Çoklu-parametre floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma İnsan lenfatik endotel hücreleri İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, floresan aktivasyonlu hücre ayıklama kullanarak, insan lenfatik malformasyonlarının ve sünnet derisinin lenfatik damarlarını döşeyen yüksek saflıkta lenfatik endotel hücrelerini izole etmektir. Bu işlem, öncelikle bir hasta doku örneğinin enzimatik olarak sindirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, lenfatik endotel hücrelerinin sayısını artırmak için tek hücre süspansiyonu kültüre edilir.

Örnek içerisinde. Ardından hücreler, ilgilenilen hücre yüzey belirteçlerine özgü antikorlarla işaretlenir ve çok parametreli floresan aktive hücre ayıklama yöntemi kullanılarak ayrıştırılır. Nihayetinde, sünnet derisi ve lenfatik malformasyon kaynaklı lenfatik endotel hücreleri, daha sonraki analizler için hücre kültüründe çoğaltılabilir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, floresanla aktive edilmiş hücre ayıklamanın %99'dan daha yüksek saflıkta hücreler sağlaması ve böylece kontamine hücrelerin aşırı büyümesi nedeniyle lenfatik endotel hücrelerin kaybıyla ilişkili sorunların önlenmesidir. Antibiyotik antimikotik çözelti ile desteklenmiş 10 mililitre besiyeri içeren 50 mililitrelik bir tüpü tartarak başlayın. Ardından lenfatik malformasyonu veya dört deri örneğini tüpe aktarın ve dokunun ağırlığını belirlemek için tüpü tekrar tartın.

Ardından, sınıf iki biyogüvenlik kabininde, steril pensler ve steril makaslar kullanarak dokuyu ve medyumu 100 milimetrelik bir doku kültürü kabına aktarın. Son olarak, dokuyu bir kübik milimetrelik parçalar halinde ince ince kıyın. Daha sonra parçaları, 10 mililitre taze antibiyotik antimikotik içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Dokuyu tekrar süspande etmek için tüpü birkaç kez çalkalayın ve ardından örneği santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, kıyılmış dokunun her 100 miligramı için bir mililitre önceden ısıtılmış sindirim çözeltisi ekleyin ve lenfatik endotel hücrelerinin başarılı bir şekilde zenginleştirilmesi için dokuyu 37 °C'lik bir inkübatörde 200 RPM'de sabit çalkalamayla inkübe edin. Hücrelerin izolasyon sürecinde hayatta kalabilmeleri için kollajenaz ve dispaz reaksiyonuna yeterince maruz kaldıkları anı belirlemek kritik öneme sahiptir.

Bu işlem, doku sindirim sürecinin dikkatle izlenmesi ve dokuların çoğunluğu ince parçalara ayrıldığında reaksiyonun durdurulmasıyla gerçekleştirilir. İnkübasyonun sonunda, dokunun neredeyse tamamının küçük parçalara ayrıldığını doğrulayın ve doku bulamacını 70 mikronluk bir süzgeç aracılığıyla steril bir 50 mililitrelik tüpe filtreleyin. Şimdi, yalnızca ekstraselüler matrisin küçük izleri gözlemlenene kadar kalan dokuyu ezmek için kauçuk pistonlu üç mililitrelik bir şırınga pistonu kullanın.

Ardından hücre süzgecini, dissosiyasyon enzimi ortamının hacmine eşdeğer miktarda endotel hücre ortamı ile yıkayın ve hücreleri tekrar çöktürün. Pellet'i, örnek boyutuna bağlı olarak 20 mililitreye kadar endotel hücre ortamı içinde süspande edin. Ardından sayım yaptıktan sonra, gece boyu kültür için 2 × 10⁶ hücreyi, fibronectin ile önceden kaplanmış 150 cm²'lik bir flask içerisine, 20 mililitre toplam hacimdeki endotel hücre ortamı ile ekleyin.

Ertesi sabah, bağlanmamış hücreleri antibiyotik antimikotik solüsyon takviyeli PBS ile üç kez durulayarak yıkayın. Ardından, lenfatik endotel hücrelerinin sayısını artırmak için hücrelere taze endotel hücresi besiyeri ekleyin ve kültür yaklaşık %80 konfluens düzeyine ulaşana kadar beş ila yedi gün boyunca inkübe edin. Hücreleri, çok parametreli floresanla aktive edilmiş hücre ayıklama ile ayıklamak üzere boyayın.

Öncelikle hücre besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, 37 °C'de beş ila yedi dakikalık inkübasyonun ardından yedi mililitre ayırma solüsyonu ekleyin. Ayrıştırılmış hücreleri toplayın, enzimleri üç hacim endotel hücre besiyeri ile inaktive edin ve hücre süspansiyonunu steril bir tüpe aktarın.

Hücreleri üç kez santrifüjleyin; son yıkamadan sonraki ikinci ve üçüncü çevirmelerde pellet'i beş mililitre PBS ile yıkayın. Pellet'i beş mililitre taze PBS içinde yeniden süspande edin ve canlı hücre sayısını tripan mavisi dışlama yöntemiyle belirleyin. Hücre sayımının ardından.

Hücreleri aseptik olarak akış sitometrisi boyama tüplerine aktarın ve spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için hücreleri çöktürün. Hücreleri %5 F-B-S-P-B-S içerisinde yeniden süspanse edin ve 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bloklama santrifüj işleminden sonra, hücrelerin süpernatantını uzaklaştırın ve yeniden süspanse edin.

Pelleti CD 34, CD 31 potanin ve VEGF reseptörü üç antikor kokteylinde süspande edin. Buz üzerinde 20 dakika beklettikten sonra, bağlanmamış antikorları uzaklaştırmak için hücreleri iki mililitre F-B-S-P-B-S ile üç kez yıkayın ve yeniden süspande edin. Pelleti, buz üzerinde F-B-S-P-B-S çözeltisindeki 300 mikrolitre propidyum iyodürde süspande edin.

Son olarak, saflaştırılmış insan lenfatik endotel hücrelerini çok parametreli bir floresan aktivasyonlu hücre ayıklama cihazında ayıklayın. Ardından, ayıklanan hücreleri santrifüjle çöktürün ve peletleri hücre kültürü ekimi için uygun besiyerinde yeniden süspanse edin. Burada, podoplanin karşıtı antikorla işaretlenmiş normal insan lenfatik damarları ve lenfatik malformasyon damarları gösterilmiştir; insan lenfatik malformasyon damarlarındaki belirgin genişlemeye ve önemli lümen boyutu varyasyonuna dikkat edin.

Nitekim, fraksiyone edilmemiş örneklerde başlangıç doku sindirimini ve 24 saatlik kültür süresini takiben, çoğu lenfatik malformasyon hem küçük veya mikrokistik hem de büyük veya makrokistik anormal kistik yapılar içerir. Ayıklama ve hücre kültüründe ek bir 24 saatten sonra, fibroblast benzeri hücreler ve düz kas hücrelerinin yanı sıra belirgin endotel hücre kolonileri gözlemlenebilir. Bununla birlikte, CD 34 düşük, CD 31 pozitif, VEGF reseptör üç pozitif podoplanin pozitif hücreler kültür kabına tutunur ve bu görüntülerde gözlemlenen tipik parke taşı morfolojisini sergiler.

Bu videoyu izledikten sonra, floresanla aktive edilen hücre ayıklama yöntemi kullanarak insan lenfatik malformasyonunu ve tam deri lenfatik damarlarını döşeyen lenfatik endotel hücrelerinin nasıl yüksek saflıkta izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Primer insan dokusuyla çalışmanın, insan sağlığına zararlı enfeksiyöz ajanlar içerebileceği için tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü giymek gibi standart önlemler her zaman alınmalıdır.