Tüm Kalp Görüntüleme Floresan Optik Projeksiyon Tomografi tarihi Normalizasyon

Normalize doğmuş optik projeksiyon tomografisi yapmak için, numune önce sabitlenir ve bir burgu silindirine gömülür. Numune daha sonra dikey bir eksen boyunca döndürülür ve daha sonra bir uyarma dalga boyu ile düzgün bir şekilde aydınlatılır ve iletim bir C, CD'ye uygun optiklerle ölçülür. Dalga boyundaki floresan sinyal, transillüminasyon modunda ölçülür.

Elde edilen floresan ve absorpsiyon görüntüleri, normalleştirilmiş doğum oranını belirlemek ve numune içindeki floro dörtlülerinin dağılımını yeniden oluşturmak için kullanılır. Merhaba, benim adım Claudia Naone ve Harvard Tıp Okulu, Mass General Hospital'daki Sistem Biyolojisi Merkezlerinde çalışıyorum. Ben Münih Teknik Üniversitesi Biyolojik ve Tıbbi Görüntüleme Enstitüsü'nden ve Münih Al Center'dan Danielle Raki.

Ben Giselle Fido. Burada, C-M-I-C-S-B, Massachusetts General Hospital, Harvard Med School'da Experimental su Co'nun direktörüyüm. Bugün size optik projeksiyon tomografisi için Born normalleştirilmiş yaklaşımını kullanarak gerçek zamanlı ex vivo tüm organ görüntüleme prosedürünü göstereceğiz.

Laboratuvarımızda bu prosedürü içi boş organlarda floresan moleküler prob dağılımını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu video, hazırlanan doku veya organları görüntülemek için optik projeksiyon tomografisi kullanma prosedürünü ve eşlik eden bir videoyu açıklayacaktır.

Gelişmekte olan drosophila'da hızlandırılmış görüntüleme yapmak için bu sistemin nasıl kullanılacağını açıklıyoruz. Optik projeksiyon tomografisinin üç boyutlu görüntüleme tekniği, benzersiz bir optik ve dönen bir aşama kombinasyonu gerektirir. Videonun bu bölümünde görüntüleme prosedürü açıklanacaktır.

Başlangıç olarak, birincil ışık kaynağı hem aydınlatma hem de absorpsiyon ölçümleri için bir kaynak görevi görür ve floresan ölçümleri için floresan uyarımı sağlamak için, birincil ışık kaynağı önce dar bir bant geçiren girişim filtresi ile filtrelenir. Daha sonra, ışık bir dizi sabit ve değişken nötr yoğunluklu filtreden geçer. Bunlar, numune üzerindeki ışık miktarını kontrol etmek ve herhangi bir fotoğraf ağarmasını önlemek için yeterince düşük tutmak için otomatik bir deklanşörün varlığı ile birleştirilir.

Tek tip numune aydınlatması, bir ışın genişletici ve bir difüzör mercekli birleşik bir glan teleskop merceği kullanılarak elde edilir. Son olarak, uyarma kaynak ışığını optik olarak temizlemek için optik dar bant geçiren girişim filtreleri kullanılır. Numune bir temizleme çözeltisine daldırılır ve bir cam tüp içinde görüntüleme için yerinde tutulur.

Numune, 0.05 derecelik mutlak bir doğrulukla yüksek hızlı bir dönüş aşaması vasıtasıyla dikey ekseni boyunca döndürülür. Üç farklı manuel kontrolör, numune dikey ekseninin ortogonal düzleminde eğilmesine ve ayarlanmasına izin verir. Emici sinyal, trans aydınlatmada elde edilir ve doğrudan bir CCD kamera tarafından algılanır.

Floresan sinyali, uzun geçiren bir filtre ile birleştirilmiş dar bir bant geçiren girişim filtresinden süzülür ve daha sonra bir telesentrik lens ile toplanır. Tele lensler, onları ideal kılan benzersiz özellikler sağlama avantajını sunar. Optik projeksiyon tomografisi için.

Lensin odak noktasında, lens aksamının içinde bulunan bir diyafram açıklığı durdurucusunun varlığı çok önemlidir. Görüntünün optik eksene paralel hareket etmesini sağlar. Bu, perspektif bozulmasını ortadan kaldırır ve tele merkezli derinlik içindeki birçok odak düzleminde eşit büyütme sağlar.

Bir sonraki video bölümü, numunelerin hazırlanması için bir tekniği açıklar. Bunu, görüntüleme için kullanılan metodoloji izleyecektir. Tomografik görüntüleme için numune dokusu veya organ hazırlığı, asimetrik büzülmeyi önleyen numunenin etanol bazlı dehidrasyonuna dayanır.

Bu işlemin tamamlanması birkaç gün sürer. Bu videoda bir fare kalbi hazırlanıyor ancak protokol herhangi bir doku ya da organa uygulanabilir. Kontrollü bir enfarktüs geçiren bir hayvanın kalbini kullanarak floresan görüntüleme yöntemimizi göstereceğiz.

Başka bir deyişle, önceden belirgin doku nekrozuna yol açan kan akışı kaybı. Fareye, iyileşmede katepsin aktivitesini bildiren altı adet 80 inact floresan sensöründen bu yana pro enjekte edildi. Miyokard, intraperitoneal ketamin ve ksilazin enjeksiyonu kullanarak perfüzyon ve kalp ekstrüzyonu için fareyi uyuşturun, ardından pıhtılaşmayı önlemek için 50 ünite heparin intraperitoneal enjekte edin.

Beş dakika sonra, kanı çıkarmak için tamamen anestezi uygulanmış hayvan üzerinde uzunlamasına laparotomi yapın. İlk olarak, sol böbrek damarını açın. Şimdi yavaşça 20 mililitre salin solüsyonunu inferior vena kava içine enjekte edin.

Salin, tüm kanı diseksiyon mikroskobu altında temizledikten sonra kanın yerini alır. Göğüs kafesi açmak ve kalbi çıkarmak için standart çalışma yöntemlerini kullanmaya devam edin. Şimdi, kalbi dört santigrat derecede% 4 PFA'da sekiz saat boyunca sabitleyin.

Bu noktadan itibaren, dokuya uygulanan herhangi bir floresan kontrast maddenin veya proteinin ağartılmasını önlemek için doku hazırlama adımlarının karanlıkta yapılması gerekir. Fiksasyon tamamlandığında, PFA'yı PBS'de 15 dakikalık bir durulama ile yıkayın, temizlenmiş kalp daha sonra% 0.8 aros'luk bir havuza gömülür. Aros kuruduktan sonra, agaroz bir blok şekli oluşturmak için dokunun etrafından kesilir.

Daha sonra, aros şifreli kalbi beş aşamalı bir dizi önce %20 Etanol, ardından giderek daha yüksek konsantrasyonlarda etanol ve son olarak saf etanol ile kurutun. Bu dehidrasyon prosedürü, numunenin herhangi bir asimetrik büzülmesini önlemeye yardımcı olur. Seyreltilmiş etanolde ilk dört banyo bir saat ve %100 Etanolde son banyo en az 10 saat yapılmalıdır.

Etanol işlemleri tamamlandıktan sonra, numune temizlenene kadar numuneyi Murray'in berrak çözeltisine koyun, bu birkaç saat ile birkaç gün arasında değişir. Bu temizleme çözeltisi hücresel suyu taklit eder ve indeks hücre zarlarıyla eşleşir, böylece dokuyu şeffaf hale getirir. Temizleme işleminin sonunda minimum miktarda etanol bulunabilir ve bu da alkolün temizleme çözeltisinin kendisi içindeki termal hareketi nedeniyle rekonstrüksiyonlarda birkaç artefakta yol açar.

Bu sorunu önlemek için ikinci bir temizleme döngüsü önerilir. Bu dört saatten fazla sürmemelidir. Tamamlandığında, numune optik projeksiyon için hazırdır.

Bilgisayar yardımı ile tomografi. Işık saçılımı olmadığında optik absorpsiyonun yeniden yapılandırılması, ortak bir filtrelenmiş radon geri projeksiyon algoritması kullanılarak elde edilebilir. Bu işlem iki boyutlu x-ışını bilgisayarlı tomografiye benzer.

Aeros bloğunu, temizleme solüsyonu ile doldurulmuş şeffaf görüntüleme odasına yerleştirin. Şimdi hazneyi sahneye monte edin, numuneyi hem uyarma hem de iletim ölçümleri için harmanlanmış bir ışınla aydınlatın. Uyarma kaynağı seçimi, seçilen floresan proteinine veya moleküler görüntüleme kontrast maddesine dayanır.

Numunenin dikey eksenini CCD'nin piksel sütununa paralel olarak hizalamak uygundur. Bir derecelik açısal artışlar kullanarak numuneyi 360 projeksiyon üzerinde döndürün, hem absorpsiyon hem de floresan dalga boylarında trans aydınlatmada her açıda görüntüler elde edin. Alımı çalıştıran yazılım, sürekli aydınlatmayı önlemek ve örnek fotoğraf ağarmasını azaltmak için birincil ışık kaynağındaki deklanşörü otomatik olarak kontrol eder.

Deklanşör, absorpsiyon verilerinden bir 3D rekonstrüksiyon oluşturmak için uzun entegrasyon süreleri gerektiğinde özellikle önemlidir. Floresan görüntülerden 3D rekonstrüksiyon için filtrelenmiş bir radon geri projeksiyon algoritması kullanın. Bir sonraki video segmentinde açıklanan diğer emilim katkıları dikkate alınmalıdır.

Bir absorpsiyon rekonstrüksiyonu için gerekli adımları tamamladıktan sonra, bir floresan rekonstrüksiyonunu tamamlamak için birkaç adım daha vardır. Işık saçılımı olmadığında bir optik haritanın yeniden yapılandırılması, ortak bir filtrelenmiş radon geri projeksiyon algoritması kullanılarak elde edilebilir. İşlem, iki boyutlu x-ışını bilgisayarlı tomografiye benzer.

Floresan dağılımını yeniden yapılandırırken. Değişen mekansal olarak bağımlı absorpsiyon, ters radonun sırt için kullanımını yanlış hale getirir ve elde edilen floresan proteini veya floresan moleküler prob dağılımlarını ve niceleme kabiliyetini ciddi şekilde etkileyen floresan görüntülerini yansıtır. Rastgele bir kaynak konumu Xs'ten yayılan Lambda X uyarma dalga boyundaki her ışın, görüntülenen nesneden geçerken üstel olarak zayıflatılır.

Uyarıldıktan sonra, X konumunda bulunan florokrom, emisyon dalga boyundaki radyasyon, Telerik görüntüleme mercekleme sistemi kullanılarak XD konumunda bulunan CCD pikseli tarafından filtrelenir ve toplanır. Yayılan floresan, uyarma ışını ile aynı yolu izlemese de, her pikselde kaydedilen yoğunluk, bu özel uyarma ışınına karşılık gelen tüm odak bölgesi boyunca uyarılan tüm florokromların bir projeksiyonuna yaklaşır. Sistemin yüksek tele merkezliliği nedeniyle, görüntülenen nesne daha sonra 360 derece döndürülür ve CCD kamera ile çoklu kaynak dedektör ölçümleri, uyarma dalga boyunda UX ve emisyon dalga boyunda UFL elde edilir.

Bunlar daha sonra ikisinin oranı olarak tanımlanan normalleştirilmiş doğmuş alan UB altında birleştirilir. Floro krom dağılımının yeniden yapılandırılması, hem uyarma hem de emisyon ışık yayılımı için ileri model yazılarak kolaylaştırılabilir: uyarmayı tanımlayan yeşiller işlevi. Işın yayılımı, moo A'nın daha önce belirlenen optik absorpsiyon dağılımı olduğu basit bir bira Lambert yasasını takip eder.

Kaynaktan aşırı konumda yayılan ve CC, D üzerindeki XD konumundaki dedektör tarafından ölçülen ışık yoğunluğu UX, sisteme bağlı bir B sabiti ile yeşil fonksiyonun ürünü olarak yazılabilir. Uyarma ışık yoğunluğu GX'in her bir ışın yolu boyunca kesin dağılımı daha sonra hesaplanabilir. Xs kaynağından yayılan ışık tarafından uyarılan XD dedektöründe tespit edilen floresan yoğunluğu UFL, X'ten xd'ye ışın yolu boyunca uyarılan tüm therosların katkısını hesaba katar.

Görüntüleme problemimizin ileri modeli daha sonra ub ub olarak yazılabilir, burada alfa sisteme bağlı olan bilinmeyen sabitleri içerir. İleri model daha sonra varsayılan ağ üzerinde ayrıklaştırılır ve florokrom dağılımını çıkarmak, hem iletimi hem de floresan sinyalini elde etmek ve numuneyi yeniden oluşturmak için geleneksel geri projeksiyon algoritmasını kullanmak için bir ters çevirme gerçekleştirilir. Burada, iletim ve konvansiyonel floresan optik projeksiyon tomografi rekonstrüksiyonları gösterilmektedir.

Kalbin tek bir düzleminin rekonstrüksiyonu hem absorpsiyon hem de floresan olarak gösterilmiştir. Normalize edilmiş doğum rekonstrüksiyonu sunulur ve kalp içindeki boya dağılımındaki farkı gösterir. Normalizasyondan sonra, Floresan tomografi için rekonstrüksiyonlarda optik projeksiyon tomografisi için nasıl kurulum yapılacağını ve optik absorpsiyona bağlı artefaktların nasıl çıkarılacağını size gösterdik.

Saçılan ışığın katkısını ortadan kaldırmak için numuneyi temizlemeyi akılda tutmak aslında çok önemlidir, ancak aynı zamanda, floresan katkısını mümkün olduğunca fazla tutmak için temizleme işlemini dengelemek de önemlidir. Bu yaklaşımı kullanırken hatırlanması gereken çok önemli bir diğer şey de, floresan görüntülerin absorpsiyon görüntülerine bölünmesiyle elde edilen kemik normalleştirilmiş oranını hesaplamaktır. İşte bu kadar.

Görselleştirilmiş deneyimize katıldığınız için teşekkür ederiz ve kendi deneylerinizde iyi şanslar.