Çoklu-parametre floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma İnsan lenfatik endotel hücreleri İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması kullanarak insan lenfatik malformasyonlarının ve sünnet derilerinin lenfatik damarlarını kaplayan yüksek saflıkta lenfatik endotel hücrelerini izole etmektir. Bu, ilk olarak bir hasta doku örneğinin enzimatik olarak sindirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, lenfatik endotel hücrelerinin sayısını zenginleştirmek için tek hücreli süspansiyon kültürlenir.

Örnekte. Hücreler daha sonra ilgilenilen hücre yüzeyi belirteçlerine karşı antikorlarla etiketlenir ve çok parametreli floresan ile aktive edilmiş hücre sıralaması kullanılarak sıralanır. Sonuç olarak, sünnet derisi ve lenfatik malformasyon, lenfatik endotel hücreleri, daha fazla aşağı akış analizi için hücre kültüründe genişletilebilir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırmasının, hücrelerin %99'dan daha büyük saflıkta olmasını sağlaması ve hücreleri kontamine ederek aşırı büyümeye bağlı lenfatik endotel hücrelerinin kaybıyla ilişkili sorunları önlemesidir. Bir antibiyotik antimikotik çözeltisi ile desteklenmiş 10 mililitre ortam içeren 50 mililitrelik bir tüpü tartarak başlayın. Daha sonra lenfatik malformasyonu veya dört deri örneğini tüpe aktarın ve dokunun ağırlığını belirlemek için tüpü tekrar tartın.

Daha sonra, ikinci sınıf bir biyogüvenlik kabininde, doku ve ortamı steril makas kullanarak 100 milimetrelik bir doku kültürü kabına aktarmak için steril forseps kullanın. Son olarak, dokuyu bir milimetreküp parçalar halinde kıyın. Daha sonra parçaları 10 mililitre taze antibiyotik antimikotik içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Orta.

Dokuyu yeniden süspanse etmek için tüpü birkaç kez döndürün ve ardından numuneyi aşağı doğru döndürün. Süpernatanı çıkardıktan sonra, 100 miligram kıyma dokusu başına bir mililitre ön ısıtma sindirim çözeltisi ekleyin ve dokuyu 37 derecelik bir inkübatörde 200 RPM'de sürekli çalkalayarak inkübe edin Lenfatik endotel hücrelerinin başarılı bir şekilde zenginleştirilmesi için. Hücrelerin izolasyondan kurtulabilmeleri için kollajenaz ve dys boşluk reaksiyonuna yeterince maruz kaldıklarını bilmek çok önemlidir.

Bu, doku sindirim sürecinin dikkatli bir şekilde izlenmesi ve dokuların çoğu ince parçalara sindirildiğinde reaksiyonun durdurulmasıyla elde edilir. İnkübasyonun sonunda, dokunun neredeyse tamamının küçük parçalara sindirildiğini doğrulayın ve doku bulamacını 70 mikronluk bir süzgeçten steril 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Şimdi, sadece küçük hücre dışı matris izleri gözlenene kadar kalan dokuyu öğütmek için lastik pistonlu üç mililitrelik bir şırınga pistonu kullanın.

Daha sonra hücre süzgecini, ayrışan enzim ortamının hacmine eşdeğer bir hacimde endotel hücre ortamı ile yıkayın ve hücreleri reus aşağı doğru döndürün. Pelet, numune boyutuna bağlı olarak 20 mililitreye kadar endotel hücre ortamında askıya alın. Daha sonra tohum sayımından sonra, gece boyunca kültür için 20 mililitre endotel hücre ortamının son hacminde fibronektin ile önceden kodlanmış 150 santimetre karelik bir şişede iki kez 10 ila altı hücre

Ertesi sabah, bağlanmamış hücreleri, antibiyotik antimikotik solüsyonu ile takviye edilmiş üç durulama PBS ile yıkayın. Daha sonra lenfatik endotel hücrelerinin sayısını artırmak için, hücrelere taze endotel hücre ortamı ekleyin ve kültür yaklaşık% 80 birleşene kadar kültürü beş ila yedi gün inkübe edin. Çok parametreli floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile hücreleri sıralamak üzere boyamak için.

İlk olarak, hücre ortamını çıkarın, hücreleri PBS'de üç kez yıkayın. Daha sonra, 37 santigrat derecede beş ila yedi dakikalık inkübasyondan sonra yedi mililitre ayırma çözeltisi ekleyin. Ayrışmış hücreleri hasat edin, enzimleri üç hacim endotel hücre ortamı ile inaktive edin ve hücre süspansiyonunu steril bir tüpe aktarın.

Hücreleri üç kez santrifüjleyin, son yıkamadan sonra ikinci ve üçüncü dönüşler için peleti beş mililitre PBS'de yıkayın. Peletleri beş mililitre taze PBS'de yeniden süspanse edin ve trian mavisi dışlama ile canlı hücrelerin sayısını sayın. Hücre sayımını takiben.

Hücreleri aseptik olarak akış sitometrisi boyama tüplerine aktarın ve spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için hücreleri aşağı doğru döndürün. Hücreleri %5 F-B-S-P-B-S'de yeniden süspanse edin ve 20 dakika buz üzerinde inkübe edin. Santrifüjü bloke ettikten sonra, hücreler süpernatanı ve resüsanı çıkarır.

Peletleri CD 34, CD 31 potanin ve VEGF reseptörü üç antikor kokteyli içinde askıya alın. Buz üzerinde 20 dakika geçirdikten sonra, hücreleri, bağlanmamış antikorları çıkarmak ve resüs yapmak için iki mililitre F-B-S-P-B-S'de üç kez yıkayın. Peletleri buz üzerinde F-B-S-P-B-S çözeltisi içinde 300 mikrolitre propidyum iyodür içinde askıya alın.

Son olarak, saflaştırılmış insan lenfatik endotel hücrelerini çok parametreli floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama cihazında sıralayın. Daha sonra sıralanan hücreleri döndürün ve peletleri hücre kültürü tohumlaması için uygun ortamda tekrar askıya alın. Burada, pot deplane'e karşı antikor ile etiketlenmiş normal insan lenfatik ve lenfatik malformasyon damarları, insan lenfatik malformasyon damarları içindeki belirgin genişleme ve önemli lümen boyutu varyasyonuna dikkat

Gerçekten de, çoğu lenfatik malformasyon, fraksiyone edilmemiş örneklerde ilk doku sindirimini ve 24 saatlik kültürü takiben hem küçük veya mikrokistik hem de büyük veya makrokistik anormal kistik yapılar içerir. Fibroblast benzeri hücrelere ve düz kas hücrelerine ek olarak, tasnif işleminden sonra ve hücre kültüründe 24 saat daha farklı endotel hücre kolonileri gözlenebilir. Bununla birlikte, CD 34, düşük CD 31 pozitif VEGF reseptörü üç pozitif podo düzlemi ve kültür kabına bağlı pozitif hücreler ve bu görüntülerde gözlenen tipik parke taşı morfolojisini sergiler.

Bu videoyu izledikten sonra, floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması kullanarak insan lenfatik malformasyonunu ve tam cilt lenfatik damarlarını kaplayan lenfatik endotel hücresinin yüksek saflıkta nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Birincil insan dokusu ile çalışmanın, insan sağlığına zararlı bulaşıcı ajanlar içerebileceğinden tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu işlem yapılırken eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü giymek gibi standart önlemler her zaman alınmalıdır.