Tüm Kalp Görüntüleme Floresan Optik Projeksiyon Tomografi tarihi Normalizasyon

Normalize edilmiş born optik projeksiyon tomografisi gerçekleştirmek için, örnek önce fikse edilir ve bir agar silindirine gömülür. Ardından örnek dikey bir eksen boyunca döndürülür ve bir eksitasyon dalga boyu ile homojen şekilde aydınlatılır; transmisyon ise C, CD uygun optiklerle ölçülür. Belirli dalga boyundaki floresan sinyali, transillüminasyon modunda ölçülür.

Elde edilen floresan ve absorbsiyon görüntüleri, normalize edilmiş born oranını belirlemek ve örnek içindeki floroforların dağılımını yeniden oluşturmak için kullanılır. Merhaba, benim adım Claudia Naone; Mass General Hospital, Harvard Tıp Fakültesi Sistem Biyolojisi Merkezleri'nde çalışıyorum. Ben de Münih Teknik Üniversitesi Biyolojik ve Tıbbi Görüntüleme Enstitüsü ve AI Center Munich'den Danielle Raki.

Ben Giselle Fido. C-M-I-C-S-B, Massachusetts General Hospital, Harvard Med School'da Deneysel su Co direktörüyüm. Bugün sizlere, optik projeksiyon tomografisi için Born normalize edilmiş yaklaşım kullanılarak gerçek zamanlı ex vivo tüm organ görüntüleme prosedürünü göstereceğiz.

Laboratuvarımızda, içi boş organlardaki floresan moleküler prob dağılımını incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu video, hazırlanan dokuların veya organların görüntülenmesi için optik projeksiyon tomografisi kullanma prosedürünü ve beraberindeki videoyu açıklayacaktır.

Gelişmekte olan drosophila üzerinde zaman ayarlı görüntüleme yapmak için bu sistemin nasıl kullanılacağını açıklıyoruz. Optik projeksiyon tomografisinin üç boyutlu görüntüleme tekniği, optik ve dönen bir sahnenin benzersiz bir kombinasyonunu gerektirir. Videonun bu bölümünde, görüntüleme prosedürü açıklanacaktır.

Başlangıçta, ana ışık kaynağı hem aydınlatma hem de absorpsiyon ölçümleri için bir kaynak görevi görür ve floresans ölçümleri için floresan eksitasyon sağlamak amacıyla, ana ışık kaynağı önce dar bant geçiren bir girişim filtresiyle filtrelenir. Ardından ışık, bir dizi sabit ve değişken nötral yoğunluk filtresinden geçer. Bunlar, numune üzerindeki ışık miktarını kontrol etmek ve herhangi bir fotobeyazlamayı önlemek için ışığı yeterince düşük tutmak amacıyla otomatik birten (shutter) ile birlikte kullanılır.

Düzgün numune aydınlatması, bir demet genişletici ve difüzör mercek ile birleştirilmiş bir glan teleskop merceği kullanılarak sağlanır. Son olarak, eksitasyon kaynağı ışığını optik olarak temizlemek için optik dar bant geçiren girişim filtreleri kullanılır. Numune, bir berraklaştırma çözeltisine daldırılır ve görüntüleme için bir cam tüp içinde sabitlenir.

Numune, 0,05 derece mutlak hassasiyete sahip yüksek hızlı bir rotasyon tablası aracılığıyla dikey ekseni boyunca döndürülür. Üç farklı manuel kontrolör, numunenin dikey ekseninin dik düzlemde eğilmesine ve ayarlanmasına olanak tanır. Absorbans sinyali trans-ilüminasyon ile elde edilir ve bir CCD kamera tarafından doğrudan tespit edilir.

Floresan sinyal, uzun geçiren bir filtre ile birleştirilmiş dar bant geçiren bir girişim filtresindenle süzülür ve ardından teleksentrik bir lens ile toplanır. Tele lensler, onları optik projeksiyon tomografisi için ideal kılan benzersiz özellikler sunma avantajına sahiptir.

Mercek düzeneği içerisinde, merceğin odak noktasında yer alan bir diyafram açıklığının mevcudiyeti kilit öneme sahiptir. Bu, görüntünün optik eksene paralel olarak iletileceğini sağlar. Böylece perspektif distorsiyonu ortadan kalkar ve teleksentrik derinlik içindeki birçok odak düzleminde eşit büyütme sağlanır.

Bir sonraki video bölümü, örnek hazırlama tekniğini açıklamaktadır. Bunu, görüntüleme için kullanılan metodoloji takip edecektir. Tomografik görüntüleme için örnek doku veya organ hazırlığı, asimetrik büzülmeyi önleyen, etanol tabanlı bir örnekle su giderme işlemine dayanır.

Bu işlemin tamamlanması birçok gün sürer. Bu videoda bir fare kalbi hazırlanmaktadır, ancak protokol herhangi bir doku veya organa uygulanabilir. Floresan görüntüleme yöntemimizi, kontrollü enfarktüs geçirmiş bir hayvanın kalbini kullanarak göstereceğiz.

Başka bir ifadeyle, önceden belirgin doku nekrozuna yol açan bir kan akımı kaybı. Fareye, iyileşmekte olan miyokarddaki katepsin aktivitesini bildiren pro since six 80 inakt floresan sensör enjekte edilmiştir. Ketamin ve ksilazinın intraperitonal enjeksiyonu ile fareyi perfüzyon ve kalp çıkarma işlemleri için anesteziye alın. Ardından, koagülasyonu önlemek için intraperitonal olarak 50 unit heparin enjekte edin.

Beş dakika sonra, kanı boşaltmak için tam olarak anestezi almış hayvana longitudinal laparotomi uygulayın. İlk olarak sol renal veni açın. Şimdi inferior vena cava içine yavaşça 20 milliliters salin solüsyonu enjekte edin.

Diseksiyon mikroskobu altında tüm kan temizlendikten sonra, salin kanın yerini alır. Toraksı açmak ve kalbi çıkarmak için standart çalışma yöntemlerini uygulamaya devam edin. Ardından, kalbi dört derece santigrat sıcaklıkta %4 PFA içerisinde sekiz saat boyunca sabitleyin.

Bu noktadan itibaren, dokuya uygulanan floresan kontrast ajanlarının veya proteinlerin solmasını önlemek için doku hazırlama adımları karanlıkta gerçekleştirilmelidir. Fiksasyon tamamlandığında, PFA PBS ile 15 dakikalık bir durulama ile yıkanır; temizlenen kalp daha sonra %0,8'lik aros havuzuna gömülür. Aros kuruduktan sonra, blok şekli oluşturmak için dokunun etrafındaki agaroz kesilerek uzaklaştırılır.

Ardından, şifrelenmiş aros kalbi; önce %20 Ethanol içinde bekletme, ardından kademeli olarak artan etanol konsantrasyonları ve son olarak saf etanol olmak üzere beş adımlı bir seri ile dehidre edin. Bu dehidrasyon prosedürü, örneğin asimetrik bir şekilde büzülmesini önlemeye yardımcı olur. Seyreltilmiş etanoldeki ilk dört banyo işlemi bir saat boyunca gerçekleştirilmeli ve %100 Ethanol içindeki son banyo işlemi en az 10 saat boyunca uygulanmalıdır.

Etanol işlemleri tamamlandıktan sonra, örneği örnek berraklaşana kadar Murray berraklaştırma çözeltisine yerleştirin; bu süre birkaç saatten birkaç güne kadar değişiklik gösterebilir. Bu berraklaştırma çözeltisi hücresel suyu taklit eder ve hücre membranlarıyla indeks eşleşmesi sağlar, böylece dokuyu şeffaf hale getirir. Berraklaştırma işleminin sonunda eser miktarda etanol bulunabilir; bu durum, berraklaştırma çözeltisinin içindeki alkolün termal hareketi nedeniyle rekonstrüksiyonlarda çeşitli artefaktların oluşmasına yol açar.

Bu sorunu önlemek için ikinci bir berraklaştırma döngüsü önerilir. Bu işlem dört saatten fazla sürmemelidir. Tamamlandığında, numune optik projeksiyona hazır hale gelir.

Bilgisayar yardımıyla tomografi. Işık saçılmasının olmadığı durumlarda optik absorbsiyonun yeniden yapılandırılması, yaygın bir filtrelenmiş radon geri projeksiyon algoritması kullanılarak elde edilebilir. Bu işlem, iki boyutlu X-ışını bilgisayarlı tomografisine benzerdir.

Aeros bloklarını, berraklaştırma çözeltisi ile doldurulmuş şeffaf görüntüleme haznesine yerleştirin. Ardından hazneyi sahneye monte edin ve hem eksitasyon hem de transmisyon ölçümleri için örneği kolime edilmiş bir ışınla aydınlatın. Eksitasyon kaynağı seçimi, seçilen floresan proteine veya moleküler görüntüleme kontrast ajanına göre yapılır.

Numunenin dikey eksenini CCD piksel sütununa paralel olarak hizalamak uygundur. Numuneyi bir derecelik açısal artışlarla 360 projeksiyon boyunca döndürün ve her açıda hem absorbsiyon hem de floresan dalga boylarında trans-aydınlatma ile görüntüler elde edin. Görüntüleme işlemini gerçekleştiren yazılım, sürekli aydınlatmayı önlemek ve numunenin fotobeyazlamasını azaltmak için birincil ışık kaynağındaki panjuru otomatik olarak kontrol eder.

Absorpsiyon verilerinden 3D rekonstrüksiyon oluşturmak için uzun entegrasyon süreleri gerektiğinde obtüratör özellikle önem kazanır. Floresan görüntülerden 3D rekonstrüksiyon yapmak için basitçe filtrelenmiş radon geri projeksiyon algoritmasını kullanın. Bir sonraki video bölümünde açıklanan diğer absorpsiyon katkıları da dikkate alınmalıdır.

Bir absorpsiyon rekonstrüksiyonu için gerekli adımlar tamamlandıktan sonra, floresan rekonstrüksiyonunu tamamlamak için birkaç adım daha vardır. Işık saçılmasının olmadığı bir optik haritanın rekonstrüksiyonu, yaygın bir filtrelenmiş radon geri projeksiyon algoritması kullanılarak elde edilebilir. Bu işlem, iki boyutlu X-ışını bilgisayarlı tomografiye benzer.

Floresans dağılımı yeniden oluşturulurken, uzaysal olarak değişken olan absorpsiyon, floresans görüntülerinin geri projeksiyonu için ters Radon dönüşümünün kullanılmasını hatalı hale getirerek, elde edilen floresan protein veya floresan moleküler prob dağılımlarını ve bunların kantifikasyon yeteneğini ciddi şekilde etkiler. Arbitrer bir kaynak konumundan Xs yayılan uyarım dalgaboyu Lambda X'teki her bir ışın, görüntülenen nesnenin içinden geçerken üstel olarak zayıflar.

X konumundaki florokrom uyarıldıktan sonra, emisyon dalga boyundaki radyasyon filtrelenir ve Teleric görüntüleme mercek sistemi kullanılarak XD konumundaki CCD pikselleri tarafından toplanır. Yayılan floresans, uyarım ışınıyla aynı yolu izlemese de, her pikselde kaydedilen yoğunluk, söz konusu uyarım ışınına karşılık gelen tüm odak bölgesi boyunca uyarılan tüm florokromların bir projeksiyonuna yaklaşır. Sistemin yüksek tele-sentrikliği sayesinde, görüntülenen nesne daha sonra 360 derece döndürülür ve CCD kamera ile uyarım dalga boyunda UX ve emisyon dalga boyunda UFL olmak üzere birden fazla kaynak detektör ölçümü elde edilir.

Bunlar daha sonra, ikisinin oranı olarak tanımlanan normalize edilmiş kaynak alanı UB altında birleştirilir. Florokrom dağılımının yeniden yapılandırılması, hem uyarılma hem de emisyon ışık yayılımı için ileri model yazılarak kolaylaştırılabilir; burada uyarılmayı tanımlayan Green fonksiyonu kullanılır. Işın yayılımı, moo A'nın daha önce belirlenmiş olan optik absorpsiyon dağılımı olduğu basit bir Beer-Lambert yasasını takip eder.

Kaynak konumundaki Xs'den yayılan ve C.C, D üzerindeki XD konumundaki dedektör tarafından ölçülen ışık şiddeti UX, sistem bağımlı bir B sabiti ile Green fonksiyonunun çarpımı olarak yazılabilir. Ardından, uyarım ışığı şiddetinin GX her bir ışın yolu boyunca kesin dağılımı hesaplanabilir. Kaynak Xs'den yayılan ışık tarafından stimüle edilen ve XD dedektöründe saptanan floresans şiddeti UFL, X'ten xd'ye kadar olan ışın yolu boyunca uyarılmış tüm floroforların katkısını dikkate alır.

Görüntüleme problemimizin ileri modeli, alfa'nın sisteme bağlı bilinmeyen sabitları içerdiği ub ub şeklinde yazılabilir. İleri model daha sonra varsayılan ağ üzerinde ayrıklaştırılır ve florokrom dağılımını çıkarmak, hem transmisyon hem de floresan sinyalini elde etmek ve örneği yeniden oluşturmak için geleneksel geri projeksiyon algoritmasını kullanmak amacıyla bir evirme işlemi gerçekleştirilir. Burada, transmisyon ve geleneksel floresan optik projeksiyon tomografi rekonstrüksiyonları gösterilmektedir.

Kalbin tek bir düzleminin yeniden yapılandırması hem absorbsiyon hem de floresans olarak gösterilmiştir. Normalize edilmiş Born yeniden yapılandırması sunulmuştur ve bu, kalp içindeki boya dağılımındaki farkı göstermektedir. Normalizasyondan sonra, optik projeksiyon tomografisi için düzeneğin nasıl kurulacağını ve floresans tomografisi yeniden yapılandırmalarında optik absorbsiyona bağlı artefaktların nasıl giderileceğini göstermiş olduk.

Saçılan ışığın etkisini gidermek için numuneyi şeffaflaştırmayı akılda tutmak aslında çok önemlidir; ancak aynı zamanda, floresan katkısını mümkün olduğunca korumak için şeffaflaştırma sürecini dengelemek de önemlidir. Bu yaklaşım kullanılırken hatırlanması gereken bir diğer önemli husus, floresan görüntülerinin absorpsiyon görüntülerine bölünmesiyle elde edilen kemik normalize oranının hesaplanmasıdır. Hepsi bu kadar.

Görselleştirilmiş deneyimize katıldığınız için teşekkür eder, kendi deneylerinizde başarılar dileriz.