KÜBİK Protokol Tüm Dağı Cilt Hazırlıkları Tek Hücre çözünürlükte Protein Anlatım Görseller
August 4th, 2016
Bu rapor tam kalınlıkta fare deri biyopsi açıklık ve 3D tek hücre çözünürlükte protein ekspresyonu, çoğalan hücreleri ve Sebositler görselleştirmek için bir KÜBİK protokol tanımlamaktadır. Bu yöntem cilt anatomi ve patoloji doğru değerlendirilmesini sağlar ve genetiği değiştirilmiş fare hatları anormal epidermal fenotipleri.
Bu prosedürün genel amacı, hücre proliferasyonunu ve protein ekspresyon paternlerini tek hücre düzeyinde üç boyutlu olarak görselleştirmek ve cildin anatomisini ve patolojisini doğru bir şekilde değerlendirmektir. Bu yöntem, hücresel ve moleküler mekanizmaların epidermal gelişimi ve rejenerasyonu nasıl kontrol ettiği ve bu mekanizmaların cilt hastalığı sırasında nasıl bozulduğu hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek tek hücreleri tam kalınlıkta deri biyopsilerinde benzeri görülmemiş bir doğrulukla üç boyutlu olarak görselleştirmek için teknik olarak basit bir protokol olmasıdır.
Yöntem ayrıca tam deri örneklerinde epidermis ve dermis arasındaki etkileşimlerin araştırılmasını da kolaylaştırır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan araştırmacılar, saç foliküllerine zarar vermeden küçük düz deri biyopsilerini hazırlamakta biraz zorlanabilirler. Prosedürü göstermek, UNSW Avustralya'daki Gelişimsel ve Rejeneratif Dermatoloji Birimi'nde doktora öğrencisi olan Betty Maclarios olacak.
Cildi yaralamamaya özen göstererek, ötenazi uygulanmış bir farenin boynundan kılları tıraş etmek için düzelticiler kullanarak başlayın. Daha sonra cildi% 70 etanol ve PBS ile dekontamine edin. Daha sonra sırt boyun derisini forseps ile kaldırın ve yaklaşık 1,5 x 4 cm'lik bir sırt fare derisi alanını çıkarmak için makas kullanın.
Daha sonra cildi dermis tarafı aşağı bakacak şekilde bir filtre kağıdı parçası üzerinde düzleştirin, numunenin ön arka oryantasyonunu not edin ve kağıdı diseke edilen cildin etrafında kesin. Optimum görüntüleme için cilt örneklerinin tutarlı saç folikülü oryantasyonu ile düz kalması gerekir. Numuneleri uygun anterior posterior pozisyonda tutmak için, cilt parçalarını dikdörtgen biyopsiler halinde filtre kağıdına sabitleriz.
Numuneleri taze hazırlanmış %4 PFA ve PBS ile doldurulmuş 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Daha sonra, filtre kağıdına sıkıca sabitlendiklerinde, numuneleri iki beş dakikalık yıkama için 15 mL'lik yeni bir PBS tüpüne aktarın. Deri biyopsilerini temizlemek için, ikinci yıkamadan sonra keskin bir tıraş bıçağı kullanarak dokuları yaklaşık 0,2 x 0,5 cm'lik parçalar halinde kesin, örneklerin uzun kenarlarının örneklerin ön arka yönü boyunca kesilmesine dikkat edin.
Biyopsinin yan tarafının saç foliküllerinin yönüne paralel olarak kesilmesi de geniş saç folikülü hasarının önlenmesine yardımcı olur. Biyopsileri 5 mL taze hazırlanmış kübik bir temizleme solüsyonuna 15 mL'lik yeni bir tüpe daldırırlar ve tüpü 37 santigrat derecede bir hibridizasyon fırınında dönen bir platform üzerine yerleştirirler. Doku parçaları şeffaf hale geldikten sonra, biyopsileri 4 mL PBS'de 37 santigrat derecede dört altı saatlik yıkama yapın, ardından hacim başına% 20 ağırlıkta dört saatlik 37 derece yıkayın, sükroz ve PBS.
İnkübasyonun sonunda, dokuların antikor penetrasyonuna geçirgenliğini artırmak için her bir numuneyi 15 mL'lik tüplerde ayrı ayrı 80 mL'lik tüplerde optimum kesme sıcaklığı bileşiğinde dondurun. Ertesi sabah cilt örneklerini uygun antikorlar ve hayati önem taşıyan boyalarla boyayın. Daha sonra numuneleri, dokuların kırılma indisini eşitlemek için 37 derece fırında 24 saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde 2 mL taze hazırlanmış kübik iki temizleme solüsyonunda 1 mL taze hazırlanmış kübik iki temizleme solüsyonunda inkübe edin.
Dokular temiz olduğunda, biyopsiler, saç folikülünün büyüme yönü kapak kayma yüzeyine paralel olacak şekilde, tek tek cam kapak kaymalarının uzun kenarı boyunca konumlandırın. Dokunun üzerine bir damla kübik iki çözelti koyun. Bir kapak fişi üzerine iki adet 1 mL x 2 cm'lik mavi yapışkan şerit yerleştirin, ardından biyopsiyi ikinci bir kapak fişi ile örtün.
Daha sonra görüntüleme odasını konfokal bir mikroskop aşamasına yerleştirin ve dokuyu ışık yoluna taşıyın. Uygun ışık kaynağını ve standart epifloresan filtrelerini kullanarak, floresan lekeli ilgili bölgeleri belirlemek için numuneyi tarayın ve ardından ilgili bölgelerin floresan konfokal görüntülerini elde edin. Bu yöntem kullanılarak, erişkin yabani tip farelerin her iki kalınlıktaki dorsal deri biyopsileri netleştirilebilir ve bazal keratinosit marker keratin 14'e karşı antikor ile boyanabilir.
Dappy pozitif çekirdekler numune boyunca görülebilir ve dermal papilla gibi bazı anatomik özelliklerin takdir edilmesini sağlar. K14 boyaması, interfoliküler epidermisin bir hücre kalınlığındaki bazal tabakasında belirgindir. Saç foliküllerinin yağ bezlerinin ve dış kök kılıflarının ana hatlarını çizen ve saç foliküllerinin şişkin bölgesinde sadece düşük seviyelerde K14 ekspresyonu tespit edilen ikincil saç mikroplarında.
Çoğalan hücreleri görselleştirmek için, yetişkin vahşi tip farelerin telojeninde tam kalınlıkta dorsal deri biyopsileri gösterildiği gibi berraklaştırılabilir ve boyanabilir, bu da bazal, interfoliküler epidermiste ve isthmus'ta çoğalan keratinositlerin varlığını ortaya çıkarır, ancak saç foliküllerinin şişkin bölgesinde değil. Yağ bezlerini tam kat görüntülemek için, erişkin yabani tip farelerin antijeninde dorsal deri biyopsileri netleştirilebilir ve boyanabilir, bu da kıl foliküllerinin isttak bölgesindeki yağ bezlerinin tespitini kolaylaştırır. Epidermis ve transgenik hayvanlardaki morfolojik değişiklikleri görselleştirmek için, tam kalınlıkta dorsal deri biyopsileri netleştirilebilir ve boyanabilir, bu da interfoliküler epidermisin hiperplazisini ve genişlemiş transgenik kök hücre popülasyonlarını temsil eden dermise proksimal olarak uzanan K14 işaretli hücre kitleleri ile anormal kıl foliküllerini ortaya çıkarabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, deri örneklerinin nasıl hazırlanacağını ve berraklaştırılacağını ve protein ekspresyon paternlerini tek hücre çözünürlüğünde üç boyutlu olarak nasıl görselleştireceğimizi iyi anlamış olmalıyız. Bu yöntemin gerçekleştirilmesi basittir ve nispeten güvenli ve ucuz reaktifler kullanır. Gelecekte, bu yöntemle uyumlulukları için daha fazla antikor test edilecek ve bu analizin daha fazla proteini ve belirli ilgi türlerini görselleştirmek için genişletilmesine izin verilecektir.
Daha büyük deri örneklerinin deri anatomisi ve protein ekspresyon paternlerinin üç boyutlu olarak görüntülenmesi için ışık tabakası mikroskobu gibi diğer görüntüleme yöntemleri de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, dermatoloji alanındaki araştırmacıların cilt homeostazında, genetiği değiştirilmiş fare modellerinde ve cilt hastalığı modellerimizden birinde dermis ve epidermis arasındaki hücresel ve moleküler etkileşimleri keşfetmelerinin önünü açacaktır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu rapor, tam kalınlıklı fare derisi biyopsilerinin görselleştirilmesini sağlayan ve protein ekspresyon paternlerini ve çoğalan hücreleri 3D'de tek hücre çözünürlüğünde görselleştirmeyi mümkün kılan bir CUBIC protokolünü tanımlar. Bu yöntem, özellikle genetik olarak modifiye edilmiş fare hatlarında deri anatomisi ve patolojisinin doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Dermatoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Epidermal gelişimdeki hücresel ve moleküler mekanizmaların anlaşılması.
- Deri hastalığı ve yenilenme süreçlerinin araştırılması.
- Doğru deri biyopsisi analizinin önemi.
- Saç köklerini zarar vermeden deri örnekleri hazırlamadaki zorluklar.
Çalışmanın Amacı
- Hücre çoğalmasını ve protein ekspresyonunu 3D'de görselleştirmek.
- Deri anatomisi ve patolojisini doğru bir şekilde değerlendirmek.
- Epidermis ve dermis arasındaki etkileşimleri keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- Doku açıklığını sağlamak için CUBIC protokolü.
- 3D görselleştirme teknikleri.
- Tek hücre çözünürlüğü analizi.
- Fare modellerinden tam kalınlıklı deri biyopsileri.
Ana Sonuçlar
- Deri biyopsilerindeki bireysel hücrelerin başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- Protein ekspresyon paternlerinin daha iyi anlaşılması.
- Anormal epidermal fenotipler hakkında bilgiler.
- Deri hastalığı araştırmalarının kolaylaştırılması.
Sonuçlar
- CUBIC protokolü, deri analizi için basit ama etkili bir yöntemdir.
- Deri hücre etkileşimlerini görselleştirmede benzeri görülmemiş doğruluk sağlar.
- Bu teknik, dermatoloji ve yenileyici tıpta araştırmaları ilerletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
The CUBIC protocol enables high-resolution 3D visualization of protein expression and cellular dynamics in full-thickness skin biopsies, supporting mechanistic de-risking in dermatology target validation. By providing single-cell resolution data on epidermal stem/progenitor populations and their interactions with the dermis, the method enhances predictive confidence in preclinical models of skin regeneration and disease. This capability aids in prioritizing therapeutic hypotheses and reducing biological ambiguity in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell dynamics in intact tissue architecture.
- Scientific Value: Supports functional target validation through spatial mapping of proliferation (Ki67) and sebocyte differentiation (Nile Red) in genetically modified models.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking by quantifying abnormal epidermal phenotypes and stromal interactions in 3D without sectioning artifacts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization by preserving epidermal-dermal architecture and appendage integrity.
- Operational Value: Enables reproducible quantitative outputs for protein expression and cell proliferation across conditions, supporting assay scalability.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by providing a clear, intact tissue platform for reliable compound or genetic perturbation evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant system integrity by visualizing hyperplasia, abnormal follicle morphology, and stem cell mass expansion in transgenic models.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment through correlative analysis of K14, Ki67, and sebocyte markers with phenotypic outcomes.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into epidermal-dermal crosstalk during homeostasis and perturbation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through preclinical validation, enabling iterative assessment of skin-specific biological responses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving spatial expression patterns of keratinocytes, proliferating cells, and sebocytes in intact skin.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized clearing and staining of full-thickness biopsies with consistent follicle orientation.
- Analytics: Generates quantitative 3D readouts on protein expression and cell density that enable cross-condition comparison and target ranking.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by preserving disease-relevant epidermal and dermal structures for longitudinal analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue processing platform applicable across wild-type, mutant, and treatment-induced skin models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in epidermal regeneration pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through a simple, solvent-based clearing protocol compatible with conventional confocal microscopy.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of on-target and off-target epidermal effects in preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing mechanistic data on stem cell dynamics and sebaceous gland function in disease-relevant contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling and immunofluorescence staining to preserve epidermal appendages during biopsy preparation.
- Depends on access to a hybridization oven, rotating platform, and confocal microscope with standard epifluorescence filters for 3D imaging.
- Necessitates cross-team standardization of biopsy orientation and clearing duration to ensure consistent refractive index matching and imaging quality.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to thicker human skin explants or alternative mammalian models due to lipid and collagen content.
- Involves practical limitations related to the duration of clearing and washing steps, which may extend timelines for high-throughput screening applications.
