Name: Matrix Rijitlik Akrilamid tabanlı Hidrojeller kullanarak Hücresel Fonksiyon Üzerindeki Etkilerinin incelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Keşfedin poliakrilamid hidrojeller kullanarak substrat rijitliğinin hücre davranışları üzerindeki etkilerini. İmmünofloresan mikroskopi, gerçek zamanlı kantitatif PCR ve western blotting teknikleriyle hücre morfolojisi ve gen ekspresyonu analiz edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

İş bizim laboratuar Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe tarafından desteklenmektedir.

Hazırlık <ul><li> Lameller otoklava olmalıdır. </li><li> Steril distile veya deiyonize su çözümler hazırlamak ve çamaşır lamelleri için kullanılmalıdır. </li><li> AC (% 40 w / v) ve bis-AC (% 1 w / v) çözümleri 0.2 mikron filtre ile sterilize edilir. Kullanımı ve steril filtre kısa bir süre önce,% 10 amonyum persülfat (100μg/ml su APS) hazırlayın. APS çözüm aylık değiştirin. </li><li> 3-APTMS, kloroform, glutaradehyde, NHS ve SurfaSil gibi kimyasal reaktifler otoklavlanmalıdır sadece hidrojellerin hazırlanması için kullanılan atanmış bir şişe içinde tutulur. </li><li> En iyi sonuç için, hidrojeller uygun ECM protein ile geceleme inkübasyondan sonra birkaç gün içinde kullanılabilir olmalıdır. </li><li> Hidrojel dökülmesinden önce, 50 ml polipropilen Falcon tüp kloroform (10 ml genelde 20 üst lamelleri için yeterli)% 10 SurfaSil çözüm hazırlayın. (Bizim laboratuvar genellikle% 0.5 glutaraldehid kuluçka adımı sırasında üst lamelleri siliconizes). En az 10 dakika süreyle Falcon tüp ve kaya lamelleri ekleyin. SurfaSil çözüm Durusu ve hava hidrojeller hazırlanacaktır biyolojik güvenlik kabini Kimwipes lamelleri kuru. </li><li> Isı ile inaktive edilmiş BSA çözüm aşağıdaki gibi hazırlayın: PBS içinde yağ asidi serbest BSA 20 mg / ml solüsyon 30 dakika süreyle 68 ° C su banyosunda inkübe edilir. Çözüm, daha sonra steril 4 ° C'de filtre ve depolanan </li></ul> Prosedür <ol><li> 150 mm Petri kabında alt yarısında Parafilm bir kat yerleştirin. </li><li> 9 Parafilm üstüne 25 mm lamelleri yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve 1 ml 0.1 M NaOH ile onları kapsayacak. 3 dakika sonra bir vakum hattı ile aspire inkübe. </li><li> Her lamel kimyasal bir davlumbaz, 3 yerde 0.5 ml APTMS çalışma. 3 dakika inkübe edin ve sonra APTMS aspirat. Çok uzun süre beklerseniz, bir köpük oluşacaktır. </li><li> Lamelleri aynı çanak 20 ml deiyonize su ile durulayın. Kavisli bir forseps kullanarak çanak lamelleri çıkarın ve onların tedavi tarafı yeni bir 150-mm çanak yukarı bakacak şekilde aktarabilirsiniz. Her bir yıkama için 10 dakika, rocker, lamelleri üç kez deiyonize su ile yıkayın. Tüm APTMS kaldırmak için başarısız olursa, bir sonraki adımda glutaraldehid tepki ve beyaz bulutlu bir çökelti (Şekil 1) bırakın. </li><li> Glutaraldehit Çözülme (~ kullanmadan önce 10 dakika). </li><li> Kavisli bir forseps kullanarak, temiz bir tabak Parafilm katmanlı lamelleri transferi ve kalan herhangi bir sıvı aspire. Gerektiği gibi kalan suyu örtecek bir vakum hattı veya Kimwipe kullanın. </li><li> Her lamel 0.5 ml steril deiyonize su içerisinde% 0.5 glutaraldehid ile tamamen örtün ve 30 dakika kimyasal bir kaput inkübe edin. Glutaraldehid aspire. Durulayın ve 4. adımda lamelleri yıkayın. Lamelleri tamamen kurulayın. [Burada durdurmak ve kuru bir alanda birkaç hafta lamelleri bırakabilirsiniz]. </li><li> Hidrojeller hazırlamak için hazır olduğunuzda, lamelleri, reaktif yüzü yukarı, biyolojik güvenlik kabini yüzeye bantlanmış olmuştur Parafilm bir sayfa aktarmak için kavisli bir forseps kullanın. Lamelleri Parafilm yüzey üzerinde düz olduğundan emin olun. </li><li> Toluen doymuş bir NHS çözüm hazırlayın. (Özellikle deney için yeterli toluen NHS küçük bir miktar çözülür. NHS artık eriyene kadar biraz NHS biraz ekleyerek tutun. Doymuş çözüm genellikle bulutlu ve pembe.) </li><li> Daha sonra, istenen akrilamid yüzde ulaşmak için akrilamid, bis-akrilamid, su ve APS hazırlar. 0.8ml toplam hacmi aşağıda özetlenen mikrosantrifüj tüpler reaktifler ekleyin. </li><li> Daha sonra, her seferinde bir kısım, NHS ekleyin ve 0.8 ml AC çözüm TEMED, girdap kısa ve DERHAL biyolojik güvenlik kabini lamel başına 140 ul kullanarak 3-5 jeller dökün. Mümkün olduğunda, bu noktadan itibaren tüm adımları bir biyolojik güvenlik kabini yapılmalıdır. [Not: ihtiyaca göre farklı boyut lamelleri göre kullanılabilir. 18 mm lamelleri kullanılması durumunda, lamel ortalama ~ 33 ul AC çözümü ve 18 mm üst silikonlu lamel kullanın.] <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Bis-AC (%) </td></tr><tr><td></td><td> 0.3 (sert) </td><td> 0,15 </td><td> 0,06 </td><td> 0.03 (yumuşak) </td></tr><tr><td></td><td> ul </td><td> ul </td><td> ul </td><td> ul </td></tr><tr><td> Su </td><td> 402 </td><td> 522 </td><td> 594 </td><td> 618 </td></tr><tr><td> AC </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Bis-AC </td><td> 240 </td><td> 120 </td><td> 48 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> APS </td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> TEMED</td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> NHS </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td></tr></tbody></table></li><li> Polimerize başlamadan önce her jel üstünde silikonlu 25 mm lamel hızla yerleştirin. Üst lamel eklenmesi AC tamamen alt lamel karşılamak için izin vermelidir. Bu "sandviç" AC polimerize kadar oda sıcaklığında inkübe edin. (Polimerizasyon oluştu belirlemek için mikrosantrifüj tüp içinde kalan AC çözüm kontrol edin. Genellikle birkaç dakika sert jeller ve yumuşak olanlar için biraz daha uzun yeterli olacaktır.) </li><li> Dikkatle sandviç pick up (steril eldiven) ve çıkıntılar polimerize jel kadar üst lamel kapalı slayt. Daha sonra jel kapalı gözetlemek. Üst lamel çıkarmadan önce çok uzun süre beklemek durumunda lamel kaldırılmış olduğundan, jel rip. </li><li> Üst lamel atın. 2 ml PBS / alt jel lamelleri (bundan sonra hidrojel denir) 6-iyi tabak içine yerleştirin. PBS, her kuyuya jel-lamel önce veya sonra eklenebilir. Rocker, yıkama başına 5 dakika hidrojeller, üç kez PBS ile yıkayın. </li><li> Hidrojellerin gerekli sayıda hazırlanmıştır kadar tekrarlayın 11-14 adımları. </li><li> Fibronektin solüsyonu (PBS içinde 3 mg / ml) veya diğer ECM protein (Klein ve ark. Ayrıntılar için 13) 2 ml her hidrojel örtün. ECM protein kovalent 4 ° C'de gece inkübasyon sırasında hidrojel bağlı olur </li><li> , En az 30 dakika süreyle 37 ° ECM çözümü ve serum ücretsiz medya 1mg/ml ısı ile inaktive edilmiş yağ asidi serbest BSA blok girmemiş NHS aspire ° C hücre kültürü inkübatörde. Hidrojeller steril PBS veya hücre kültür ortamı ile bir kez durulayın. </li><li> FBS içeren uygun bir kültür ortamı Levha hücreleri. Hidrojel numaralı seribaşı hücrelerin sayısı, hücre deneyleri için gerekli yayılması ve confluency derecesi dayalı kullanıcı tarafından belirlenmelidir. Yaklaşık 10 5 hücreleri genellikle batı ve qPCR blot analizi için yeterli olacaktır. </li><li> Kuluçka döneminin ardından, hücrenin protein ya da mRNA elde edilebilir. Lamelleri kuyulardan kavisli bir forseps kullanarak dikkatlice çıkarılır ve laboratuarlarında Parafilm bir sayfa boyunca (2-3cm) aralıklı edilmiştir lizis tamponu 100 ul damlacıkları üst (hücre tarafı aşağı) yerleştirilir. (Biz batı blot örnekleri hazırlamak ve qPCR için RNA izole etmek için, sırasıyla standart SDS örnek tampon ve TRIzol kullanın.) Lizis tamponu ile hücrelerin tam bir dakika boyunca inkübe edin. Lamelleri çıkarın ve bir mikrosantrifüj tüp lizis tamponu aktarmak. Alternatif olarak, kullanıcı sadece RNA çıkarılması için yeni bir 6-plaka Her hidrojel transferi ve 1 ml TRIzol / iyi ekleyebilirsiniz. 3 dakika boyunca inkübe ve mikrosantrifüj tüp depolama için TRIzol çözüm kaldırmak. </li></ol> Immünofloresan olarak prosedürler hakkında ek bilgi, hidrojeller üzerinde seribaşı hücreler için BrdU boyama, transfeksiyon, vb Klein ve ark. 13, 2007. Temsilcisi Sonuçlar APTMS ek lamelleri iyice yıkama "reaktif" lamelleri üretiminde önemli bir adımdır. APTMS tamamen kaldırmak için başarısız olursa, sonraki adımda glutaraldehid tepki ve Şekil 1A görüldüğü gibi beyaz bulutlu çökelti üretmek. Şekil 1B, uygun bir şekilde yıkanır ve kurutulur lamel gösterir. Çökelti oluşursa lamel artık deresindeki tüm prosedürü başından itibaren yeniden başlatılması gerekir. Gecede ECM proteinleri ile hidrojel oluşumu ve kaplama sonrasında, hücrelerin ertesi gün seribaşı olabilir. Şekil 2'de görüldüğü gibi, sert karşı yumuşak hidrojeller yayılan hücre arasında belirgin bir fark vardır. Fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) Phalloidin boyama tarafından görüleceği gibi yumuşak hidrojeller ile karşılaştırıldığında, hücre sert büyük ölçüde yayılmıştır. Gerçekten de, en hücreleri yumuşak hidrojel bağlama kompakt kalacaktır ve daha verimli bir şekilde takın. Hücre yayılmasında fark sadece MEF morfolojisi Şekil 2'de gösterildiği gibi olmasına rağmen, diğer birçok hücre hatları tutarlı 11-12,14 test. Başarı sırları <ol><li> Işlemi başladıktan sonra, "reaktif" yan lamelleri tutmak ve hangi tarafı kaplanmış akılda tutmak çok önemlidir. </li><li> Eldivenler işlem sırasında mümkün olduğu kadar steril bir çalışma ortamı sağlamak için tüm zamanların giyilmelidir. </li><li> Ilk adımlar çoğu kimyasal bir davlumbaz ve laboratuar tezgah arasında yapılmaktadır. Lamelleri fazla glutaraldehid çıkarmadan sonraki tüm adımlar, biyolojik güvenlik kabini altında yürütülmelidir. </li><li> Hücre sprea farklılıklar nedeniyleding (Şekil 2) sert hidrojeller ile karşılaştırıldığında, yumuşak hidrojeller hücre sayısının iki katını ekim tavsiye ederiz. </li><li> AC polimerizasyon işlemi son derece hızlı. Ilk kez kullananlar için, bir APS miktarını azaltabilir veya polimerizasyon süreci uzatmak için çözüm TEMED. Bir defada birkaç lamelleri daha hazırlamak için kalkmayın. </li><li> G0 senkronizasyon gereklidir hücre döngüsü çalışmalarda, genellikle plastik kültür kaplarına hücreler serum açlıktan hücreleri trypsinize ve mitojenler varlığı (FBS ve / veya büyüme faktörleri) farklı uyumluluklar hidrojeller onları reseed. Bu prosedür G0 senkronize hücrelerinin başlangıç ​​nüfus tüm örneklerde aynı olmasını sağlar. Ancak, birçok sinyal iletimi çalışmaları için gerekli mitojenle stimülasyon süresi eki ve hücrelerin yayılmasını sağlamak için yeterince uzun olmayabilir. Bu durumda, biz hidrojeller hücreler serum açlıktan ve sonra doğrudan mitojen ile onları uyarmak. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1a.jpg" alt="Şekil 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1a"> Şekil 1A. Yanlış lamel yıkanmış APTMS ek ardından, lamel glutaraldehid çözüm ek önce 1-2 dakika yıkandı. Usul özetlenen adımları göre yıkanmamış lamel bir çökelti oluşturur. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1b.jpg" alt="Şekil 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1b"> Şekil 1B. Düzgün lamel yıkanır. APTMS sonra eklenmesi, lamel glutaraldehid çözümünün yanı sıra her biri 10 dakika önce üç kez yıkandı . Lamel çökelti oluşturur. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Sertlik farklı. Hidrojeller hücre Morfoloji MEFS 9 saat boyunca yüksek veya düşük sertlik fibronektin kaplı hidrojeller numaralı seribaşı kuruldu. Kuluçka döneminin ardından, hücreler, sabit permeabilize ve f-aktin bağlanır FITC-Phalloidin ile boyandı. Yüksek sertlik jeller MEFS düşük sertlik hidrojeller numaralı seribaşı göre stres liflerin sergilemek ve iyi yayılır. Ölçek çubuğu = 50μm. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Temsilcisi fare siklin D1 mRNA düzeyleri kantitatif PCR sonucu serum açlıktan fare embriyonik fibroblastlar yüksek (% 3 akrilamid) veya düşük (% 0.3 akrilamid) sertlik hidrojeller üzerine kaplama ve 9 saat 10% FBS ile uyarılır. RNA ekstraksiyonu takiben siklin D1 mRNA düzeyleri (18S RNA normalize), kantitatif gerçek zamanlı PCR analizi yapıldı. G0 siklin D1 mRNA latent hücreleri temsil eder. Siklin D1 mRNA düzeyleri sert hidrojeller değil yumuşak hidrojeller önemli ölçüde artırır. SD yinelenen PCR reaksiyonları - Veri + / ortalama.

<ol><li>Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+analysis+of+heterogeneous%2C+atherosclerotic+human+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta.</a> J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).</li>
<li>Bernini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness%2C+intima-media+thickness+and+carotid+artery+fibrosis+in+patients+with+primary+aldosteronism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibrosis in patients with primary aldosteronism.</a> J Hypertens. 26, 2399-2405 (2008).</li>
<li>Boonyasirinant, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+stiffness+is+increased+in+hypertrophic+cardiomyopathy+with+myocardial+fibrosis%3A+novel+insights+in+vascular+function+from+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Aortic stiffness is increased in hypertrophic cardiomyopathy with myocardial fibrosis: novel insights in vascular function from magnetic resonance imaging.</a> J Am Coll Cardiol. 54, 255-2562 (2009).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Duprez, D. A., Cohn, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+as+a+risk+factor+for+coronary+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Atheroscler+Rep%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis.</a> Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).</li>
<li>Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+mechanical+properties+of+human+atherosclerotic+tissue+by+high-frequency+intravascular+ultrasound+imaging.+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb%22%5BJournal%5D)">Prediction of mechanical properties of human atherosclerotic tissue by high-frequency intravascular ultrasound imaging. An in vitro study.</a> Arterioscler Thromb. 12, 1-5 (1992).</li>
<li>Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li>
<li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+moduli+of+normal+and+pathological+human+breast+tissues%3A+an+inversion-technique-based+investigation+of+169+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples.</a> Phys Med Biol. 52, 1565-1576 (2007).</li>
<li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).</li>
<li>Pelham, R. J., Wang, Y. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc. Natl. Acad Sci USA. 94, 13661-13665 (1997).</li>
<li>Klein, E. A., Yung, Y., Castagnino, P., Kothapalli, D., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion%2C+cellular+tension%2C+and+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control.</a> Methods Enzymol. 426, 155-175 (2007).</li>
<li>Klein, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+control+by+physiological+matrix+elasticity+and+in+vivo+tissue+stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening.</a> Current Biology. 19, 1511-1518 (2009).</li>
</ol>

Hidrojel polimerizasyon işlemi çok önemli bir unsur hücreleri ECM-kaplı hidrojel kendini daha ziyade cam lamel bağlamak sağlayacak hava kabarcığı oluşumunu önlemek için. Bu vorteks ve görsel hiçbir hava kabarcığı jel tuzak haline emin sonra dikkatli bir şekilde polimerizasyon çözüm pipetleme önlenebilir. Biz her zaman deneyler için yeterince sağlamak için ek &quot;reaktif&quot; lamelleri ve hidrojellerin hazırlanması önerilir. Jeller PBS ile yıkanır zaman özellikle dikkat edilmelidir. Hidroj...

<table><tbody><tr><td>Glutaraldehit, %70</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7776</td><td>-20&amp;#x00B0;C'de saklayın</td></tr><tr><td>3-APTMS (3-Aminopropiltrimetoksisilan %97)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td>Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>SurfaSil Silikonlama Sıvısı</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>42800</td><td>Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>NHS (N-hidroksisuksinimid Ester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-8060</td><td>4&amp;#x00B0;C'de saklayın, aylık olarak yenileyin</td></tr><tr><td>Albumin, sığır serumu, esasen yağ asidi içermeyen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003-100G</td><td>4&amp;#x00B0;C'de saklayın</td></tr><tr><td>Lamel (25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86 25 Cir 1D</td><td></td></tr><tr><td>Lamel (18mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-84 18 Cir 1D</td><td></td></tr></tbody></table>

matrix rijitlik akrilamid tabanlı hidrojeller kullanarak hücresel fonksiyon Üzerindeki etkilerinin incelenmesi

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Doku sertliği hücresel fonksiyonunun önemli bir belirleyicisi olup, doku sertliği değişiklikler yaygın fibrozis, kanser ve kardiyovasküler hastalık 1-11 ile ilişkilidir. Geleneksel hücre biyolojik yaklaşımlar hücresel fonksiyonu çalışmalarında elastik bir ECM ya da dokular arasında ECM sertlik değişikliklerin etkisini dikkate almaz, katı bir alt tabaka üzerinde kültür hücreleri (plastik tabaklar ya da cam lamelleri) içerir. In vitro, in vivo doku uyumu şartları model için, biz ve diğerleri ECM-kaplı hidrojeller kullanın. Laboratuvarımızda, hidrojeller dizi 12 biyolojik olarak görülen doku uygunluk bildirimleri taklit edebilir poliakrilamid dayanmaktadır. &quot;Reaktif&quot; kapak fişleri 3-APTMS Ayrıca NaOH ile kuluçka tarafından üretilir. Glutaraldehyde 3-APTMS ve poliakrilamid jel çapraz bağlamak için kullanılır. Akrilamid (AC), bis-akrilamid (Bis-AC) ve amonyum persülfat bir çözüm hidrojel polimerizasyon için kullanılır. N-hydroxysuccinimide (NHS), hidrojel çapraz ECM protein AC çözüm içine dahil edilmiştir. Hidrojel polimerizasyonu sonra jel yüzeyi, fibronektin, vitronectin, kollajen, vb gibi bir seçim ECM protein ile kaplıdır Bir hidrojel sertlik reoloji veya atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tarafından belirlenir ve çözüm 12 AC ve / veya bis-AC yüzdesi değişen ayarlanabilir. Bu şekilde, alt tabaka sertlik reoloji veya AFM kullanılarak belirlenebilir Biyolojik dokuların sertlik eşleştirilmiş olabilir. Hidrojeller ve kültürlü gerekli deneysel koşullar dayalı bu hücreler daha sonra numaralı seribaşı olabilir. Moleküler analiz için hücre ve onların kurtarma Görüntüleme basittir. Bu yazı için, yumuşak katmanlarından 20.000 Pascal &lt;E 3000 Pascal ve sert doku katmanlarından /&gt; elastik modülü (E) olarak tanımlar.

Hücresel fonksiyonları katmanlarından sertlik etkisi modellenmiş olabilir<em&gt; In vitro</em&gt; Uyumluluklar değişen poliakrilamid hidrojeller.

Matrix Rijitlik Akrilamid tabanlı Hidrojeller kullanarak Hücresel Fonksiyon Üzerindeki Etkilerinin incelenmesi

Doku sertliği, hücresel fonksiyonun önemli bir belirleyicisidir ve doku sertliğindeki değişiklikler yaygın olarak fibrozis, kanser ve ... ile ilişkilendirilir.

Akrilamid hidrojelleri kullanarak in vivo doku kompliyansını modellemek. Bu işlem, öncelikle reaktif alt lamel ve silikonize üst lamellerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise akrilamid hidrojellerinin dökülmesi ve oluşturulmasıdır.Prosedürün üçüncü adımı, seçilen hücre dışı matris proteininin hidrojele çapraz bağlanmasıdır. Prosedürün son adımı ise hücrelerin inkübasyonu ve analizidir. Sonuç olarak, immunofloresan mikroskobi, gerçek zamanlı kantitatif PCR ve western blotting analizleri kullanılarak, in vitro ortamdaki farklı hücre dışı matris kompliansının hücre davranışını nasıl düzenlediğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bugün size akrilamid hidrojellerin üretimi ve kullanımı prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda, hücre morfolojisini, hücre sinyalizasyonunu ve proliferasyonunu düzenleyen hücre dışı matris sertliğini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Bu prosedüre reaktif lameller hazırlayarak başlayın. Önce, 150 milimetrelik bir Petri kabının alt yarısına bir kat parafilm yerleştirin. Ardından, dokuz adede kadar otoklavlanmış 25 milimetrelik lamelin parafilm üzerine aktarın ve üzerlerini bir mililitre 0,1 molar sodyum hidroksit ile kaplayın.Lamelleri üç dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, kimyasal çeker ocak içinde çalışan bir vakum hattı ile sodyum hidroksiti aspire edin. Her lamelin üzerine 0,5 mililitre üç amino profil trimetilsilan (3-APTMS) pipetleyin. Lamelleri üç dakika boyunca inkübe edin ve ardından 3-APTMS'yi aspire edin. Lamel üzerinde köpük oluşumunu önlemek için çok uzun süre inkübe etmemeye dikkat edin.İşlem sonrası lameller. Aynı kap içerisinde lamelleri bir kez 20 milliliters deiyonize su ile durulayın. Lamelleri kavisli pens kullanarak kaptan çıkarın ve işlem gören yüzeyleri yukarı bakacak şekilde yeni bir 150 millimeter kaba aktarın.Ardından lamelleri tekrar deiyonize su ile yıkayın ve 10 dakika boyunca sallayıcıya yerleştirin. İnkübasyonun ardından suyu uzaklaştırın ve iki kez daha yıkayın. Glutaraldehit ile reaksiyona girip bulutlu beyaz bir çökelek oluşturmaması için, glutaraldehit kullanımından 10 dakika önce tüm A-P-T-M-S'nin uzaklaştırılması çok önemlidir.Kavisli pensler kullanarak, lamine lamelleri param ile kaplanmış temiz bir kaba aktarın ve kalan sıvıyı bir vakum hattı yardımıyla aspire edin; ardından, üç A-P-T-M-S ve poliakrilamid jeli çapraz bağlamak için her bir lamine lamelin üzerini steril deiyonize su içindeki 0,5% glutaraldehitten 0,5 milliliters ile tamamen kaplayın. Lamine lamelleri bir kimyasal çeker ocak içerisinde 30 dakika inkübe edin. Daha sonra glutaraldehit durulama solüsyonunu aspire edin ve lamine lamelleri tekrar deiyonize su ile yıkayın.Ardından lamelleri tamamen kurutun. Kloroform içinde %10'luk yüzey mühürleme çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir Falcon tüpüne yeni lameller ekleyin ve en az 10 dakika boyunca sallayın. Yüzey mühürleme çözeltisini dökün ve havada kurutun.Hidrojellerin hazırlanacağı biyolojik güvenlik kabininde, lamine lamlar Kim mendiller üzerine yerleştirilerek hidrojel hazırlığına başlanır. Kavisli penseler kullanarak lamine lamları, biyolojik güvenlik kabininin yüzeyine bantlanmış bir paraform levhasına reaktif yüzeyleri yukarı gelecek şekilde aktarın. Lamine lamların paraform yüzeyinde düz olduğundan emin olun.Ardından, yeterli miktarda toluen içerisine küçük bir miktar NHS çözerek toluen içinde doygun bir NHS çözeltisi hazırlayın. Spesifik deneyler için, NHS artık çözünmeyene kadar küçük miktarlarda NHS ekleyin. Doygun çözelti genellikle bulanık ve pembe renklidir.Ardından, istenen akrilamid yüzdesine ulaşmak için akrilamid, BIS akrilamid, su ve PS hazırlayın. Yazılı protokolde belirtildiği gibi reaktifleri mikro tüplere ekleyin. Daha sonra her seferinde bir alikot ekleyin.NHS ve TM ekleyin. Tüpü kısa bir süre vorteksleyin ve ardından biyolojik güvenlik kabininde, her bir lam için 140 µL kullanarak üç ila beş jele hemen paylaştırın. Polimerizasyon başlamadan önce, her jelin üzerine hızlıca SİLİKONİZE 25 mm lam yerleştirin.Üst örtü camının eklenmesi, akrilamidin alt örtü camını tamamen kaplamasını sağlayacaktır. Polimerizasyonun gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemek için bu sandviç yapıyı, akrilamid polimerleşene kadar oda sıcaklığında inkübe edin. Mikro santrifüj tüpündeki kalıntı akrilamid solüsyonunu kontrol edin.Polimerizasyon işlemi, sert jeller için birkaç dakika, yumuşak jeller için ise biraz daha uzun sürecektir. Polimerizasyon gerçekleştiğinde, steril eldivenler giyerek sandviç yapıyı dikkatlice kaldırın. Ardından, üst kapatma lamını, polimerize olmuş jelin üzerinden taşana kadar kaydırarak çıkarın.Ardından kapağı kanırtarak açın. Jeli yerinden çıkarın, üst örtü camını atın. Bundan sonra hidrojel olarak adlandırılan her bir alt jel örtü camını altı kuyucuklu bir plakaya yerleştirin.Ardından, altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa iki mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS ekleyin. Daha sonra hidrojelleri PBS ile yıkayın ve bir sallayıcı üzerinde beş dakika inkübe edin. Bu yıkama işlemini iki kez tekrarlayın.Deneye başlamak için, her bir hidrojeli iki mililitre fibronectin çözeltisi veya diğer hücre dışı matris proteini ile kaplayın. Proteinin hidrojele kovalent olarak bağlanmasını sağlamak için proteini hidrojel üzerinde dört derece Celsius'da gece boyunca inkübe edin; gece boyu süren inkübasyonun ardından ECM çözeltisini aspire edin. Ardından, reaksiyona girmemiş NHS'yi, serumsuz ortamda bir miligram her mililitre ısı ile aktive edilmiş yağsız sığır serum albümini ile bloke edin ve 37 derece Celsius'da en az 30 dakika inkübe edin.İnkübasyonu takiben, hidrojelleri bir kez steril PBS ile yıkayın. Ardından hücreleri, fetal bovin serum içeren uygun kültür ortamında, buradaki hidrojelin üzerine ekleyin.Kurulmuş fare embriyonik fibroblastları kullanılır. Hidrojel üzerine ekilecek hücre sayısını, deney için gerekli olan hücre yayılım derecesine ve konfluense göre belirleyin. Western blot ve kantitatif PCR analizi için yaklaşık 10⁵ hücre gereklidir.Ardından hücreleri, ilgili hücre tipi için uygun koşullarda inkübe edin. İnkübasyon süresinin ardından, ihtiyaca göre hücre proteinini veya mRNA'yı ekstrakte edin.Laboratuvar tezgahındaki bir parafilm tabakası üzerine, her bir damlacık arasında yaklaşık iki ila üç santimetre boşluk bırakacak şekilde 100 µL'lik lizis tamponu damlacıkları pipetleyin. Ardından, kuyucuktan alt kapatma lamelini kaldırarak her bir hidrojeli dikkatlice çıkarın. Eğri pens kullanarak, hücre tarafı damlacıkların üzerine gelecek şekilde yerleştirin.Hücreleri lizis tamponu ile tam bir dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, lamel camlarını çıkarın ve lizis tamponunu bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Alternatif olarak, RNA ekstraksiyonu yapılırken her bir hidrojeli yeni bir altı kuyucuklu plakaya aktarın ve her kuyucuğa bir mililitre triazol ekleyin.İnkübasyonun ardından jelleri üç dakika boyunca inkübe edin. Triazol çözeltisini, bir mikro santrifüj tüpünde saklamak üzere uzaklaştırın. A-P-T-M-S eklemesinin ardından lamel örtülerin iyice yıkanması, reaktif lamel örtüler üretmede önemli bir adımdır.Uygun şekilde yıkanmış ve kurutulmuş lameller herhangi bir kalıntı çökelek içermez. A-P-T-M-S, glutaraldehit ile reaksiyona girerek beyaz, bulanık bir çökelek oluşturacaktır. Çökelek oluşursa, lamel artık kullanılamaz hale geldiği için tüm prosedür tekrarlanmalıdır.Hidrojel oluşumu ve ECM proteinleri ile kaplama işleminin ardından, hücreler gece boyunca ekilir. Boyamada görülebileceği üzere, sert ve yumuşak hidrojeller üzerinde yayılan hücreler arasında belirgin bir fark vardır; fare embriyonik fibroblast hücreleri, yumuşak hidrojellere kıyasla sert hidrojeller üzerinde daha geniş bir şekilde yayılır. Nitekim, yumuşak bir hidrojele tutunan çoğu hücre kompakt kalacak ve daha az verimli şekilde tutunacaktır.Fare embriyonik fibroblastlarındaki cycling D 1 mRNA seviyelerinin temsilci kantitatif PCR sonuçları, cycling D 1'in sert bir matriks üzerinde önemli ölçüde yukarı regüle edildiğini, ancak yumuşak bir matriks üzerinde edilmediğini göstermektedir. Bu durum, matriks sertliğinin in vitro hücre döngüsü ilerlemesini düzenlediğini göstermektedir. Size, in vivo fizyolojik koşulları modelleyen farklı sertliklerde hidrojel üretimini nasıl gerçekleştireceğinizi gösterdik. Bu prosedürü uygularken, kaza ve hatalar meydana gelebileceği için fazladan reaktif lamine camlar hazırlamanın önemli olduğunu unutmayın.İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

studying-effects-matrix-stiffness-on-cellular-function-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, hücre kültürü için uygun, uyumlu, ekstrasellüler matriks (ECM) kaplanmamış maddeler imal etmek için kullanılan deneysel teknikler göstermek ve çekiş gücü mikroskopi için uygun ve hücre davranışı üzerindeki etkilerinin gözlenmesi ECM sertlik.

Hücresel Daralma miktarının Şikayet Matrisler hazırlanması

Bu videoda, hücre dışı matris (ECM) sertliğinin yapışık hücrelerin bakteriyel enfeksiyonu üzerindeki etkisini incelemek için bir test gösterilmektedir. Kollajen ile kaplı, değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojeller, fizyolojik ECM'nin sertliğini taklit etmek için çok kuyulu bir plaka içinde katmanlanır. İnsan endotel hücrelerinin hidrojeller üzerine yerleştirilmesi ve hücrelerin hücre içi bir kez floresan proteini eksprese etmek üzere tasarlanmış Listeria monocytogenes bakterileri ile...

Hücre Dışı Matriks Sertliğinin Bakteriyel Enfeksiyon Üzerindeki Etkisini İncelemek İçin Bir Test

Biz minimum maliyetle veya uzmanlık ECM proteinlerinin doğrudan bağlanma sağlar hidroksi-PAAm adında yeni bir poliakrilamid hidrojel, sunuyoruz. Microcontact baskı hücresel mechanostransduction eğitim için doğal hücre mikroçevresinin birçok ipuçlarının bağımsız kontrolünü kolaylaştırır ile hidroksi-PAAm kombinasyonu hidrojellerinin.

Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

Laboratuvarımız iyi hücre fonksiyonu üzerinde doku sertliği modüle etkilerini anlamak için DNA çapraz bağlı poliakrilamid hidrojeller, dinamik bir hidrojel sistemi geliştirdi. İşte, bu hidrojeller hazırlamak için şemaları, açıklamaları ve protokolleri sağlamak.

DNA çapraz bağlı poliakrilamid hidrojellerinin hazırlanışı

Burada, poliakrilamid jellerin çok kuyulu plaka formatında hızlı, verimli ve ucuz bir şekilde hazırlanmasını sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından kolayca benimsenebilir. Sertliğe bağlı hücre tepkilerini anlamaya odaklanan araştırmalarda özellikle yararlı olacaktır.

Basit Poliakrilamid-tabanlı Sertlik bağımlı Hücre Yanıtların Çalışmaları multiwell Sertlik Deneyi

Bakteriyel enfeksiyon yapisan hücre hücre dışı matriks sertlik etkisi problama için çok iyi biçim polyacrylamide tabanlı tahlil geliştirdik. Bu tahlil akış sitometresi, immunostaining ve çekiş kuvvet mikroskobu, hücreler, hücre dışı matriks ve patojen bakteriler arasında biyomekanik etkileşimlerin nicel ölçümler için izin ile uyumludur.

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Çok güçlü O9-1 nöral kret hücreleri ve değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojeller kullanılarak in vitro mekanik sinyallerin incelenmesi için ayrıntılı adım adım protokoller burada açıklanmıştır.

Nöral Kret Hücrelerindeki Mekanik Sinyalleri İncelemek İçin Optimize Edilmiş Bir O9-1/Hydrogel Sistemi

Bu protokol, mekanik ve biyokimyasal ipuçlarının, ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip hidrojellerin yüksek verimli fotoçapraz bağlanmasını kolaylaştıran özel yapım bir UV aydınlatma cihazı kullanarak, 3D matris-mimetik kültürlerde hasta kaynaklı glioblastoma hücrelerinin kemoterapötik yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneysel bir platform tanımlamaktadır.

Hidrojel dizileri, 3D Tümör Modellerinde Matris Bileşenlerinin ve Terapötiklerin Tarama Etkileri için Artan Verim Sağlar

Bu protokol, mikroenjeksiyon ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanımı...

Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

Biz, sentetik hidrojeller içinde hücreler 3 boyutlu (3D) kapsülleme için protokolleri mevcut. Kapsülleme işlemi kapsüllü hücre davranışlarını değerlendirmek için iki yaygın olarak kullanılan çapraz bağlanma yöntemleri (michael-tipi hafif başlatılan ek ve serbest radikal mekanizmaları) yanı sıra bir dizi teknik özetlenmiştir.

Doku Mühendisliği 3D Hidrojeller Hücresel Kapsülleme

Keşfedin poliakrilamid hidrojeller kullanarak substrat rijitliğinin hücre davranışları üzerindeki etkilerini. İmmünofloresan mikroskopi, gerçek zamanlı kantitatif PCR ve western blotting teknikleriyle hücre morfolojisi ve gen ekspresyonu analiz edilir.

Matrix Rijitlik Akrilamid tabanlı Hidrojeller kullanarak Hücresel Fonksiyon Üzerindeki Etkilerinin incelenmesi

Daha fazla video keşfet