CUBIC Tabanlı Protein Ekspresyonunun Görselleştirilmesi: Tam Kalınlıkta Fare Derisi Biyopsilerinde Protein Ekspresyonunun Görselleştirilmesi İçin Bir Prosedür

- Deri, birden fazla katman halinde düzenlenmiş çeşitli hücre popülasyonlarından oluşan karmaşık bir organdır. Doku temizleme tabanlı üç boyutlu bir görüntüleme tekniği olan CUBIC, tüm cilt biyopsilerini kullanarak bu cilt hücrelerinin içindeki protein ekspresyon modellerini görselleştirmeye yardımcı olur. Ötenazi yapılmış bir fare alarak ve sırt boyun bölgesindeki tüyleri alarak başlayın. Bir parça deri kesin ve küçük parçalar halinde kesin.

Parçaları bir CUBIC1 temizleme çözeltisine batırın ve inkübe edin. Deri hücreleri, ışık saçılımına neden olan kromoforların ve lipitlerin varlığı nedeniyle şeffaf değildir. CUBIC solüsyonundaki kimyasallar bu molekülleri uzaklaştırır, böylece ışık saçılımını azaltır ve dokuyu şeffaf hale getirir.

Daha sonra, dokuyu, cilt hücrelerinde eksprese edilen hedef hücre içi proteinlerine spesifik olarak bağlanan istenen birincil antikorlarla tedavi edin. Ayrıca, protein-primer antikor komplekslerine bağlanan floresan etiketli ikincil antikorlarla tedavi edin. Dokuya, çekirdeği boyayan DNA bağlayıcı bir boya ile karşı boyayın.

Son olarak, numuneyi bir CUBIC2 çözeltisine daldırın. Solüsyon, doku içindeki ışık saçılımını daha da azaltarak onu görüntüleme için daha şeffaf hale getirir. Üç boyutlu numunede floresan etiketli ilgi alanlarını görselleştirmek için konfokal mikroskop altında gözlemleyin. Aşağıdaki protokol, CUBIC protokolü kullanılarak tüm mount deri biyopsilerinde keratinosit proliferasyon belirteçlerinin ekspresyonunun görüntülenmesine izin verir.

- Ötenazi uygulanmış bir farenin boynundan kılları tıraş etmek için düzelticiler kullanarak başlayın ve cildi yaralamamaya dikkat edin. Ardından, cildi PBS'de% 70 etanol ile dekontamine edin. Daha sonra, sırt boynu derisini forseps ile kaldırın ve yaklaşık 1,5 x 4 santimetrelik bir dorsal fare derisi alanını çıkarmak için makas kullanın. Daha sonra, dermis tarafı aşağı bakacak şekilde cildi bir parça filtre kağıdı üzerine düzleştirin, numunenin ön-arka oryantasyonunu not edin ve kağıdı diseke edilen cildin etrafında kesin.

- Optimum görüntüleme için, cilt örneklerinin tutarlı saç folikülü oryantasyonu ile düz kalması gerekir. Numuneleri uygun bir antero-posterior pozisyonda tutmak için, cilt parçalarını dikdörtgen biyopsilerde filtre kağıdına sabitliyoruz.

- Numuneleri PBS'de taze hazırlanmış% 4 PFA ile doldurulmuş 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, filtre kağıdına sıkıca sabitlendiklerinde, numuneleri 5 dakikalık iki yıkama için 15 mililitrelik yeni bir PBS tüpüne aktarın.

İkinci yıkamadan sonra cilt biyopsilerini temizlemek için, dokuları yaklaşık 0,2 x 0,5 santimetrelik parçalar halinde kesmek için keskin bir tıraş bıçağı kullanın ve numunelerin uzun kenarlarının numunelerin ön-arka yönü boyunca kesilmesine dikkat edin.

- Biyopsinin uzun tarafının saç foliküllerinin yönüne paralel olarak kesilmesi de geniş saç folikülü hasarının önlenmesine yardımcı olur.

- Daha sonra, biyopsileri 5 mililitre taze hazırlanmış CUBIC1 temizleme solüsyonuna 15 mililitrelik yeni bir tüpe daldırın ve tüpü 37 santigrat derecede bir hibridizasyon fırınında dönen bir platform üzerine yerleştirin. Doku parçaları şeffaf hale geldikten sonra, biyopsileri 4 mililitre PBS'de 37 santigrat derecede 6 saatlik dört yıkama için yıkayın, ardından PBS'de hacim başına %20 ağırlıkta 4 saatlik 37 santigrat derece yıkama yapın.

İnkübasyonun sonunda, dokuların antikor penetrasyonuna geçirgenliğini artırmak için her bir numuneyi ayrı ayrı 15 mililitrelik tüplerde gece boyunca eksi 80 santigrat derecede optimum kesme sıcaklığı bileşiğinde dondurun.

Ertesi sabah, cilt örneklerini uygun antikorlar ve ilgilenilen hayati boyalarla boyayın. Daha sonra, numuneleri 1 mililitre taze hazırlanmış CUBIC2 temizleme solüsyonunda 2 mililitrelik tüplerde bir çalkalayıcı üzerinde 37 santigrat derece fırında 24 saat boyunca dokuların kırılma indisini eşitleyene kadar inkübe edin.

Dokular temiz olduğunda, biyopsileri, saç folikülü büyüme yönü kapak kayma yüzeyine paralel olacak şekilde, tek tek cam örtü kızaklarının uzun kenarı boyunca konumlandırın. Dokunun üzerine bir damla CUBIC2 solüsyonu damlatın. Bir kapak kızağı üzerine iki adet 1 milimetre x 2 santimetre mavi raptiye şeridi yerleştirin. Ardından, biyopsiyi ikinci bir kapak fişi ile örtün.

Ardından, görüntüleme odasını konfokal bir mikroskop aşamasına yerleştirin ve dokuyu ışık yoluna taşıyın. Uygun ışık kaynağını ve standart epifloresan filtrelerini kullanarak, floresan lekeli ilgili bölgeleri belirlemek için numuneyi tarayın. Ardından, ilgilenilen bölgelerin floresan konfokal görüntülerini elde edin.