Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

Bu deneyin amacı, bitki organellerinin morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğünden sorumlu gen veya genleri tanımlamaktır. Bu, önce organel floresan işaretleyiciyi taşıyan mutajen atopi tohumlarına kimyasal bir ajan olarak Ethel metan sülfonat eklenerek gerçekleştirilir. İkinci adım, sonraki mutant nesil M iki'nin hatlarını büyütmek için birinci mutajen neslinin bireysel bitkilerinden tohum toplamaktır.

Daha sonra, mutajen a Eliana tohumları, anormal organal fenotipi tanımlamak için konfokal veya floresan mikroskop kullanılarak gözlemlenir. Son adım, üçüncü mutajen neslini oluşturmak ve mutant fenotipin varlığını doğrulamaktır. Sonuç olarak, resesif mutasyon, yeni nesil dizileme araçları kullanılarak haritalanabilir.

Mutant genin yeri belirlendikten sonra, vahşi tip gen ile transformasyon, anormal organal fenotipi eski haline getirmelidir. Bu yöntem, bitki organellerinin morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğünün korunmasında kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Atil metanlar, sta tohumlarının sülfonat muamelesi, genomda sitozin zamanlama değişikliklerine neden olur ve bu da sitozin gwan'ın zamanlamaya neden olur.

Mutasyonlar ekleme. EMS tedavisi, M iki bireyde mükemmel bir oran mutasyonu sağlamak için bu protokolde önemli bir adımdır. Başlamak için, daha önce ilgili bir organel floresan işaretleyicisi taşıyacak şekilde tasarlanmış yabani tip Columbia Ecotype'ın Arabidopsis tohumlarını elde edin.

0.8 gram veya yaklaşık 40.000 tohumu 50 mililitrelik bir şahin tüpüne aktarın. Ardından 25 mililitre damıtılmış su ve% 0.2 Ethel metan sülfonat ekleyin. Karışımı, inkübasyonu takiben düşük hızda mutasyona uğrayan bir karıştırıcı üzerinde 16 saat inkübe edin, sıvıyı aspire edin ve bir molar sodyum hidroksit içeren bir flas içine atın.

EMS'yi etkisiz hale getirmek için, tohumları içeren Falcon tüpüne 25 mililitre su ekleyin. Tüpü kapatın ve tohumları yıkamak için beş kez ters çevirin. Tüm tohumlar yerleştikten sonra, suyu aspire edin ve bir molar sodyum hidroksit şişesine atın.

Son yıkamadan sonra bu yıkama adımını 10 defaya kadar tekrarlayın, Reese tohumları minimum miktarda suda harcar. 25 mililitre% 10 çamaşır suyu ekleyerek ve 30 saniye kuvvetlice çalkalayarak tohum sterilizasyonuna devam edin. Tohumlar dibe çöktüğünde, ağartıcıyı dökün ve 25 mililitre steril su ile durulayın.

Steril suyun çıkarılmasının ardından 25 mililitre% 70 etanol ekleyin. Tüpleri 30 saniye çalkalayın ve tohumların dibe çökmesine izin verin. Etanolü dökün ve 25 mililitre steril su ile durulayın.

Steril suyla yıkamayı iki kez tekrarlayın. Daha sonra tohumları üç mm filtre kağıdı içeren plastik bir Petri kabına dökün. Tohumları dört santigrat derecede iki gün kuluçkaya yatırdıktan sonra tohumların kaputun altında kurumasına izin verin.

Tohumları 150 milimetrelik bir Petri kabına, plaka başına yaklaşık 250 ila 300 tohum olacak şekilde yarım Magi ve scoog ortamı içeren savaşçı jeli içine yerleştirin. Bir jelleşme ajanı olarak, M1 neslinden elde edilen tohumları iki hafta boyunca plakalarda büyütün. Fideleri toprağa nakledin ve bitkilerin büyümeye devam etmesine izin verin.

30 ila 45 gün sonra, bitkiler olgunlaştıkları yerde olgun aşamaya ulaşacak, böylece sızıntılar net bir şekilde görülebilecektir. Bu noktada, 1000 bağımsız M iki çizgi oluşturmak için tek tek M1 bitkilerinden M iki tohum toplayın. Fideleri konfokal veya floresan mikroskobu ile gözlemlemek için, plastik Petri kapları üzerinde yedi ila 10 gün boyunca her M iki satırından 60 tohum büyütün.

Moreish ve scoog ortamı içeren savaşçı jel, aynı plaka üzerinde EMS işlenmemiş kontrolünün beş fidesini de yetiştirir. Fideler büyüdükten sonra, ABAC conta tarafı bir mikroskop lamı üzerinde 40 kez merceğe doğru beş ila 10 cos girişi monte edin ve floresan altında bir örtü kayması ile çevreleyin, organel markörünün değişen hücre altı dağılımı için kortikal bölgeden medial bölgeye kadar her oleini gözlemleyin. Pozitif bitkilerin toprağa nakledilmesinin ve fidelerin az önce tarif edildiği gibi büyümesinin ardından, mutant fenotipin M üç neslinde olduğunu doğrulayın.

Yazılı protokolde açıklandığı gibi, istenen organal floresan markörü içeren vahşi tip bir genoma en az üç kez geri çaprazlama yoluyla kirletici arka plan mutasyonlarını çıkarın. Haritalamaya başlamak için, homozigot mutant Columbia DNA'sını temsil eden M üçten yaklaşık üç mikrogram genomik DNA çıkarmak için cogen DN Easy Z bitki mini kitini kullanın. Bu DNA'yı Illumina genom analizörü iki 14 dizilimi için gönderin.

Bir sonraki adım, zago mutantı Kolombiya'yı geçmek ve kombinasyonun meydana gelebileceği kendi kendine tozlaşmayı takiben tek bir döl oluşturmak için Las Berger'i geçmektir. Sağır diş üretimi sonuçlanacak ve nihayetinde mutasyona neden olan ilgilenilen geni içeren bir haritalama popülasyonu olarak hizmet edecektir. Bu popülasyonun genomik DNA'sı ile kuyu tipi bitkilerin genomik DNA'sı karşılaştırılarak, mutasyonun genomdaki yeri belirlenebilir.

F iki bitkinin büyümesinden sonra, 70 ila 100 F arasında anormal fenotipi gösteren iki birey ve aynı sayıda F yabani tip fenotipe sahip iki bitki toplayın, her bitkiden tam bir zımba kullanarak bir yaprak diski toplayın. Yaprak diski aynı yaştaki yapraklardan toplanmalıdır. Benzer miktarlarda DNA sağlamak için, numuneler ayrı ayrı veya gruplar halinde genomik ekstraksiyon için işlenebilir.

Bu durumda, genomik DNA'nın çıkarılması gereken daha az tüp olması için her bir eend orph tüpü için beş ila 10 numune toplamak mümkündür. Genomik DNA'yı çıkarmak için ana saf bitki yaprağı DNA saflaştırma kitini kullanın. Her bir numuneden elde edilen genomik DNA daha sonra bir NanoDrop ile ölçülebilir.

Daha sonra, her numuneden toplam 300 nanograma kadar eşit miktarda DNA'yı birleştirerek, önce etiketleme reaksiyonunu yapmak için mutant ve vahşi tip numuneleri ayrı tutarak, 60 mikrolitre 2.5 x rastgele primer çözeltisi ve 42 mikrolitre su ekleyin. DNAA'yı beş ila 10 dakika boyunca 95 santigrat dereceden daha yüksek denatüre ettikten sonra, DNA'yı denatüre etmek için örnekleri buz üzerinde arayın. 15 mikrolitre 10 X DN tps ekleyin.

Biotin DCTP ile karıştırın ve üç mikrolitre ile tamamlayın. Glen polimeraz. Numuneleri gece boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün 15 mikrolitre üç molar sodyum asetat ve 400 mikrolitre soğuk %100 Etanol ekleyin. Karışık numuneleri eksi 80 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin, ardından 20, 500 kez G'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. İkinci bir dönüşün ardından peleti 500 mikrolitre soğuk, %75 etanol ile yıkayın.

DNA peletlerini 37 santigrat derecede 10 dakika kurutun. Peletleri 100 mikrolitre suda yeniden süspanse edin ve bir jel biyosunda verimi ve kaliteyi kontrol etmek için beş mikrolitre kullanın. Asal rastgele etiketleme reaksiyonları, yabani F tipi iki bitkiden oluşan bir havuzdan ve mutant F iki bitkiden oluşan bir havuzdan% 1'lik bir aros jeli üzerine yüklendi.

Son adım olarak, bir genom dizisi hibridizasyonuna sahip gen çipi arabidopsis için vahşi tip ve mutant etiketleme reaksiyonundan 95 mikrolitre gönderin. Silgi tarandıktan sonra, elde edilen nokta CL dosyaları yazılımımız kullanılarak analiz edilir. Yazılımımızı kurduktan sonra programı açınız ve yazılı prosedürde bulunan biyoiletken dizesini yapıştırınız.

Ardından, dizi, genotipleme ve haritalama web sitesinden standart BIOCONDUCTOR paketlerini yükleyecek olan return tuşuna basın. Metinde listelenen dosyaları indirin ve masaüstünde yeni bir klasöre açın. Gen çipi deneyinden elde edilen verileri vahşi tip C, L ve mutant C'ye bırakın. Şimdi vahşi tip C ve mutant C için gen çipi verilerini klasöre kopyalayın.

Ardından, bir PC için R'yi açın. Dosya'yı tıklatın ve sonra dizini değiştir'i tıklatın. Dosyaları içeren klasörü seçin, dosya yükleme çalışma alanına tıklayın ve ardından A bir V beş R verisini açın, not defteri kullanarak C do R yapın ve metnin tamamını Mac'te R'ye kopyalayın, mis'e tıklayın ve ardından çalışma dizinini değiştir'e tıklayın.

Dosyaları içeren klasörü seçin. Çalışma alanı yükleme çalışma alanı dosyasına tıklayın ve ATH bir V beş R verisi'ni seçin. Benzer şekilde, metin kullanarak hem SFP R'yi hem de MAP R'yi açın, metni düzenleyin ve konsol penceresinde R'ye kopyalayın.

Arabidopsis bilgi kaynağında veya TAIR'de genleri aramak için bir mesaj görünecektir. Metinde bulunan bağlantıyı kopyalayıp internet tarayıcısına yapıştırın. Bir pencere açılacak ve dosyayı açmanızı veya kaydetmenizi isteyecektir.

Kaydet'i seçin. Bir dosya adı seçin ve uzantıyı ekleyin. X ls yapın.

Ardından kaydet'i tıklayın. Burada gösterilen, beklenen tipik bir sonuçtur. Gen çipi Arabidopsis H bir genom dizisinden elde edilen verileri analiz ettikten sonra, bu şekil, yatay çubukların tespit eşiklerini temsil ettiği bir H genom hibridizasyonu, bir H bir genom hibridizasyonu olan gen çipi Arabidopsis kullanılarak Columbia sıfır mutasyonunun haritalanmasının bir örneğini temsil eder.

Bu örnekteki mutasyon, dikey çubuklarla sınırlandırılmış birinci kromozom üzerinde bulunur. Eşlenen alandaki mutantın koordinatını bulmak için dot XLS dosyasını açın. Mutant genomun birleştirilmiş Illumina okumalarında, tek nükleotid polimorfizmleri arasındaki spesifik EMS geçişlerini tanımlayın.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokolü tanımlayan yaklaşım, klasik haritalama yöntemine kıyasla üç kısa zaman diliminde geni haritalamak için kullanılabilir.