Name: Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Öğrenin Drosophila melanogaster sinsityal embriyolarında mikroenjeksiyon ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleriyle mitoz dinamiklerini incelemeyi. Bu yöntem hücre bölünmesi ve gelişim biyolojisi araştırmaları için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokol şu anda bizim laboratuvarda kullanılan ve Dr David Sharp, Mijung Kwon, Patrizia Sommi, Dhanya Cheerambathur dahil olmak üzere pek çok kişi tarafından yıllar boyunca rafine olmuştur. Biz bu sistemde çalışma başlatılan erken Drosophila embriyoların manipülasyon ve mikroenjeksiyon (bkz. 13) mükemmel tavsiye bize sağladığı Dr Bill Sullivan (UCSC) teşekkür ederim. Biz tüm üyelerine Scholey laboratuvar teşekkür ediyorum. Drosophila mitoz üzerinde yaptığımız çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe GM55507 tarafından destekleniyor .

Tarifler: Üzüm Suyu plakalar: <ul><li> 5.5g bacto agar </li><li> 14.5 gr dekstroz veya glukoz </li><li> 7.15 g sakaroz </li><li> 45 ml üzüm suyu konsantresi (% 100 meyve suyu). </li><li> 204.5 ml H 2 0 </li><li> 625 ul 10N NaOH </li></ul> Tüm malzemeyi ve mikrodalga kaynayana kadar karıştırın. 2.8 ml asit karışımı (20.9 ml propiyonik asit, 2.1 ml fosforik asit, 27 ml H 2 0 asit karışımı) 35 mm Petri kaplarının üzerine dökün ve karıştırın. Bir ya da iki gün boyunca oda sıcaklığında katılaşmaya edelim. Plakalar yakında olacak değilseniz, 4 parafilm mühür ve tutmak ° C (RT kullanmadan önce gelmesini izin verin). Maya yapıştırın: Kalın bir hamur oluşturmak için bir tatlı kaşığı maya (Sigma YSC2, maya Saccharomyces cerevisiae tip II) su ile ilgili çözülür. Kullanımdan hemen önce, her bir üzüm suyu plaka üzerinde bu küçük bir miktar koyun. G-PEM tampon: <ul><li> 80 mM Na-BORU, pH 6.9 </li><li> 1 mM MgCl 2 </li><li> 1 mM EGTA </li><li> 1 mM GTP </li></ul> Enjeksiyon tamponu: <ul><li> 150 mM K-Aspartat </li><li> 10 mM K-fosfat </li><li> 20 mM imidazol, pH 7.2 </li></ul> Heptan tutkal: 100ml şişe çift yapışkan bant ve yeri önüne sermek, 50ml heptan hakkında birkaç gün için şişe ve taş mühür. Tutkal, çok kalın ise kullanırken, heptan ekleyin. Dehidrasyon haznesi: 100 mm Petri kabı, bir &quot;tablo&quot; yapmak için 35 mm çanak içinde bir parçası koymak ve Drierite yüksekliği &quot;tablo&quot; ve kapak daha yüksek olmadığını, bu yüzden etrafında Drierite (susuz kalsiyum sülfat) eklemek. Embriyolar ile lamel enjeksiyondan önce dehidratasyon için bu &quot;tablo&quot; alınacaktır. Bu en azından bazı belirten Drierite kullanımı ve renk değiştirdi bunu değiştirmek için iyi bir fikirdir. Protokol: Bu protokol, hemen hemen herhangi bir çözünen reaktif Drosophila sinsityal embriyo içine enjeksiyon için kullanılan olabilir: Örneğin, bir floresan gözlem ya da bir hedef protein inhibitörü için protein ya da her ikisi. Her şey hazır: , Plastik bir şişe atın (6 oz, Uygulamalı Bilimsel Drosophila yuvarlak alt), ters tarafta iki küçük delik (2 1cm hakkında) kesme: 1 .- deneyden önce 2 ila 3 gün, üzüm suyu plakaları ve kafes kurmak yatıyordu şişe ve şişe (bu hava akışına izin verecek) bir pamuk parçası ile doldurun, içine sinek dokunun ve üzüm suyu plaka ile kaplayın. 25 tutun ° C (veya oda sıcaklığı) yaklaşık 10 gün boyunca, sinekler embriyolar yatıyordu. Deney enjeksiyon için iğneler çekin 2 .- en az bir gün önce, bir Kopf İğne / Pipet çektirmesi modeli 720 ve ince cidarlı cam filamentler (Dünya Hassas Aletler tw100f) kullanın. Floresan tubulin enjeksiyon için iğne tutmak, 4 ° C sıcaklığa bağlı polimerizasyonu önlemek için iğne. Tubulin hazırlanması: Not: Tüm tubulin 4 yapılmalıdır ° C polimerizasyonu önlemek için. <ol><li> Dondurucu etiketli tubulin çıkarın ve 5 ila 15 dakika buz koyun. </li><li> G-PEM (4 ila 10 kat talep yoğunluğuna bağlı olarak) tampon ile seyreltilir. </li><li> 13k rpm hızında 4 Santrifüj ° C de 10-15 dakika. </li><li> Yük 1 - 2 ul içine iğne. </li></ol> Antikor veya kimyasal inhibitörü: (Bu test edilmesi gerekebilir) uygun bir konsantrasyon iğneler kullanarak, tubulin olarak hazırlayın. Antikor, G-PEM enjeksiyon tampon tampon veya PBS olabilir. Başka bir tampon gerekiyorsa, bu tampon bu tampon kendi başına herhangi bir hasara neden olur emin olmak için bir kontrol olarak enjekte edilmesi gerekecektir. Not: İnhibitör ve floresan tubulin karıştırılır ve konsantrasyonlarının izin verirseniz birlikte enjekte edilebilir. Aksi takdirde, floresan tubulin enjekte inhibitörü enjekte etmeden önce 5 ila 10 dakika bekleyin. Az embriyolar normal iyileşir bir çift enjeksiyon yaparken, daha fazla embriyolar ile başlamak. Embriyo toplama: <ol><li> Yatıyordu kafes yeni bir üzüm suyu plaka koyun. </li><li> Bir saat sonra bu plaka kaldırın, bu günün ilk toplama ve genellikle çok iyi değildir. Bu iptal edilebilir. </li><li> Plaka, her bir saat için embriyoları toplama tutmak için her saat değiştirin. </li></ol> Lamel hazırlanması: <ol><li> Bir mikroskop lamı bir tarafında 50 x 22mm lamel koyun. Slayt bantlayın dört bir yanına taşımak değildir. </li><li> Bir pamuk uçlu bir aplikatör, lamel (yapıştırıcı viskoz olmamalı ve birkaç saniye içinde kuru olmalıdır, aksi takdirde daha heptan eklemek) tek bir satırda bir katman heptan tutkal koydu. </li><li> Bir parça koyun.lamel tarafa doğru slayt yapışkan bant çift. </li></ol> Embriyo hazırlanması: Not: Embriyolar toplama başladıktan sonra yaklaşık 2 saat görüntülü olmalıdır, bu yüzden bu zaman dilimi içinde bitirmek için yeterli zaman izin aşağıdaki adımları başlayacak. <ol><li> Nemlendirilmiş bir fırça ile dikkatlice slayt çift yapışkan bant üzüm suyu plaka ve yer embriyolar pick up. </li><li> Koryon (dış zarı) açık tatili kadar dış kısmı cımbız kullanarak, çift yapışkan bant üzerinde embriyolar rulo. </li><li> Cımbız yapışıyor ve embriyo paralel lamel uzun kenarı uzun kenarı ile lamel heptan tutkal üzerine yerleştirin yavaşça koryon üzerine yuvarlanan embriyo Pick up. 10 ila 20 embriyolar bir satır yukarı ayarlayın. </li><li> Lamel çıkarın ve 3 ila 8 dakika (oda ve enjekte edilecek miktar nem bağlıdır) dehidrasyon odasında yerleştirin. </li><li> Vakum gres metal bir odasının üzerine yerleştirin. </li><li> Kapak Halokarbon petrol 700 ile embriyolar daha ileri dehidratasyonu önlemek için. Embriyolar artık enjeksiyon için hazır. </li></ol> Embriyo enjeksiyon: <ol><li> 16x objektif altında embriyoların bulun. </li><li> Embriyolar taşıyın ve odak düzlemli hareket ettirmeden iğne bulmak. </li><li> Merkezi iğne ve x veya y yönünde hareket ettirmeden yukarı hareket ettirin. </li><li> Iğne açık değilse, görüş alanı içinde lamel kenarına koyun, ancak iğne olacak yerde ve aynı odak düzlemli iğne düşük. Iğne vurur ve yavaşça açın bozulana kadar lamel çok dikkatli hareket ettirin. Iğne açık ise, 5. adıma geçin. (İğneler doldurmadan önce hidroflorik asit ile açılabilir). </li><li> Embriyoların (ancak iğne olacak) yağı koyun, içine iğne alt ve iğne güzel sıvı damla elde emin olun. </li><li> Iğne içine dikkatlice fakat istikrarlı bir embriyo hareket ve embriyo içine bir damla enjekte embriyo ve uzağa taşıyın. (Ya da enjeksiyon aparat yönergeleri izleyin). </li><li> Tüm embriyoların enjekte edildikten sonra, bir konfokal mikroskop gözlem için hazır. </li></ol> Görüntüleme: 60 veya 100X amacı ile konfokal mikroskop Görüntü embriyoların: Notlar: <ol><li> Embriyo mitoz çok hızlı olduğundan tam sürece bağlı olarak incelenmesi gereken bir zaman atlamalı dizi zaman aralığı, en fazla bir kaç saniye olmalıdır. </li><li> 3D serisi veya tek bir düzlemde ilgi sürecine bağlı olarak elde edilebilir. </li><li> Hızlı hareket inhibitörleri, enjeksiyon mikroskop görüntüleme mikroskop transfer hızlı olmak zorundadır. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1382/1382fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: Drosophila sinsityal embriyo mitoz çalışılması. Erken embriyo Çekirdekler 10 13 çekirdekleri formu kortekste bir tek tabaka ile devir sırasında, sitokinez olmadan hızlı bölünmeler tabi. Kortekste çekirdekleri ile erken embriyo şematik. B. Zaman atlamalı görüntüleme GFP-tubulin ve kutup kutup ayırma RFP-histon C. Arsa 11 döngüleri ifade embriyo embriyo etiketli proteinlerin GFP ve / veya RFP ifade edebilir ve diğer etiketli proteinlerin ve / veya inhibitörleri ile microinjected olabilir. , 12 ve 13 vahşi bir tip embriyo. Mil uzunluğunda izometrik uzunluğu ve çok tutarlı ve tekrarlanabilir uzama dönemleri dönemleri sergiler. Mili mikrotübül D. Dinamiği. Rodamin tubulin düşük konsantrasyonda enjeksiyon mikrotübül dinamiklerini incelemek için kullanılan bir kaç tubulin alt birimden oluşan benekler yol açar.

<ol><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li>
<li>Morris, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+methods+for+analyzing+the+functions+of+kinesins+in+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos.</a> Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-5-dependent+poleward+flux+and+spindle+length+control+in+Drosophila+embryo+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+anaphase+B%3A+role+of+three+mitotic+motors+in+a+switch+from+poleward+flux+to+spindle+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+flux+and+sliding+in+mitotic+spindles+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).</li>
<li>Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+partitioning+of+mitotic+kinesin-5+crosslinkers+between+microtubule-bound+and+freely+diffusing+states%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states.</a> J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).</li>
<li>Cheerambathur, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+an+anaphase+B+switch%3A+predicted+role+for+a+microtubule+catastrophe+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient.</a> J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).</li>
<li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromokinesin%2C+KLP3A%2C+dives+mitotic+spindle+pole+separation+during+prometaphase+and+anaphase+and+facilitates+chromatid+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility.</a> Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).</li>
<li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+coordination+of+three+mitotic+motors+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bipolar+kinesin%2C+KLP61F%2C+cross-links+microtubules+within+interpolar+microtubule+bundles+of+Drosophila+embryonic+mitotic+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles.</a> J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).</li>
<li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy%2C+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li>
</ol>

Bu protokol, ancak her adım embriyoların zarar görmediğinden emin olmak için pratik gerektirir, nispeten basittir. Dikkatli kontrol deneyleri her zaman güvenilir sonuçlar elde ediliyor olmasını sağlamak için yapılması gerekir. Iyi bir şekilde başlamak için GFP-tubulin ifade mitoz embriyo yüzey (döngüleri 13 üzerinden 10) tüm döngüleri ile normal olarak devam eder emin olmak için kontrol embriyolar içine tampon veya rodamin tubulin microinjecting. Kontrolü embriyolar, genellikle çok fazla dehidrasyon sonucu iğ arasında h...

mitoz incelenmesi için mikroenjeksiyon teknikleri drosophila melanogaster sinsityal embriyo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Bu protokol, Drosophila melanogaster sinsityal embriyo mitoz 1 eğitim için kullanımı anlatılmaktadır. Drosophila sıralı genomu ile yararlı genetik ve kolayca korunur ve manipüle edilebilir. Birçok mitotik mutantlar var ve (örneğin, GFP) floresan fonksiyonel ifade transgenik sinekler etiketli mitotik proteinler edilmiş ve üretildikten sonra. Hedeflenen gen ekspresyonu GAL4/UAS sistemi 2 ile mümkündür. Drosophila erken embriyo (hücre döngüsü süresi, ≈ 10 dk), birden mitoz çok hızlı bir şekilde yürütmektedir . Döngüleri 10-13 sırasında, çekirdeklerin, korteks hemen altında tek tek tabakalı embriyonun yüzeyindeki sitokinez müdahale olmadan hızlı bir şekilde ve eşzamanlı olarak bölmek, çünkü iyi görüntüleme mitoz için uygundur. Bu hızla bölünerek çekirdekleri, muhtemelen, diğer hücrelerin aynı mitotik makine kullanımı, ancak hız için optimize edilmiş, kontrol noktasında genellikle yokluğu güçlü bir kontrol noktasında hücreler hücre siklusu durmasına neden olur mitotik proteinlerin çalışma izin sıkı olmamalıdır inanılmaktadır . Veya GFP etiketli proteinlerin ifade Embriyolar floresan ile işaretlenmiş proteinler microinjected canlı dinamikleri takip etmek (Şekil 1) kolayca görüntülü olabilir. Buna ek olarak, embriyoların 3, işlev kaybı veya pertürbasyon etkisini araştırmak için spesifik proteinlerin fonksiyonu bloke edici antikorlar veya inhibitörleri ile microinjected olabilir. Bu reaktifler inhibitör konsantrasyonunun bir degrade, mutant alel serisi ile karşılaştırılabilir kusurları bir degrade dönüş sonuçlar üretmek için birçok iğ ulaşan embriyo boyunca diffüz İdeal olarak, hedef proteinin floresan etiketli ise inhibisyon degrade 4 direkt görüntülenebilmekte olabilir. Resmen antikorlar uygulanması gereken nadir durumlarda, bu kadar sıkı kontrol ve ihtiyatlı yorumu baskın etkileri olabileceği olasılığını dışlamak için zor olsa da, güçlü fenotip boş fenotip karşılaştırılabilir olduğu varsayılır. Enjeksiyon yerinden daha uzak, protein fonksiyonu sadece kısmen hedef proteinin diğer işlevler belirgin hale izin kaybetti.

Bu protokol, mikroenjeksiyon ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanımı açıklanır<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sinsityal embriyo mitoz çalışma.

Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

Bu protokol, mitoz çalışmalarında *Drosophila melanogaster* sinsityal embriyosunun kullanımını açıklamaktadır. *Drosophila*, dizilenmiş bir...

Bu prosedür, embriyoların taze üzüm suyu plaklarında 30 ila 60 dakika boyunca toplanmasıyla başlar. Plaka göl kafesinden çıkarıldıktan sonra, embriyolar nemlendirilmiş bir fırça ile alınır ve çift taraflı yapışkan bant üzerine yerleştirilir. Korion kırılana kadar, bir cımbızın tek ucu kullanılarak bir embriyo bant üzerinde nazikçe yuvarlanır.Embriyoyu alın ve nazikçe kapağın üzerine yerleştirin. Üzerine bir kat sıcak silikon yapıştırıcı sürün. Yeterli sayıda embriyo elde edene kadar bu işlemi tekrarlayın.Dehidrasyon sonrası embriyolar enjeksiyona hazırdır. Merhaba, ben California Üniversitesi Davis'teki Moleküler ve Hücresel Biyoloji Bölümü'nden Dr. Jonathan Sculley'nin laboratuvarından Ingrid Bruce Musher. Bugün size Drosophila sinsityal embriyolarına mikroenjeksiyon yapma prosedürünü göstereceğiz.Bu prosedürü, mitozda mikro tübüllerin ve mitral tabanlı motorların rolünü incelemek için kullanıyoruz. Örneğin, spesifik mitotik proteinlerin antikorlarını veya diğer inhibitörlerini mikroenjeksiyon yoluyla aktarıyoruz. İnhibitörün mitoz üzerindeki etkisini analiz ederek, hedef proteinin işlevini belirleyebiliyoruz.Hadi başlayalım. Hazırlıklara deneyden iki ila üç gün önce başlamak için, plastik bir şişenin karşıt kenarlarına yaklaşık bir santimetrekare boyutunda iki küçük delik açarak yumurtlama kafesini hazırlayın. Hava akışına izin verecek şekilde delikleri bir parça pamukla doldurun.Sinekleri şişeye tıklatarak aktarın ve ardından şişeyi bir üzüm suyu plağı ile kapatın. Maya ile birlikte, bacak kafesini oda sıcaklığında tutun; sinekler deneyden en az bir gün önce başlayarak 10 güne kadar yumurta bırakacaktır. Enjeksiyon için iğneleri hazırlayın ve bunları dört derece santigrat sıcaklıkta tutun.Deney günü, iğneleri hazırlayın ve yükleyin. İlk olarak, etiketlenmiş tubulini dondurucudan çıkarın ve beş ila 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Ardından, GPEM tamponu ile seyreltin ve daha sonra 4 °C'de 13.000 RPM'de 10 ila 15 dakika boyunca santrifüjleyin.Son olarak, iğneye bir ila iki µL yükleyin ve dört °C'de saklayın. Bu işlem, iğne içerisinde sıcaklık kaynaklı polimerizasyonu önlemek içindir. Lamel kurulumundan önce, çift taraflı yapışkan bandı sarıp 100 mL'lik bir şişeye yerleştirerek heptan tutkalı hazırlayın.Yaklaşık 50 mililitre heptan ekleyin, şişeyi kapatın ve birkaç gün boyunca sallayarak karıştırın. Embriyoları hazırlamadan önce, enjeksiyondan önce embriyoların yerleştirileceği birdehidratasyon odası hazırlayın. Bunun için, 100 milimetrelik bir Petri kabının içine, masa oluşturacak şekilde 35 milimetrelik bir kabın bir kısmını yerleştirin; ardından kurutucu bölgenin yüksekliği masa ve kapaktan daha yüksek olmayacak şekilde çevresine susuz kalsiyum sülfat ekleyin ve üzerini kapatın.Embriyoların hazırlığına başlamak için, önce, her saatte bir maya içeren üzüm suyu plağını değiştirerek onları göl kafesinden toplayın; embriyolar, toplama işlemine başladıktan yaklaşık iki saat sonra görüntülenmelidir. Lamelini hazırlamak için, lameli mikroskop lamının bir tarafına yerleştirin ve hareket etmemesi için dört köşesini bantla sabitleyin. Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak, lamel üzerine bir hat şeklinde tek katman heptan tutkalı sürün.Yapıştırıcı viskoz olmamalı ve birkaç saniye içinde kurumalıdır. Eğer çok kıvamlıysa, daha fazla heptan ekleyin. Son olarak, lamın üzerine, örtü camının yanına bir parça çift taraflı yapışkan bant yerleştirin.Nemlendirilmiş bir fırça ile kaydırın. Embriyoları üzüm suyu plakası üzerinden dikkatlice alın ve lam üzerindeki çift taraflı yapışkan bandın üzerine yerleştirin. Ardından, korion yırtılana kadar embriyoları çift taraflı yapışkan bant üzerinde yuvarlamak için bir cımbız ucunu kullanın.Embriyoyu, cımbıza yapışması için Corian üzerinde nazikçe yuvarlayarak alın ve lam üzerindeki heptan tutkalının üzerine yerleştirin. Embriyonun uzun kenarı, lamın uzun kenarına paralel olacak şekilde kaydırın. Bir sıraya 10 ila 20 embriyo yerleştirin.Lamelliği kaldırın ve üç ila sekiz dakika boyunca kurutma haznesine yerleştirin. Süre, yerel nem oranına ve enjekte edilecek miktara bağlıdır. Ardından, lamelliği vakum gresi sürülmüş metal bir hazneye yerleştirin.Son olarak, daha fazla dehidrasyonu önlemek için embriyoların üzerini halokarbon yağı ile kapatın. Embriyolar artık enjeksiyona hazırdır. İlk olarak, embriyoları 16 x objektif altında bulun.Embriyoları kenara çekin ve odak düzlemini değiştirmeden iğneyi bulun. İğneyi merkezleyin ve X veya Y yönünde hareket ettirmeden yukarı taşıyın. İğneyi açmak için, lamine camın kenarını, iğnenin bulunacağı yerin dışına gelecek şekilde görüş alanına getirin.Ve iğneyi aynı odak düzlemine indirin. Lam örtü camını, iğneye çarpıp onu nazikçe kırana kadar çok dikkatli bir şekilde hareket ettirin. İğneyi yukarı kaldırın.Şimdi embriyoları görüş alanına getirin. İğneyi yağın içine indirin ve iğneden düzgün sıvı damlacıkları geldiğinden emin olun. Embriyoyu yavaşça iğneye doğru hareket ettirin, embriyoya bir damla enjekte edin ve ardından embriyoyu uzaklaştırın.Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, 60 veya 100 x objektife sahip bir konfokal mikroskopta gözleme hazır hale gelirler. Kontrol embriyosu, bu filmdeki gibi görünmelidir. Bu, dönen disk konfokal mikroskobunda 100 x objektif ile görüntülenen, GFP tubulin ve RFP histon eksprese eden bir embriyodur.Gösterilen toplam süre sekiz dakikadır. Kutuptan kutuba mesafe grafikleri oldukça tekrarlanabilirdir ve kontrol embriyolarında başarının güvenilir bir ölçütüdür. Bu grafikler, burada 11 ile 13. döngüler için gösterilenlere benzemelidir.Bu videoda başka bir kontrol embriyosu gösterilmektedir. Bu embriyo KLP 61 FGFP eksprese etmekte ve r Domine tubulin ile enjekte edilmiştir. Bu örnek de spinning disc konfokal mikroskopta 100 x objektif ile görüntülenmiş olup toplam süre yedi dakikadır.Bu video, mikroenjeksiyondan hemen sonra kaydedilmiştir ve r Domine tubulin konsantrasyonundaki gradyan videonun başında açıkça görülmektedir. Bu embriyolar, Klp 61 F antikoru mikroenjeksiyonu sonrası Klp 61 F inhibisyonunu incelemek için kullanılabilir. Klp 61 FGFP'nin iğciklerden kaybolduğunu görebiliyoruz.Drosophila insizyonel embriyolarının nasıl mikroenjekte edildiğini az önce gösterdik. Bu prosedürü uygularken, kontrol deneylerini gerçekleştirmenin, öncelikle tek başına tampon çözelti veya rutin enjekte etme pratiği yapmanın ve mitozun hücresel aşama boyunca normal şekilde ilerlediğinden emin olmanın önemli olduğunu unutmayın. Tüm enjeksiyonlarınız güvenilir hale geldiğinde ve herhangi bir hasara yol açmadığında, bir inhibitör enjekte edebilir ve söz konusu inhibisyonun etkisini inceleyebilirsiniz.Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

microinjection-techniques-for-studying-mitosis-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

SAC kardeş kromatidler arasında mitotik segregasyon izlenmesi, sinyali başlatır nerede kinetochore olduğunu. A metodunda kromozom hareketi ile kinetochore proteinler ve koordinasyon birinin seçilmesi ve devir görselleştirme tarif...

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

Büyük boyutları ve nispeten basit organizasyonları nedeniyle, Drosophila hemşire hücreleri canlı hücre görüntüleme çalışmaları için idealdir. Bu video, hücrelere eksojen bileşiklerin verilmesi için bir mikroenjeksiyon yöntemini açıklar ve öne çıkan protokol, endojen mRNA transkriptlerini görselleştirmek için kullanılan moleküler işaretler (MB'ler) adı verilen floresan oligonükleotid probları ile prosedürü gösterir.

Drosophila Hemşire Hücrelerinin Mikroenjeksiyonu: Bir Hücre İçi Dağıtım Yöntemi

Bu videoda, canlı Drosophila embriyolarına reaktifler veren mikroenjeksiyonların nasıl gerçekleştirileceği açıklanmaktadır. Araştırmacılar bu yöntemi, embriyo gelişiminin erken aşamalarında nükleik asitler ve proteinler gibi eksojen bileşikleri tanıtmak için kullanabilirler. Öne çıkan protokol, herhangi bir çözünür reaktifin enjeksiyonu için prosedürün nasıl kurulacağını ve gerçekleştirileceğini gösterir - burada, canlı görüntüleme deneyleri için bir floresan protein.

Canlı Drosophila Embriyolarının Mikroenjeksiyonu: Reaktiflerin Gelişmekte Olan Embriyoya Erken Verilmesi

Biz, merkezi sinir sistemi içinde tek nöron etiketlenmesine yönelik bir yöntem (CNS)...

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Burada, moleküler işaretleri kullanarak canlı Drosophila melanogaster yumurta odasında endojen mRNA kaçakçılığı görselleştirme, algılama, analiz ve izleme için bir protokol sunuyoruz, iplik disk konfokka mikroskopi, ve açık kaynak Analizi Yazılım.

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Bu protokolün amacı, Rhodamine konjuge globüler aksini Drosophila embriyolarına enjekte etmek ve ısı stresini takiben intranükleer aksin çubuk tertibatını görmektir.

Canlı Isı Stresli Drosophila Embriyolarında İntranükleer Akin Çubuklarının Görüntülenmesi

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Bu makale, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak almakta ve transgenik sinekler oluşturmak için çok önemli bir adım olan embriyo mikroenjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır.

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Bu protokoller, kontrol ve mutant Drosophila embriyonik epitelisindeki pileli septat bağlantılarının organizasyonu ve kapatma fonksiyonunun nasıl karakterize edileceğini açıklar.

Drosophila embriyonik epitelinde çekirdek pileli septat bağlantı proteinlerini tanımlamak için immünboyama ve boya penetrasyonu deneyleri

Öğrenin Drosophila melanogaster sinsityal embriyolarında mikroenjeksiyon ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleriyle mitoz dinamiklerini incelemeyi. Bu yöntem hücre bölünmesi ve gelişim biyolojisi araştırmaları için güvenilir bir protokol sunar.

Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

Daha fazla video keşfet