Matrix Rijitlik Akrilamid tabanlı Hidrojeller kullanarak Hücresel Fonksiyon Üzerindeki Etkilerinin incelenmesi

Akrilamid hidrojeller kullanarak in vivo doku uyumunu modellemek. Bu, önce reaktif alt kapak fişleri ve silikonlu üst kapak fişleri oluşturularak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, akrilamid hidrojellerin dökülmesi ve oluşturulmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, tercih edilen hücre dışı matris proteininin hidrojele çapraz bağlanmasıdır. İşlemin son adımı, hücrelerin inkübasyonu ve analizidir. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskobu, gerçek zamanlı kantitatif PCR ve western blotlama kullanılarak yapılan analizler yoluyla in vitro olarak değişen hücre dışı matris uyumunun hücre davranışını nasıl düzenlediğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bugün size akrilamid hidrojellerin üretilmesi ve kullanılması için prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda hücre dışı matriks sertliğimizi incelemek, hücre morfolojisini, hücre sinyalizasyonunu ve proliferasyonunu düzenlemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Bu prosedüre reaktif kapak fişleri oluşturarak başlayın. İlk olarak, 150 milimetrelik bir Petri kabının alt yarısına bir paraform tabakası yerleştirin. Daha sonra dokuz adede kadar otoklav 25 milimetre kapak fişini para filme aktarın ve bunları bir mililitre 0.1 molar sodyum hidroksit ile kaplayın.

Kapak fişlerini üç dakika inkübe edin İnkübasyonun ardından, sodyum hidroksiti, her bir kapak fişinde 0,5 mililitre üç amino profil trimetil veya üç A-P-T-M-S pipet kimyasal bir başlık pipetinde çalışan bir vakum hattı ile aspire edin. Kapak fişlerini üç dakika inkübe edin ve ardından üç A-P-T-M-S'yi aspire edin. Kapakta köpük oluşumunu önlemek için çok uzun süre kuluçkaya yatırmamaya dikkat edin.

Tedaviyi takiben kayar. Kapak fişlerini aynı kapta 20 mililitre deiyonize su ile bir kez durulayın. Kapak fişlerini kavisli forseps kullanarak tabaktan çıkarın ve işlenmiş olarak bakacak şekilde 150 milimetrelik yeni bir tabağa aktarın.

Daha sonra kapak fişlerini tekrar deiyonize su ile yıkayın ve 10 dakika boyunca külbütörün üzerine koyun. İnkübasyondan sonra suyu çıkarın ve iki kez daha yıkayın. Glutaraldehit ile reaksiyona girmeyecek ve glutaraldehit için kullanımdan 10 dakika önce bulanık beyaz bir çökelti bırakmayacak şekilde üç A-P-T-M-S'nin de çıkarılması çok önemlidir.

Kavisli forseps kullanarak, kapak fişlerini param ile kaplanmış temiz bir tabağa aktarın ve kalan sıvıyı bir vakum hattı kullanarak aspire edin, ardından her bir kapak fişini steril deiyonize suda 0,5 mililitre %0,5 glutaraldehit ile tamamen kapatın ve üç APTMS ve poli akrilamid jeli çapraz bağlayın. Kapak fişlerini kimyasal bir başlıkta 30 dakika inkübe edin. Daha sonra glutaraldehit durulamasını aspire edin ve kapak fişlerini tekrar deiyonize su ile yıkayın.

Ardından kapak fişlerini tamamen kurulayın. Kloroform ve kaya içinde %10'luk bir yüzey sızdırmazlık çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir Falcon tüpüne en az 10 dakika boyunca yeni kapak fişleri ekleyin. Yüzey sızdırmazlık solüsyonunu boşaltın ve havayla kurutun.

Kapak, hidrojellerin hidrojel hazırlamaya başlamak için hazırlanacağı biyolojik güvenlik kabinindeki Kim mendillerinin üzerine kayar. Kapak kızaklarını reaktif tarafı yukarı bakacak şekilde biyolojik güvenlik kabininin yüzeyine bantlanmış bir paraform tabakasına aktarmak için kavisli forseps kullanın. Kapak kızaklarının paraform yüzeyinde düz olduğundan emin olun.

Daha sonra, az miktarda NHS'yi yeterli toluen içinde çözerek toluen içinde doymuş ve hidroksi bir CIN yardımcısı veya NHS çözeltisi hazırlayın. Spesifik deneyler için, NHS artık çözülmeyene kadar az miktarda NHS ekleyin. Doymuş çözelti genellikle bulanık ve pembedir.

Ardından, istenen akrilamid yüzdesine ulaşmak için akrilamid BIS akrilamid suyunu ve bir PS'yi hazırlayın. Reaktifleri yazılı protokolde belirtildiği gibi mikro kullanım tüplerine ekleyin. Sonra her seferinde bir alikot.

NHS ve TM me'yi ekleyin. Tüpü kısa ve hemen girdaplayın: Biyolojik güvenlik kabinlerinde kapak kayma başına 140 mikrolitre kullanarak üç ila beş jel dökün. SİLİKONİZE 25 milimetrelik kapak kızağını, polimerleşmeye başlamadan önce her bir jelin üzerine hızlı bir şekilde yerleştirin.

Üst kapak sürgüsünün eklenmesi, akrilamidin alt kapak kızağını tamamen kaplamasını sağlayacaktır. Polimerizasyonun ne zaman meydana geldiğini belirlemek için bu sandviçi akrilamid polimerize olana kadar oda sıcaklığında inkübe edin. Mikro santrifüj tüpündeki artık akrilamid çözeltisini kontrol edin.

Polimerizasyon, sert jeller için birkaç dakika ve yumuşak jeller için biraz daha uzun sürecektir. Polimerizasyon meydana geldiğinde, steril eldiven giyerek sandviçi dikkatlice alın. Ardından, polimerize jelin dışına çıkana kadar üst kapak kızağını kaydırın.

Ardından kapağı kaldırın. Jeli kaydırın, üst kapak fişini atın. Bundan sonra hidrojel adı verilen her bir alt jel kapak kızağını altı oyuklu bir plakaya yerleştirin.

Daha sonra, altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına iki mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS ekleyin. Daha sonra hidrojelleri PBS ile yıkayın ve beş dakika boyunca bir külbütör üzerinde inkübe edin. Bu yıkamayı iki kez tekrarlayın.

Deneye başlamak için, her hidrojeli iki mililitre bir fibronektin çözeltisi veya başka bir hücre dışı matris proteini ile kaplayın. ECM çözeltisini aspire ettikten sonra gece boyunca hidrojele kovalent olarak bağlanmasına izin vermek için proteini hidrojel üzerinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, reaktif olmayan NHS'yi serum içermeyen ortamda mililitre başına bir miligram ısıtma aktif yağ asidi içermeyen sığır serum albümini ile bloke edin ve 37 santigrat derecede en az 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, hidrojelleri steril PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri fetal sığır serumu içeren uygun kültürlenmiş ortamda plakalayın. Buradaki hidrojel üzerine.

Fare embriyonik fibroblastları kurmak için kullanılır. Deney için gereken hücrelerin yayılma ve birleşme derecesine bağlı olarak hidrojel üzerine ekilecek hücre sayısını belirleyin. Western blot ve kantitatif PCR analizi için gerekli olan yaklaşık 10 ila beş hücre.

Daha sonra hücreleri, belirli hücre tipi için uygun koşullar altında inkübe edin. Kuluçka dönemini takiben. İhtiyaca göre hücre proteinini veya mRNA'yı çıkarın.

100 mikrolitrelik lizis tamponu damlacıklarını laboratuvar tezgahındaki bir paraform tabakasına pipetleyin ve her damlacık arasında yaklaşık iki ila üç santimetre bırakın. Daha sonra, alt kapak kızağını kuyudan kaldırarak her bir hidrojeli dikkatlice çıkarın. Kavisli forseps kullanarak ve hücre tarafını damlacıkların üzerine aşağı gelecek şekilde yerleştirerek.

Hücreleri lizis tamponu ile tam olarak bir dakika inkübe edin. Son olarak, kapak fişlerini çıkarın ve lizis tamponunu bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Alternatif olarak, RNA'yı çıkarırken, her bir hidrojeli yeni bir altı oyuklu plakaya aktarın ve oyuk başına bir mililitre triazol ekleyin.

Jelleri inkübasyondan sonra üç dakika inkübe edin. Bir mikro santrifüj tüpünde saklamak için triazol çözeltisini çıkarın. A-P-T-M-S ilavesini takiben lamellerin iyice yıkanması, reaktif lamel üretiminde önemli bir adımdır.

Düzgün yıkanmış ve kuru örtü fişlerinde herhangi bir çökelti kalıntısı yoktur. A-P-T-M-S, glutaraldehit ile reaksiyona girecek ve beyaz bulanık bir çökelti üretecektir. Çökelti ise, kapak fişi artık kullanılamayacağı için tüm prosedür tekrarlanmalıdır.

Hidrojel oluşumu ve ECM proteinleri ile kaplandıktan sonra, gece boyunca hücreler tohumlanır. Boyamada foid ile görülebileceği gibi sert ve yumuşak hidrojeller üzerine yayılan hücreler arasında belirgin bir fark vardır ve fare embriyonik fibroblast hücreleri yumuşak hidrojellere kıyasla daha fazla sert yayılır. Gerçekten de, yumuşak bir hidrojele bağlanan çoğu hücre kompakt kalacak ve daha az verimli bir şekilde bağlanacaktır.

Fare embriyonik fibroblastlarındaki döngü D one mRNA seviyelerinin temsili kantitatif PCR sonuçları, döngü D bir'in sert bir matris üzerinde önemli ölçüde yukarı regüle edildiğini, ancak yumuşak bir matris üzerinde olmadığını göstermektedir. Bu, matris sertliğinin in vitro hücre döngüsü ilerlemesini düzenlediğini göstermektedir. Az önce size hidrojel kesme sertliğinin nasıl oluşturulacağını, in vivo fizyolojik koşulların modellenmesini gösterdik Bu işlemi yaparken, kaza ve hata meydana geleceğinden ekstra reaktif kapak fişleri yapmayı unutmamak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.