Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro

T lenfosit göçü, lenfoid organlara yönelme, damar sisteminden çıkış ve periferik dokulara giriş sırasında meydana gelir. Bu işlem, T hücresi yüzeyinin diğer hücrelerle yapışkan etkileşimini içerir. Bu fenomeni incelemek için in vitro insan T lenfositleri izole edilir, kültürlenir ve yapışkan protein ile kaplanmış doku kültürü plakalarına yerleştirilir.

ICAM bir ve kemokin SDF bir. T lenfosit göçünün görüntüleri daha sonra elde edilebilir ve analiz edilebilir. Merhaba, ben Craig LeFort ve Rochester Üniversitesi Aşı Biyolojisi ve İmmünoloji Merkezi'ndeki Minsu Kim'in laboratuvarıyım.

Bugün size insan genç lenfositlerinin izolasyonu ve kültürü için bir prosedür, göçlerinin in vitro bir analizini göstereceğiz. Bu testi laboratuvarımızda integrinlerin ve T hücresi göçünün rolünü incelemek için kullanıyoruz. T hücresindeki ana integrin, lenfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen veya LFA olandır.

LFA biri için spesifik ligandlar, ICAM biri gibi icas'tır. Ek olarak, T hücresi göçünün hem yönlülük sinyali sağlaması hem de integrinleri aktive etmesi için bir akraba sinyali gereklidir. Tahlilimizde, T hücresi göçü için substrat olarak insan ICAM one ve CX CL 12 veya SDF one kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Sağlıklı bir donörden insan kanı aldıktan sonra, kanın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Bu yaklaşık 30 dakika sürer.

Kan soğuduktan sonra, üç mililitre oda sıcaklığında, polimorf yoğunluk gradyan ortamını sekiz mililitrelik yuvarlak tabanlı polistiren bir tüpe nazikçe pipetleyin. Sonra yavaşça üstüne üç mililitre tam kan ekleyin. Herhangi bir karıştırmadan kaçınmak önemlidir.

Tüpleri bir santrifüje koyun ve 45 dakika boyunca 500 G döndürün. Santrifüjlemeyi takiben oda sıcaklığında, periferik kan mononükleer hücreleri veya P BMC'ler diğer kan bileşenlerinden ayrılmıştır. PBMC katmanı, üstten ilk bulutlu bant olarak görünür.

Steril koşullar altında, berrak sarı renkli üst fazı dikkatlice çıkarın ve atın. Ardından, PBMC katmanını yeni bir konik tüpe aktarmak için bir P 1000 mikro pipet kullanın. PBMC'yi PBS santrifüj hücreleri ile 500 G'de beş dakika boyunca iki kez yıkayın.

Her seferinde süpernatan biraz bulanık olacaktır Her yıkamadan sonra. Hücreleri% 10 FBS,% 1 penisilin streptomisin ve% 1 mililitre mililitre başına bir mikrogram içeren 20 mililitre RPMI 1640 ortamında yeniden askıya alın. PHA varlığında fito hemaglutinin veya PHA inkübasyonu, T lenfosit aktivasyonunu ve genişlemesini indükler.

Bir pipet kullanarak pbmc'yi bir T 75 kültür şişesine aktarın. Daha sonra bir ila 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübe edildi. Bu adım, şişe yüzeyine yapışacak olan monositlerin, süspansiyonda kalan lenfositlerden ayrılmasını sağlar.

İnkübasyonun ardından, esas olarak lenfosit içeren tüm ortamları dikkatlice çıkarın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Beş dakika boyunca 500 G'de santrifüjleyin. Reese, RPMI 1640'ta hücre peleti olmuştur ve hücreleri, FBS, penisilin, streptomisin ve 37 santigrat derece inkübe edilmiş PHA ile 25 mililitre RPMI 1640 içeren yeni bir T 75 flaz'a aktarmıştır.

24 saatlik büyümeden sonra, 15 ila 20 mililitre taze ortam eklemek ve daha büyük bir T 1 75 şişesine aktarmak gerekebilir. Üç gün veya iki gün kuluçkaya yatırmaya devam edin. PBMC'nin ilk inkübasyonu üç gün sonra gece boyunca yapıldıysa, askıya alınmış lenfositleri içerecek olan ortamı çıkarmak için bir pipet kullanın ve beş dakika boyunca 500 G'de 50 mililitrelik bir konik tüp santrifüjüne aktarın.

Reese, hücre topağı oldu ve hücreleri 25 mililitre RPMI 1640 içeren yeni bir T 75'e aktardı. FBS, penisilin, streptomisin ve insan IL iki veya IL 15 ile hücreleri inkübatöre yerleştirir. Bir T 75 şişesine başlanıyorsa, kültürün genişletilmesi ve bir T 1 75 şişesine aktarılması gerekecektir.

Bir ila iki gün sonra, toplam dört ila yedi gün boyunca lenfositler büyür. Migrasyon tahlilinden bir gün önce, PBS'de mililitre protein A veya G başına 20 mikrogram ile 0.17 milimetrelik bir cam tabanlı tabak kaplayın, ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Bulaşığı PBS ile yoğun bir şekilde yıkayın, ardından tabağa PBS solüsyonunda ICAM one FC ve insan SD F1 ekleyin.

Molekülleri hareketsiz hale getirmek için oda sıcaklığında dört saat inkübe edin. Bir hemo sitometre kullanarak kültürlenmiş hücrelerin yoğunluğunu belirleyin. Daha sonra lenfositleri PBS ile iki kez yıkayın ve inkübasyonu takiben D glikozu içeren bir mililitre L 15 ortamında yeniden süspanse edin, kaplanmış kabı ICAM ile yıkayın, bir FC ve SDF bir tane PBS ile yoğun bir şekilde yıkayın, T lenfositlerini bir mililitre ortamda tabağa aktarın, migrasyon analizi için uygun bir hücre yoğunluğu elde etmek için tabak başına yaklaşık iki ila beş kez 10 ila beşinci hücre kullanılmalıdır.

Hücre göçünün görüntülerini elde etmek için, çanağı 37 santigrat derecede ısıtılmış bir oda gibi sıcaklık kontrollü bir ortamda mikroskop sahnesine yerleştirin. Görüntü ayarları menüsünde NIS elements yazılımını açın. Hem canlı görüntüleme hem de görüntü yakalama modu olarak ikişer ikişer gruplamayı seçin.

Uygulamalar menüsüne gidin ve seçin, tanımlayın, çalıştırın, deneyin. Görüntüler arasındaki süreyi ve toplam süreyi seçin. Görüntü yakalama sırası için, çekimin ardından görüntü alımına başlamak için çalıştır düğmesine basın.

Hız, yol uzunluğu ve yer değiştirme gibi geçiş parametreleri, Image J, Auto Quant veya veloc gibi bir yazılım paketi kullanılarak ölçülebilir. Bir örümcek ağı grafiği oluşturmak için, her hücre ve zaman noktası için XY koordinatlarını toplayın ve bunları başlangıçtaki her hücre için ortak bir başlangıç noktasına sahip bir grafiğe yansıtın. Burada gösterilen T lenfositler kültürlendi, ICAM ve SDF bir'de kaplandı ve 30 dakika boyunca her 10 saniyede bir görüntülendi.

Bu film, her hücre için XYT koordinatlarını kullanarak T lenfositlerinin dakikada yaklaşık 15 mikronluk bir hızla rastgele göçünü göstermektedir. 15 hücre rastgele seçildi ve orijinde ortak bir başlangıç noktası ile çizildi. Örümcek ağı çizimlerinin karşılaştırılması, farklı deneysel koşullar arasındaki göç farklılıklarının hızlı bir görsel tasvirini verir.

Kontrol koşulları altında T lenfosit göçü için grafikler solda gösterilirken, sağda bir anti LFA bir ligand bloke edici antikor varlığında T lenfosit göçü için grafikler gösterilmektedir. Bu veriler, T lenfositlerin bir ICAM bir substrat üzerinde göç etmek için integrin LFA one kullandığını göstermektedir. İşlem sırasında kültürlenmiş insan T lenfositlerini kullanarak bir migrasyon testinin nasıl yapılacağını size gösterdik.

Hücre takibi ve göç analizinin basitleştirilmesi için ICAM bir kaplamalı tabağa uygun sayıda hücre eklemeyi unutmamak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.