Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

Bu prosedür, 30 ila 60 dakika arasında taze üzüm suyu plakalarında embriyoların toplanmasıyla başlar. Plakayı göl kafesinden çıkardıktan sonra, embriyoları nemli bir fırça ile alın ve çift yapışkan bant üzerine yerleştirin. Koryon açılana kadar bir cımbızın yarısını kullanarak bir embriyoyu bandın üzerine yavaşça yuvarlayın.

Embriyoyu alın ve yavaşça kapağın üzerine yerleştirin. Bir het tutkal tabakasının üzerinden kaydırın. Yeterli embriyonuz olana kadar bunu tekrarlayın.

Dehidrasyondan sonra embriyolar enjeksiyona hazırdır. Merhaba, ben California Davis Üniversitesi Moleküler ve Hücresel Biyoloji Bölümü'nden Dr.Jonathan Sculley'in laboratuvarından Ingrid Bruce Musher. Bugün size drosophilas sinsityal embriyolarını mikro enjekte etmek için bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedürü mikro ttes ve mitral tabanlı motorların mitozdaki rolünü incelemek için kullanıyoruz. Örneğin, spesifik mitotik proteinlerin antikorlarını veya diğer inhibitörlerini mikro enjekte ediyoruz. Mitoz üzerindeki inhibitör etkisini analiz ederek, hedef proteinlerin işlevini belirleyebiliriz.

Öyleyse başlayalım. Deneyden iki ila üç gün önce hazırlıklara başlamak için, plastik bir şişenin zıt taraflarında yaklaşık bir santimetre karelik iki küçük delik açarak döşeme kafesini kurun. Delikleri pamuklu bir parça ile doldurun ve havanın akmasına izin verin.

Sinekleri şişeye hafifçe vurun ve ardından bir üzüm suyu tabağı ile örtün. Maya ile, bacak kafesini oda sıcaklığında tutun, sinekler deneyden en az bir gün önce 10 güne kadar yumurta bırakacaktır. Enjeksiyon için iğneleri çekin ve dört santigrat derecede tutun.

Deney gününde iğneleri hazırlayın ve yükleyin. İlk olarak, etiketli tübülini dondurucudan çıkarın ve beş ila 15 dakika boyunca buza koyun. Daha sonra, GPEM tamponu ile seyreltin ve ardından 13.000 RPM'de dört santigrat derecede 10 ila 15 dakika santrifüjleyin.

Son olarak, iğneye bir ila iki mikrolitre yükleyin ve dört santigrat derecede tutun. İğnede sıcaklığa bağlı polimerizasyonu önlemek için. Kapak fişini ayarlamadan önce, çift yapışkan bant kaydederek ve 100 mililitrelik bir şişeye yerleştirerek heptan yapıştırıcısı yapın.

Yaklaşık 50 mililitre heptan ekleyin, şişeyi kapatın ve birkaç gün sallayın. Embriyoları hazırlamadan önce, enjeksiyondan önce embriyoların yerleştirileceği bir dehidrasyon odası yapın. Bunu yapmak için, 35 milimetrelik bir kabın bir parçasını 100 milimetrelik bir Petri kabının içine koyun ve bir masanın kurutucu eklemesini sağlayın, sağ, bu da etrafına susuz kalsiyum sülfat ekler, böylece kurutucunun yüksekliği masadan ve kapaktan daha yüksek olmaz.

Embriyoları hazırlamaya başlamak için önce üzüm suyu tabağını her saat başı maya ile değiştirerek göl kafesinden toplayın, embriyolar toplama işleminin başlamasından yaklaşık iki saat sonra görüntülenmelidir. Kapak fişini hazırlamak için mikroskobun bir tarafına yerleştirin, hareket etmemesi için dört köşesini aşağı kaydırın ve bantlayın. Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak, kapak fişinin üzerine bir çizgi halinde bir kat heptan yapıştırıcı koyun.

Tutkal viskoz olmamalı ve birkaç saniye içinde kurumalıdır. Çok kalınsa, daha fazla heptan ekleyin. Son olarak, kapağın yanındaki slayta bir parça çift yapışkan bant koyun.

Nemli bir fırça ile kaydırın. Embriyoları üzüm suyu tabağından dikkatlice alın ve slayttaki çift yapışkan bandın üzerine yerleştirin. Daha sonra, corion açılana kadar embriyoları çift yapışkan bant üzerinde yuvarlamak için bir cımbızın yarısını kullanın.

Embriyoyu cımbıza yapışması için Corian'ın üzerinde nazikçe yuvarlayarak alın ve kapaktaki heptan yapıştırıcısının üzerine yerleştirin. Embriyonun uzun tarafı, örtü kaymasının uzun kenarına paralel olacak şekilde kaydırın. Bir sıraya 10 ila 20 embriyo yerleştirin.

Kapak fişini çıkarın ve üç ila sekiz dakika boyunca dehidrasyon odasına koyun. Süre, yerel neme ve enjekte edilecek miktara bağlıdır. Ardından, kapak kızağını vakumlu gres ile metal bir hazneye yerleştirin.

Son olarak, daha fazla dehidrasyonu önlemek için embriyoları halo karbon yağı ile kaplayın. Embriyolar artık enjeksiyon için hazırdır. İlk olarak, 16 x hedefinin altındaki embriyoları bulun.

Embriyoları uzaklaştırın ve odak düzlemini hareket ettirmeden iğneyi bulun. İğneyi ortalayın ve X veya Y yönünde hareket ettirmeden yukarı doğru hareket ettirin. İğneyi açmak için, kapak kaymasının kenarını görüş alanına koyun, ancak iğnenin olacağı yere koymayın.

Ve iğneyi aynı odak düzlemine indirin. Kapak fişini iğneye çarpana ve yavaşça kırana kadar çok dikkatli bir şekilde hareket ettirin. İğneyi yukarı doğru hareket ettirin.

Şimdi embriyoları görünür hale getirin. İğneyi yağın içine indirin ve iğneden güzel sıvı damlaları aldığınızdan emin olun. Embriyoyu sabit bir şekilde iğnenin içine taşıyın, embriyoya bir damla enjekte edin ve ardından embriyoyu uzaklaştırın.

Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, 60 veya 100 x objektifli konfokal mikroskopta gözlem için hazırdırlar. Bir kontrol embriyosu bu filmdeki gibi görünmelidir. Bu, eğirme diskli konfokal mikroskopta 100 x objektif ile görüntülenen GFP tübülin ve RFP histon eksprese eden bir embriyodur.

Gösterilen toplam süre sekiz dakikadır. Kutuptan kutba mesafe çizimleri çok tekrarlanabilir ve kontrol embriyolarında güvenilir bir başarı ölçüsüdür. 11'den 13'e kadar olan döngüler için burada gösterilenlere benzemelidirler.

Bu filmde gösterilen başka bir kontrol embriyosudur. Bu, KLP 61 FGFP'yi ifade eder ve r Domine tübülin enjekte edilir. Bu aynı zamanda dönen bir disk konfokalinde 100 x objektif ile görüntülendi ve toplam süre yedi dakikadır.

Bu film Mikroenjeksiyondan hemen sonra elde edildi ve r Domine tubulin konsantrasyonundaki gradyan filmin başında açıkça görülüyor. Bu embriyolar, Klp 61 F antikorunun mikroenjeksiyonundan sonra Klp 61 F'nin inhibisyonunu incelemek için kullanılabilir. Klp 61 FGFP'nin iğlerden kaybını görebiliriz.

Size az önce drosophilas insizyonel embriyolarının nasıl mikro enjekte edileceğini gösterdik. Bu prosedürü yaparken, kontrolleri yapmayı unutmamak, önce tek başına tampon veya rutin enjekte etme pratiği yapmak ve mitozun hücresel yoluyla normal şekilde ilerlediğinden emin olmak önemlidir. Tüm enjeksiyonlarınız güvenilir olduğunda ve hasara neden olmadığında, bir inhibitör enjekte edebilir ve bu özel inhibisyonun etkisini inceleyebilirsiniz.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.