Name: Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Öğrenin, insan T lenfositlerinin izolasyonu, kültürü ve in vitro göç analizi yöntemlerini. Bu protokol, bağışıklık hücresi davranışlarını ve integrin fonksiyonlarını incelemek için güvenilir bir yöntem sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu proje, Ulusal Sağlık Grants HL087088 (MK) Enstitüleri ve HL18208 (MK) tarafından desteklenmiştir.

1. İnsan T Lenfositler izolasyonu <ol><li> Insan sağlıklı bir donörden kan alın. Kan, bir sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığında (~ 30 dk) soğumasını bekleyin. </li><li> 8 ml yuvarlak alt polistiren tüp yavaşça içine oda sıcaklığında polimorf yoğunluk gradiyenti medya 3 mL pipetle. Polimorf medya üstüne 3 ml tam kan yavaşça ekleyin. Iki reaktifler karışmasını önlemek için önemlidir. </li><li> Tüpler oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 500 xg'de santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj sonrasında, periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) üst hücre katmanı içine diğer kan bileşenleri ayırdığım. Hücre katmanı, ilk bulutlu grup olarak, yukarıdan aşağıya doğru görünür. </li><li> PBMC katmanının üstüne kan açık sarı renkli üst faz, dikkatlice çıkarın ve sonra bir 15 ml veya 50 ml konik tüp PBMC tabaka transfer etmek için P1000 mikropipet kullanın. </li><li> 5 dakika her zaman için 500 xg'de hücreler santrifüj, PBMC PBS ile iki kez yıkayın. Süpernatant her yıkamadan sonra biraz bulutlu olacak. </li></ol> 2. İnsan T Lenfositler Kültür <ol><li> Bir pipet kullanarak,% 10 FBS içeren 20 ml RPMI 1640 medya T-75 kültür şişelerinde PBMC transferi,% 1 penisilin / streptomisin ve 1 mcg / ml fitohemaglütininle (PHA). </li><li> 37 ° ° C'de ve% 5 CO 2 için en az 1 saat ve 24 saate kadar. Bu adım, monositler, süspansiyon kalır lenfositler ayrılmış, balon yüzeye yapışık olacak sağlar. Bu aşamada kısa bir inkübasyon (1 saat) kullanılması durumunda, adım 2.1 'de belirtilen PHA ile ilave% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin içeren RPMI 1640 medya kullanımı için kabul edilebilir. </li><li> Dikkatle şişesi tüm medya kaldırmak 50 ml konik tüp ekleyin ve 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüj. </li><li> Şimdi öncelikle lenfositler içeren hücre pelet, süspanse edin ve% 10 FBS içeren 25 ml RPMI 1640 medya içeren yeni bir T-75 balon hücreleri transferi,% 1 penisilin / streptomisin ve 1 mcg / ml PHA. </li><li> 3 gün (2 gün hücre ilk kuluçka gecede ise) 37 ° C'de inkübe edin. 24 saat sonra büyüme, 15-20 ml taze medya ve daha büyük bir T-175 şişesi transfer için gerekli olabilir. </li><li> 3 gün sonra, 50 ml konik tüp şişesi ve transfer askıya medya ve lenfositler kaldırmak için bir pipet kullanın. 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüjleyin. </li><li> % 10 FBS ile 25 ml (T-75) veya 50 ml RPMI 1640 (T-175) içeren yeni bir T-75 veya T-175 şişesi hücre pelet ve transfer hücreleri tekrar süspansiyon hale getirin,% 1 penisilin / streptomisin ve 20 ng / ml insan IL-2 veya IL-15. </li><li> 4-7 gün lenfositler büyütün. Eğer bir T-75 şişesi ile başlayan, kültür, 1-2 gün sonra genişletilmiş ve bir T-175 balona transfer edilmesi gerekecektir. </li></ol> 3 İn Vitro Lenfosit Göç Testi <ol><li> 1 gün önce göç tahlil, mont, 4, 20 mg / ml Protein PBS içinde A veya G gecede bir cam alt 0.17 mm çanak ° C </li><li> PBS ile yoğun bulaşık yıkayın. </li><li> Insan ICAM-1/Fc (10 mg / ml) ve insan çanak PBS çözüm bu reaktifler ekleyerek ve 4 saat oda sıcaklığında inkübe SDF-1 (2 mcg / ml). Hareketsiz </li><li> T lenfositleri, ilk T-175 şişesi hemasitometre kullanarak kültür hücre yoğunluğu tespit ederek hazırlayın. Yaklaşık 2-5 x 10 5 hücreleri göç analizi için uygun bir hücre yoğunluğu elde etmek için çanak için kullanılmalıdır. </li><li> T lenfositlerin iki kez PBS ile yıkayın ve sonra, 1 mg / mL D-glukoz içeren 1 ml L-15 medya tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Yoğun PBS ile ICAM-1/Fc ve SDF-1 ile kaplı çanak yıkayın. </li><li> 1 ml medya çanak T lenfositleri aktarın ve 37 ° onları korumak ° C </li></ol> 4. NIS Elements Yazılım Kullanarak Bir Resim Sırası yakalama <ol><li> NIS Elements yazılımı açın. </li><li> Kamera ayarları menüsünde, hem de canlı görüntüleme ve görüntü yakalama modu olarak "2x2 binning" seçin. </li><li> Uygulamalar menüsüne gidin ve Çalıştır / tanımlayın Deney seçin. </li><li> Görüntü ve görüntü yakalama sırası toplam uzunluğu arasındaki zaman uzunluğu seçin. </li><li> Görüntü elde başlamak için "Çalıştır" düğmesine basın. </li><li> Hücreler takip edilebilir ve göç parametreleri (hız, yol uzunluğu, yer değiştirme, vb.) ImageJ, AutoQUANT veya Volocity (Şekil 1) de dahil olmak üzere çeşitli yazılım paketleri, birini kullanarak nicel. </li><li> Oluşturmak için "örümcek web arsa, her hücre ve timepoint toplanır (Şekil 2) ve kökeni her hücre için ortak bir başlangıç ​​noktası (Şekil 3) ile bir grafik yansıtılıyor." Xy koordinatları. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar IL-2 veya IL-15, T lenfositleri ya varlığı kültür, 6 günyanı sıra olumlu CD4 ve / veya CD8 boyama pozitif CD3 boyama tarafından belirlenir hücrelerinin&gt;% 98 kadar olun. IL-2 için, biz% 83 CD4 + hücreler,% 15 CD8 + ve &lt;% 1 CD4 + CD8 + hücreler bulundu. IL-15 için,% 88 CD4 + hücreler, CD8 +% 11 ve &lt;% 1 CD4 + CD8 + hücreler bulundu. ICAM-1/SDF-1 yüzeylerde T lenfosit göç sırasında, hücreler, yaklaşık 1 saatlik zaman dilimi içinde sürekli 15 mm / dak bir hız sergiledi. ICAM-1/SDF-1 T lenfosit göç, LFA-1-aracılı adezyon bağımlı olarak bir anti-LFA-1 ligand engelleme antikor göç ciddi engeller. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. T lenfositleri göç Hücre izleme, tam kan izole edilen ve 6 gün boyunca IL-2 veya IL-15 varlığında kültür T lenfositleri 10 mcg / mL ICAM-1 ve kaplamalı cam tabanlı yemekler yapışmaz ve geçiş için izin verildi 2 mcg / ml SDF-1. Görüntüler 30 dakika boyunca her 10 saniyede elde edildi. Hücreler her görüntünün Volocity yazılım kullanarak zaman içinde tespit ve takip edilmiştir. Bu film ~ 15 mm / dak hızda T lenfositlerin rastgele göç gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2017/2017_Kim_Movie1.mov">Videoyu görmek için buraya tıklayın.</a> T lenfositleri göç Film 1. Hücre izleme. T lenfositlerin, tam kan varlığında izole ve kültür IL-2, 6 gün süreyle veya IL-15, 10 mikrogram / ml ICAM-1 ve 2 mcg / ml SDF-1 ile kaplı cam dipli yemekleri üzerine yapışır ve göç etmeye izin verildi . Görüntüler 30 dakika boyunca her 10 saniyede elde edildi. Hücreler her görüntünün Volocity yazılım kullanarak zaman içinde tespit ve takip edilmiştir. Bu film ~ 15 mm / dak hızda T lenfositlerin rastgele göç gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Spatiotemporal hücre konumu. Her bir hücrenin XY koordinatlarını Volocity yazılımı kullanarak her zaman noktası için elde edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 "Örümcek web arsa." XYt kullanarak, her bir hücre, 15 hücre rastgele seçilmiştir ve kökeni ortak bir başlangıç ​​noktası ile çizilen koordine eder. Örümcek web grafikleri karşılaştırarak, farklı deneysel koşullar arasında göç farklılıkları hızlı bir görsel tasviri verir. T lenfosit göçü kontrol koşulları altında (sol panel) ve anti-LFA-1 ligand engelleme antikor (sağ panel) varlığı Arsalar.

<ol><li>Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+integrin+VLA-4+localizes+to+the+lamellipodia+and+mediates+t+cell+migration+on+VCAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1.</a> J Immunol. 183, 359-369 (2009).</li>
<li>Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmuscle+myosin+heavy+chain+IIA+mediates+integrin+LFA-1+de-adhesion+during+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).</li>
<li>Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+integrins+and+their+ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+research%22%5BJournal%5D)">Leukocyte integrins and their ligand interactions.</a> Immunologic research. , (2009).</li>
</ol>

Bu deneyde, birincil insan T lenfosit motilite analiz etmek için basit bir sistem hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. In vitro göç deneyleri, çeşitli hücre tipleri hareketine katılan birçok moleküller ve sinyal yolları rolleri incelemek kullanılmıştır . Bizim protokol kendi deney tasarımı akılda tutulması gereken bazı kritik kontrolleri şunlardır: 1), sığır serum albumini (BSA) veya poli-L lisin (PLL) gibi yapışkanlı olmayan veya non-integrin yapışkan substrat kaplamalar, sırasıyla, 2 ) integrin özel SDF-1 protoko...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH300070.03</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>1-Step Polymorphs</td><td>Accurate Chemical &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan IL-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan IL-15</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-IL</td><td></td></tr><tr><td>Protein G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19459</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan ICAM-1/Fc</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>720-IC</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan SDF-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>350-NS</td><td></td></tr></tbody></table>

göç İnsan t lenfosit İzolasyon, kültür ve analiz in vitro</em

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lenfositlerin göçü, diğer hücrelere veya ekstraselüler matriks proteinleri ile ifade ligandlar hücre yüzeyinde integrinler yapışkan bir etkileşim içerir. Düşük bir yakınlık durumuna hücre öncü afinitesi yüksek bir devlet İntegrinlerin hassas uzaysal aktivasyonu, T lenfosit geçiş için önemli<sup&gt; 1</sup&gt;. Aynı şekilde, hücre firar kenarına çekilmesi, ya da uropod, kalıcı integrin-bağımlı T lenfosit motilite korunmasında gerekli bir adım.<sup&gt; 2</sup&gt;. Lökositlerin aşırı istihdam ve göç inhibe etmek için bir araç olarak otoimmun veya inflamatuar hastalıklar hedef integrinler Birçok terapötik yaklaşımlar<sup&gt; 3</sup&gt;. Insan T lenfosit göçü düzenleyen moleküler olayları incelemek için, biz bir şekilde kullanmış olması<em&gt; In vitro</em&gt; T lenfosit damar alımı sırasında karşılaştığı ortamı taklit eden bir iki boyutlu bir substrat hücre göçü analiz sistemi. T lenfositleri ilk insan donörlerden izole edilir ve yedi ile on gün sonra uyarılmış ve kültür. Tahlil sırasında, T lenfositleri hücrelerarası adezyon molekülü-1 (ICAM-1), LFA-1 integrin için bir ligand ve stromal hücre kaynaklı faktör-1 (SDF-1) ile kaplı bir substrat üzerine yapışır ve göç etmeye izin verilir. Bizim verilerimiz, T lenfositleri ~ 15 mm / dak bir göç hızı sergileyen olduğunu göstermektedir. T lenfosit göç integrin abluka tarafından inhibe olabilir<sup&gt; 1</sup&gt; Veya hücresel actomyosin makine inhibitörleri ile hücre göçü düzenleyen<sup&gt; 2</sup&gt;.

T lenfosit göç homing lenfoid organlar, damar çıkış sırasında oluşur ve periferik dokularda girmeden. Burada, T lenfosit göçü analiz etmek için kullanılan bir protokol tarif<em&gt; In vitro</em&gt;.

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

T lenfositlerin göçü, hücre yüzey integrinlerinin diğer hücrelerde eksprese edilen ligandlarla veya hücre dışı ... ile yapışkan etkileşimini içerir.

T lenfosit göçü; lenfoid organlara yönelim, damar sisteminden çıkış ve periferik dokulara giriş sırasında gerçekleşir. Bu süreç, T hücresi yüzeyinin diğer hücrelerle olan adeziv etkileşimini içerir. Bu fenomeni in vitro ortamda incelemek için insan T lenfositleri izole edilir, kültüre alınır ve adeziv proteinle kaplanmış doku kültürü plaklarına yerleştirilir.ICAM 1 ve kemokin SDF 1. Ardından T lenfosit migrasyonunun görüntüleri elde edilebilir ve analiz edilebilir. Merhaba, ben Craig LeFort; Rochester Üniversitesi Aşı Biyolojisi ve İmmünoloji Merkezi'ndeki Minsu Kim laboratuvarındayım.Bugün size insan T lenfositlerinin izolasyonu ve kültürü ile in vitro göçlerinin analizi için bir prosedür göstereceğiz. Bu analizi, laboratuvarımızda integrinlerin rolünü ve T hücresi göçünü incelemek için kullanıyoruz. T hücresindeki temel integrin, lenfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen bir veya LFA-1'dir.LFA-1 için spesifik ligandlar, ICAM-1 gibi ICAM'lerdir. Ek olarak, T hücresi göçü için hem yönlendirici bir sinyal sağlamak hem de integrinleri aktive etmek amacıyla bir kemokin sinyali gereklidir. Deneyimizde, T hücresi göçü için substrat olarak insan ICAM-1 ve CXCL12 veya SDF-1 kullanıyoruz.Ha

human-t-lymphocyte-isolation-culture-analysis-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Rekabetçi homing deneyler, doğrudan tek bir fare iki farklı hücre popülasyonlarının göçmen özelliklerinin değerlendirilmesi için izin verir. Burada oluşturulan ex vivo gut-tropik karşı-gut olmayan tropik T hücreleri göç karşılaştırarak bu yordamı göstermektedir.

Gut-tropik T Hücre Göç Eğitim Rekabetçi Homing Tahliller

Fare genital lenfosit yalıtmak için verimli bir şekilde tarif edilmiştir. Bu yöntem verimli izolasyonu sağlamak için enzim sindirim ve Percoll degrade ayrılık yararlanır. Bu teknik, diğer tür kullanım için de...

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Bu video, bir kan-beyin bariyeri (BBB) endotel modeli boyunca lenfosit transgöçünün deneysel bir araştırmasını göstermektedir. İnsan beyni mikrovasküler endotel hücrelerinin (HBMEC'ler) tek tabakası in vitro olarak üretilir ve lenfositleri içeren periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) monotabakaya eklenir. Hücreler daha sonra lenfosit transgöçüne izin vermek için inkübe edilir ve göç eden hücreler akış sitometrisi kullanılarak ölçülür.

Mikrovasküler Endotel Hücre Tek Tabakası Boyunca Lenfosit Transgrasyonunun İncelenmesi

Deride yerleşik T hücrelerini insan derisi biyopsilerinden etkili bir şekilde izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, akım sitometrik analizi ve ex vivo kültür için yeterli sayıda canlı insan derisinde yerleşik lenfosit sağlar.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Bu protokolün amacı floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak insan lenfatik malformasyon kiste benzer damarları ve derisini astar lenfatik endotel hücreleri izole etmektir. Daha sonra hücre kültürü ve bu hücrelerin genişlemesi, genetik proteomik, işlevsel ve hücre farklılaşması çalışmaları için deney sofistike yeni bir düzeyde izin verir.

Çoklu-parametre floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma İnsan lenfatik endotel hücreleri İzolasyonu

Lenfositler, adaptif immün yanıtlarda ana oyunculardır. Burada, in vitro ve in vivo lenfosit aktivasyonunda istenen moleküllerin fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bir lenfosit saflaştırma protokolü sunuyoruz. Açıklanan deneysel prosedürler, kontrol ve genetik olarak değiştirilmiş lenfositler arasındaki fonksiyonel kapasiteleri karşılaştırmak için uygundur.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

Burada, lenfositlerin merkezi sinir sistemine in vitro göçünü araştırmayı sağlayan bir insan kan-beyin bariyeri modelini açıklıyoruz.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Bu protokolde lenfositler, alt odadan gözenekli bir zarla ayrılan bir transmigration sisteminin üst odasına yerleştirilir. Keokin alt hazneye eklenir, bu da bir kemokin gradyan boyunca aktif göçe neden olur. 48 saat sonra, lenfositler transmigration quantitate için her iki odada sayılır.

Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi

Bu protokol, kantitatif analiz ile belirli çevresel koşullar altında primer murin T hücresi izolasyonu ve T hücresi göçünün hızlandırılmış mikroskobu için bir yöntem sağlar.

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

Öğrenin, insan T lenfositlerinin izolasyonu, kültürü ve in vitro göç analizi yöntemlerini. Bu protokol, bağışıklık hücresi davranışlarını ve integrin fonksiyonlarını incelemek için güvenilir bir yöntem sunar.

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro

Daha fazla video keşfet