıyla aynı bölgede yabani tip havuzu vahşi tip üst allelleri 13 zenginleştirilmiş sonuçlanacaktır. <ol><li> Genomik DNA (3 mg) bir Qiagen DNeasy Bitki Mini Kit kullanılarak homozigot mutant Columbia (M3) elde edilir ve Illumina Genom Analyzer II (GA II) 14 sıralaması için sunulmuştur. </li><li> Homozigot mutant Columbia (M3) bir eşleme nüfus üretmek için Landsberg erecta ile çarpı işareti vardır. </li><li> Haritalama anormal fenotip ve vahşi tip fenotipi ile F2 bitkilerin aynı sayıda gösteren 70 kadar 100 F2 bireyler üzerinde yapılır. </li><li> Bir delik açma kullanarak yaprak disk her bitki (0,60 mm) toplayın.yaprak disk DNA benzer miktarda olduğundan emin olmak için aynı yaştaki yapraklarından elde toplanmalıdır. Örnekler genomik ekstraksiyon ayrı ayrı veya gruplar için işlenebilir. Bu durumda, bu sonuçta bir genomik DNA elde edilmesi için olan hangi az Eppendorf tüpler sahip olacak şekilde her bir Eppendorf tüpüne için 5-10 örnekleri toplamak mümkündür. </li><li> MasterPure Bitki Yaprak DNA izolasyon kiti (Epicentre) genomik DNA elde etmek için kullanılmaktadır. Her bir numune elde edilen bir genomik DNA nanodrop ile ölçülür. </li><li> Her örnek genomik DNA aynı miktar daha sonra bitki DNA&#39;ların 300 ng (~ 30 uL) toplam kadar birlikte alınır; 60 uL 2.5X rastgele primerler çözümü eklemek [125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 12.5 mM MgCl2, 25 mM 2-merkaptoetanol, 750 ug / ml oligodeoksiribonükleotid primerler (rastgele octamers)] (Bioprime kiti) ve 42 uL su (nihai hacim 132 uL). </li><li> Denatüre&gt; 95 ° C de DNA&#39;lar 5-10 dakika için. </li><li> Buz üzerinde serin. </li><li> Her denatu içinkırmızı bir DNA Biotin dCTP [1 mM biyotin-14-dCTP, 1 mM dCTP, 2 mM dATP, dGTP 2 mM, 10 mM Tris-HCl içinde 2 mM dTTP (pH 7.5), 1 mM Na2EDTA] ile 15 uL 10X dNTP karıştırılır (Bioprime kiti) ve 3 uL Klenow polimeraz (Bioprime kiti) ile tamamlamak. </li><li> 25 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe </li><li> Karması; Ertesi gün, 15 uL 3 M NaOAc ve 400 uL soğuk% 100 EtOH ekleyin. </li><li> 1 saat -80 ° C&#39;de inkübe edin, sonra 15 dakika 20,500 xg&#39;de spin süpernatant kaldırmak ve 500 uL soğuk% 75 EtOH ile yıkayın. </li><li> 10 dakika süreyle 20,500 x g&#39;de dönerler. </li><li> 100 uL su içinde 10 dakika ve Pastör pipetiyle için 37 ° C&#39;da kuru bir DNA peletleri. </li><li> Bir jel (Şekil 2) verim ve kalite kontrol etmek için 5 uL kullanın. </li><li> Için yabani tip ve mutant GeneChip Arabidopsis ATH1 Genom Array Hibridizasyon için reaksiyon etiketleme 95 uL gönder. </li><li> R yazılım (kullanarak diziler taranır ve elde. CEL dosyaları analiz edilir <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.o</a>rg /). </li><li> R yazılımı yükleyin, sonra programı açın ve aşağıdaki dize yapıştırın: kaynağı (&quot; <a href="http://bioconductor.org/biocLite.R">http://bioconductor.org/biocLite.R</a> &quot;) biocLite () Sonra geri dönüş tuşu-Bu standart Bioconductor paketleri (kuracaktır basın <a href="http://www.bioconductor.org">http://www.bioconductor.org</a> ). </li><li> Masaüstünde yeni bir klasör, aşağıdaki web sitesinden (indirdiğiniz <a href="http://www.naturalvariation.org/methods">http://www.naturalvariation.org/methods</a> ) dosyaları: readcel.R SFP.R Map.R ath1V5.RData ColLerCEL.zip Dosya ColLerCEL.zip ambalajsız ve sonuç dosyaları yeni klasöre yapıştırılır. </li><li> Wildtype.CEL ve mutant.CEL içine GeneChip deneyden elde edilen veriler yeniden adlandırın. </li><li> Lütfen GeneChip veriler artık kopyalayın (wildtype.CEL veKlasör içine mutant.CEL). </li><li> Açık R, Mac için): ardından &quot;Çeşitli&quot; ve &quot;Değişim çalışma dizini&quot; seçeneğine tıklayın. b) PC için: tıklayın &quot;Dosya&quot; ardından &quot;Değişim dizini&quot; </li><li> Mac için: a) dosyalarını içeren klasörü seçin. &quot;Çalışma Alanı&quot;, &quot;Yük çalışma alanı dosyasını tıklatın:&quot; sonra &quot;Dosya, Yük çalışma alanı&quot; &quot;PC için basıp ath1V5.RData, b) Yukarıda dosyalarını içeren klasörü seçin,&quot; ve ath1V5.RData seçin. </li><li> Açık readCEL.R Not Defteri&#39;ni kullanarak ve R. için tüm metni kopyalamak </li><li> Açık SFP.R Not Defteri&#39;ni kullanarak ve R. için tüm metni kopyalamak </li><li> Açık Map.R Not Defteri&#39;ni kullanarak ve R. için tüm metni kopyalamak </li><li> Konsol penceresinde aşağıdaki iletiyi görürsünüz: Kromozom x Mb yz sınırlar TAIR arayın genleri bu linki yapıştırın 3 <a href="http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y&amp;end=z">http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y</a>Ve sonunda = z </li><li> İnternet tarayıcınıza linki kopyalayıp yapıştırın. Bir pencere açılacak ve dosyayı açmak veya kaydetmek için sorar; kaydetmek seçmelisiniz. Bir dosya adı seçin ve uzantısı ekleyiniz &quot;. Xls&quot; Kaydet öğesini tıklatın. </li><li> Bu dosyayı açmaya Eğer mutant için koordinat (sonucu grafiksel Şekil 3&#39;te temsil edilir) bulabilir &quot;. Xls&quot;. </li><li> Monte Illumina olduğu eşleşen alanı içinde mutant genomunun okur tek nükleotid polimorfizmleri arasında belli EMS geçişler 4 tanımlamak. Standart prosedürler kullanılarak 15 vahşi tip gen (ler) ile dönüşümün mutant fenotip tamamlar. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 konfokal mikroskopi kullanılarak tarama sekretuar yolunun bir mutant belirlenmesi için kullanılan bir yaklaşım göstermektedir. Şekil 2 dizi hibridizasyon için etiketli genomik DNA tipik bir hazırlık gösterir. Şekil 3, GeneChip Arabidopsis ATH1 Genom Array elde edilen veriler sunulmuştur analiz ettikten sonra beklenen tipik bir sonucu olarak. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig1.jpg" /> SsGFPHDEL (ER işaretleyici) (1) ifade Şekil 1. Arabidopsis transgenik EMS muamele tesislerinde (2) için yeterli tohum üretmek için yetiştirildi. EMS ile muamele edilen tohumlarda sonra M1 bitkilerinin (3) oluşturmak için ekilmiştir. Her M1 bitki farklı bir çizgi temsil eder ve tohum her birinden ayrı ayrı toplandı. M2 tohum ½ MS substrat (4) üzerine kaplama ve sonra konfokal mikroskopi (5) ile ER morfolojisi kusurlar için tarandı. Tarama sırasında biz yabani tip ER morfolojisi (6) ve kusurlu ER fenotipleri (7) göstermek bitkiler ve koruyan bitkiler bulundu. Bu bitkiler M3 nesli elde etmek ve fenotipi (8) onaylamak için yetiştirilmiştir. M3 bitki genomik DNA sekanslama Solexa Illumina (a) için kullanıldı. Aynı bitkiAyrıca, F2 eşleme nüfusu (b) elde etmek için Ler-WT ile melezleme için kullanılmıştır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig2.jpg" /> Şekil 2,. Bioprime rastgele etiketleme reaksiyonları (100 uL 5 ul) 1 agaroz jel% üzerine yüklendi. Lane vahşi tip F2 bitkilerin bir havuzdan ve şerit b mutant F2 bitkilerin bir havuz değil. (Marker NEB gelen, 1 Kb DNA merdiveni-N3232) olduğunu. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig3.jpg" /> Şekil 3. Şekil GeneChip Arabidopsis ATH1 Genom Array Hibridizasyon kullanarak Col-0 mutasyon eşleme örneği temsil eder. Bu örnekte mutasyonu dikey çubuklarla kromozom 1, sınırlandırılmış bulunmaktadır. Yatay çubuklar tespiti için eşiklerin temsil eder.

<ol><li>Marti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+missense+mutation+in+the+vacuolar+protein+GOLD36+causes+organizational+defects+in+the+ER+and+aberrant+protein+trafficking+in+the+plant+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).</li>
<li>Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+the+spatial+and+dynamic+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+and+Golgi+apparatus+is+influenced+by+the+integrity+of+the+c-terminal+domain+of+RHD3%2C+a+non-essential+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase.</a> The Plant Journal. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMS+mutagenesis+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">EMS mutagenesis of Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).</li>
<li>Maple, J., Moller, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis in Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).</li>
<li>Greene, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+chemically+induced+mutations+from+a+large-scale+reverse-genetic+screen+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164, 731-740 (2003).</li>
<li>Krieg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethyl+methanesulfonate-induced+reversion+of+bacteriophage+T4rII+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants.</a> Genetics. 48, 561-580 (1963).</li>
<li>Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+variation+of+the+somatic+mutation+frequency+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants.</a> The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).</li>
<li>Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Golgi+apparatus%3A+from+imaging+to+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes.</a> Traffic. 9, 1613-1617 (2008).</li>
<li>Borevitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+and+mapping+with+high-density+oligonucleotide+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays.</a> Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).</li>
<li>Konieczny, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+mapping+Arabidopsis+mutations+using+co-dominant+ecotype-specific+PCR-based+markers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).</li>
<li>Bell, C. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+30+microsatellite+loci+to+the+linkage+map+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis.</a> Genomics. 19, 137-144 (1994).</li>
<li>Hazen, S. P., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+arrays+are+not+just+for+measuring+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Gene arrays are not just for measuring gene expression.</a> Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).</li>
<li>Hazen, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+array+mapping+of+circadian+clock+and+developmental+mutations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).</li>
<li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeigel%2C+D+%22A+Laboratory+Manual%22">A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2002).</li>
<li>Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+for+clinical+diagnostics-principles+and+application+to+targeted+resequencing+for+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+a+paper+from+the+2009+William+Beaumont+Hospital+Symposium+on+Molecular+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology.</a> J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Burada endomembrane mutantların tanımlanması için bir konfokal mikroskopi tabanlı tarama nitelendirdi. Bu yaklaşım kolaylıkla spesifik floresan protein belirteçler mevcut olduğu hücrenin diğer organelleri kadar uzatılabilir. Ekran hedef organel veya işaretleyici içeren gerekiyordu değil organeller için ya floresan işaretleyici bir anormal dağılım gösteren mutantların tanımlanması dayanmaktadır. Sırasıyla, bu mutantlar işaretleyici subcompartimentalize için organel yeteneği ya tehlikeye düşer, aldığı nüfus veya düzgün or...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Ethylmethane sülfonat </td><td> Sigma </td><td> M0880 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT Baker </td><td> 3722-05 </td></tr><tr><td> Murashige Skoog bazal orta w Gamborg vitaminler </td><td> Bitkisel teknolojileri Laboratuvar </td><td> M404 </td></tr><tr><td> Phytagel </td><td> Sigma </td><td> P8169-1Kg </td></tr><tr><td> RNeasy Mini kiti </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Ana saf bitki yaprak DNA saflaştırma kiti </td><td> Epicentre </td><td> MPP92100 </td></tr><tr><td> Bioprime DNA etiketleme sistemi </td><td> Invitrogen </td><td> 18094-011 </td></tr><tr><td> Alkol 200 kanıtı </td><td> Dekan laboratuvarları inc. </td><td> 2716 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> JT Baker </td><td></td></tr><tr><td> Gen çip Arabidopsis ATH1genom dizisi </td><td> Affymetrix </td><td> 900385 </td></tr><tr><td> Falcon tüpler 50 mL </td><td> corning </td><td> 430290 </td></tr><tr><td> Eppendorf Tüp 1,5 ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 90mm Filtre kağıdı </td><td> Whatman </td><td> 1001090 </td></tr><tr><td> Analitik Terazi </td><td> Mettler Toledo AB54-S </td><td> na </td></tr><tr><td> Nutating (dalga) çalkalayıcı </td><td> Heidolph Polymax 1040 </td><td> na </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Eppendorf 5417-R </td><td> na </td></tr></tbody></table>

floresans-mikroskopi tarama ve nesil sekanslama: organel bütünlüğü ile ilgilendim genlerin belirlenmesi için faydalı araçlar

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Bu protokol Arabidopsis fidelerinin bir floresan mikroskop tabanlı tarama açıklanır ve sekretuar yolun belirli bir etiketli floresan marker Subselüler dağılımını değiştirebilir resesif mutasyonlar eşlemek anlatılmaktadır. Arabidopsis nedeniyle genom büyüklüğü genetik çalışmalar için güçlü bir biyolojik model, nesil zaman ve krallıkları arasında moleküler mekanizmaları korunması. Moleküler belirteçler dayalı geleneksel yönteme alternatif olarak mutasyon eşlemek için bir yaklaşım olarak genotipleme dizi nispeten hızlı olduğu için avantajlı olduğunu ve gerçekten çok kısa süre içerisinde birçok mutantların haritalama izin verebilir. Bu yöntem, bitkilerde herhangi bir organelidir bütünlüğünü etkileyebilir proteinlerin tanımlama sağlar. Burada bir örnek olarak, endoplazmik retikulum (ER) bütünlüğü için önemli gen haritası için bir ekran öneriyoruz. Bizim yaklaşımımız, ancak kolayca diğer bitki hücre organelleri uzatılabilir(Örneğin 1,2 bakınız), ve böylece diğer hücre içi yapıları düzenleyen moleküler temelini anlamaya yönelik önemli bir adımı temsil etmektedir.

Hücre biyolojisinde temel bir arayış ökaryotik hücrelerin yapmak organellerin kimliği altında yatan mekanizmaları belirlemektir. Burada floresan mikroskobu ve yeni nesil dizileme araçlarını kullanarak bitki organel morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğü sorumlu genleri tanımlamak için bir yöntem öneriyoruz.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

Bu protokol, Arabidopsis fidelerinin floresan mikroskop tabanlı bir taramasını tanımlamakta ve ...'yı değiştiren resesif mutasyonların nasıl haritalanacağını açıklamaktadır.

Bu deneyin amacı, bitki organellerinin morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğünden sorumlu olan geni veya genleri belirlemektir. Bu işlem, öncelikle organel floresan markörü taşıyan atopi tohumlarına mutajen olarak kimyasal bir ajan olan etil metan sülfonat eklenerek gerçekleştirilir. İkinci adım ise, sonraki mutant nesil M2'nin hatlarını yetiştirmek amacıyla, ilk mutajen neslin tekil bitkilerinden tohum toplamaktır.Ardından, aberrant organal fenotipi belirlemek için mutagen a Eliana tohumları konfokal veya floresan mikroskop kullanılarak gözlemlenir. Son adım, üçüncü mutagen neslin oluşturulması ve mutant fenotipin varlığının doğrulanmasıdır. Nihayetinde, resesif mutasyon yeni nesil dizileme araçları kullanılarak haritalanabilir.Mutant genin konumu belirlendikten sonra, yabanıl tip gen ile transformasyon, anormal organel fenotipini düzeltmelidir. Bu yöntem, bitki organellerinin morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğünün korunmasına ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Atil metanlar, atop sta tohumlarının sülfonatla işlenmesi, genomda sitozin zamanlama değişikliklerini tetikleyerek sitozin gwan'dan zamanlamaya yol açar.Mutasyonların eklenmesi. M2 bireylerinde mükemmel

fluorescence-microscopy-screening-next-generation-sequencing-useful

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

GFP-füzyon proteinleri yaygın konfokal mikroskobi organelleri görselleştirmek için kullanılır. Ancak, genellikle bireysel mutagenez organellerin morfolojisini etkileyen mutasyonlar için tarama gerektirir ve zaman alıcıdır. Burada, neredeyse 5.000 maya gerekli olmayan genlerin aynı anda organel-GFP işaretleri dahil etmek için bir yöntem göstermektedir.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

Bozulma ve geri dönüşüm için maya vakuol asidik lümen organelleri teslim izlemek için sağlam bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış çift emisyon floresan pH biyosensör ve floresan mikroskobu kullanarak tek tek hücrelerin görselleştirme hedef organellerin özel etiketleme dayanmaktadır.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Bu videoda, deterjan çözünmesini takiben Escherichia coli'de yeşil floresan proteini (GFP) ile kaynaşmış membran proteini stabilitesini taramak için bir floresan algılama boyut dışlama kromatografisi tekniği gösteriyoruz. Boyut dışlama profilinde çok az veya hiç serbest GFP ile simetrik bir tepe sergileyen proteinler, daha sonra yapı-fonksiyon analizi için seçilebilen, minimum bozunma ve agregasyon ile saflaştırılmış proteinleri gösterir.

Floresan Algılama Boyut Dışlama Kromatografisi: Deterjan Çözündürmesi Üzerine Floresan Membran Proteinlerinin Bütünlüğünü Belirleme Tekniği

Mitophagy, takas zarar mitokondri, süreci mitokondrial homeostazı ve sağlık bakım için gereklidir. Bu makale en son mitophagy bazılarını algılama yöntemleri insan hücreleri, Caenorhabditis elegansve fareler sunar.

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Protein toplama ve merkezi sinir sistemi Drosophila modellerinin autophagic akı floresan-görüntüleme tabanlı cep biyolojik çalışmalar nicel veri ayıklamak için bir basit ve uyarlanabilir iş akışı geliştirdiğimiz ateş.

Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Bu çalışmada, sinaptik boyut ve lokalizasyon, kas Morfoloji ve marochondrial şekil nicel ölçümler serbestçe kullanılabilir görüntü işleme araçları kullanarak C. elegans özetliyor. Bu yaklaşım, C. elegans 'da gelecekteki çalışmaların, genetik mutasyonların bir sonucu olarak doku ve organel yapısal değişikliklerin kapsamını nicel olarak karşılaştırmasına olanak sağlar.

Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Mitofaji'yi elektron mikroskobu, genetik sensörler ve immünofloresan yoluyla keşfetmek, pahalı ekipman, yetenekli personel ve önemli bir zaman yatırımı gerektirir. Burada, ticari bir floresan boya kitinin hem Caenorhabditis elegans hem de bir karaciğer kanseri hücre hattındaki mitopaji sürecini ölçmedeki etkinliğini gösteriyoruz.

Caenorhabditis elegans ve Memeli Hücrelerinde Mitopajinin Organele Özgü Boyalar Kullanılarak Saptanması

Bu protokol, yaşlanma sırasında C. elegans'ın çoklu dokularında mitokondriyal morfolojiyi görüntülemek için standart bir yaklaşım sağlar.

Yaşlanma Sırasında C. elegans'ta Mitokondriyal Morfolojinin Görüntülenmesi ve Ölçülmesi

İşte biz görüntüye bir temel protokolü açıklamak ve siRNA transfeksiyon sonra canlı memeli doku kültürü hücrelerinde mitoz zamanlama ölçmek.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Öğrenin bitki organellerinin morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğünü sağlayan genleri floresans mikroskobu ve yeni nesil dizileme kullanarak belirleme yöntemini. Bu yaklaşım genetik mutasyonların haritalanmasını kolaylaştırır.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

Daha fazla video keşfet