Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, hücre mikroçevresinin çeşitli parametrelerini bağımsız olarak kontrol edebilmek amacıyla, herhangi bir ilgi çekici proteini poliakrilamid hidrojeller üzerine immobilize etmek için basit ve etkili bir strateji geliştirmektir. Bu işlem, öncelikle protein solüsyonunun PDMS damga yüzeyine yayılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, PDMS damganın yapılandırılmış yüzeyinin yüksek saflıkta azot gazının sabit akışıyla dikkatlice kurutulmasıdır.

Ardından, protein kaplı damga, yapılandırılmış yüzeyi kurutulmuş hidrojel yüzeyine temas edecek şekilde yerleştirilir ve damga mikro yapıları ile hidrojel yüzeyi arasında iyi bir temas sağlamak için PDMS damganın üst kısmına kısa süreli basınç noktaları uygulanır; son adım ise PDMS damganın hidrojel yüzeyinden nazikçe kaldırılması ve baskısız bölgelerin temizlenmesinden sonra damganın temizlenmesidir. BSA ile hücreler, mikro desenli hidrojel yüzeyine yerleştirilebilir. Son olarak, protein mikro yapılarını gözlemlemek için ters floresan mikroskop kullanılır.

Bu yöntem, hücre dışı matris özelliklerinin (örneğin sertlik, hücre ligand yoğunluğu veya protein yapısı) göreceli katkısı gibi mekanotransdüksiyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ano-transdüksiyon sürecinde, bu prosedürün bir kimyasal çeker ocak içerisinde gerçekleştirilmesi önerilir. İşleme, 25 milimetre çapındaki dairesel cam lamelleri bir Petri kabına yerleştirip üzerlerine 0,1 molar sodyum hidroksit çözeltisi sürerek beş dakika bekleyerek başlayın.

Sodyum hidroksit çözeltisini uzaklaştırın ve lamel kapaklarını steril DD H2O içine tamamen daldırın; bir sallama platformu üzerinde 20 dakika boyunca nazikçe sallayın, steril DD H2O'yu süzün, lamel kapaklarını tamamen daldırmak için daha fazla steril DD H2O ekleyin ve 20 dakika daha nazikçe sallayın. Lamel kapaklarını steril penslerle alın ve yeni bir Petri kabına yerleştirin. Aktive edilmiş tarafı yukarı bakacak şekilde lamel kapaklarını, yüksek saflıkta azot gazının sabit akışıyla kurulayın.

Lameller kuruduktan sonra, onları tekrar steril kültür kabinine alın ve her lamelin aktive edilmiş tarafına ince bir tabaka trimethyl propyl acrl sürün. Bir saat boyunca bekletin. Cam lamelleri steril DD H2O ile iyice yıkayın.

Ardından, lamelleri yeni bir Petri kabındaki steril DD H2O içine daldırın. Petri kabını parafilm ile kapatın ve hafif ajitasyon altında 10 dakika boyunca bir sallayıcı platforma yerleştirin. Son olarak, lamelleri DDH2O'dan yeni bir Petri kabına aktarmak için ince uçlu steril pensler kullanın.

Aktive edilmiş yüzey yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Lamel üzerine toz yapışmasını önlemek için kabı alüminyum folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında, kuru bir yerde saklayın. Bu prosedüre başlamak için beş mililitre steril hidroksi poliakrilamid hidrojel çözeltisi ve 100 µL taze %10 amonyum persülfat çözeltisi hazırlayın.

Protokol metninde açıklandığı üzere, hidroksi poliakrilamid hidrojel çözeltisine 2.5 µL tetrametilen diamini ve 25 µL amonyum persülfat çözeltisini ekleyin. Polimerizasyonu başlatmak için, steril bir çeker ocak altında steril koşullarda, kabarcık oluşumuna izin vermeden çözeltiyi üç kez ardışık pipetleme yaparak karıştırın; hidroksi poliakrilamid hidrojel çözeltisinden 25 µL'lik bir damlayı 25 mm'lik dairesel bir lamel üzerine yerleştirin ve hidroksi poliakrilamid hidrojel çözeltisini sıkıştırmak için damlanın üzerine hemen 22 mm'lik dairesel bir cam lamel yerleştirin. 22 mm'lik cam lamel, daha önce bir UV ozon temizleyicide yedi dakika boyunca bekletilerek aktive edilmiştir.

Cam lamelle'i steril cımbızla ortalayın ve oluşan hava kabarcıklarını giderin. Hidroksi poliakrilamid hidrojelin oda sıcaklığında 15 dakika boyunca polimerize olmasına izin verin. Tüpte kalan hidroksi poliakrilamid hidrojel çözeltisini manuel olarak ters çevirin.

Polimerizasyon sürecinin tamamlanmasını takip etmek için, lamelleri steril dH₂O ile tamamen daldırın. Bir jilet ucunun kenarını 22 mm'lik cam lamel ile hidroksil poliakrilamid hidrojeli tabakası arasına yerleştirerek 22 mm'lik cam lameli dikkatlice ayırın. Hidroksil poliakrilamid hidrojeli steril PBS ile üç kez yıkayın ve hidrasyonu korumak için jeli steril PBS içinde tamamen daldırılmış halde bırakın.

Bu prosedürde kullanılan polidimetilsiloksan veya PDMS mikro damgalar, metin protokolünde açıklandığı şekilde hazırlanmıştır. PDMS mikro damgaları %50'lik bir etanol-su çözeltisine yerleştirin ve 15 dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Damgaları azot akışı ile kurutun ve desenleri yukarı bakacak şekilde yedi dakika boyunca bir UV ozon temizleyiciye yerleştirin.

Steril bir kabin altında, istenilen protein çözeltisinden 150 µL'lik bir damla A-P-D-M-S'nin mikro yapılandırılmış yüzeyine yerleştirin. Bu gösterimde Stamp FI nin kullanılmıştır. Protein çözeltisini, steril bir pipet ucuyla damganın her köşesine doğru hareket ettirerek damga yüzeyine yayın.

Protein solüsyonunun PDMS damga üzerine emilmesi için 60 dakika bekleyin. Protein hasarını önlemek için bu steril kabin altındaki lambaları kapatın. Ardından, hidroksi poliakrilamid hidrojeli ile kaplanmış lamelleri yeni bir Petri kabına aktarın.

Steril koşullar altında, düşük azot akımı kullanarak hidroksi poliakrilamid hidrojel altlıklarının yüzeyindeki fazla PBS'yi uzaklaştırın. Jel yüzeyinde durgun su izi gözlemlenmediği anda prosedürü durdurun.

Jel bu aşamada tamamen kurutulmamalıdır. PDMS damganın yapılandırılmış yüzeyi, yüksek saflıkta azot gazının sabit akışı ile dikkatlice kurutun. Protein kaplı damgayı pansuman pensi ile tutun ve yapılandırılmış yüzeyi kurutulmuş hidrojel yüzeyi ile temas ettirin.

Damga mikro yapıları ile hidrojel yüzeyi arasında iyi bir temas sağlandığından emin olmak için cımbız ucuyla PDMS damganın üst kısmına kısa süreli basınç noktaları uygulayın; PDMS damgayı oda sıcaklığında bir saat boyunca hidrojel yüzeyinde bırakın. PDMS damgayı, giydirme doku pensi ile hidroksi poliakrilamid hidrojelden nazikçe kaldırın ve damgayı 15 dakika boyunca etanol-su çözeltisi içinde bekleterek temizleyin. Damgalanmış hidroksi poliakrilamid hidrojeli, steril koşullar altında, her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez PBS değiştirerek kapsamlı bir şekilde yıkayın.

Son PBS yıkamasından sonra, steril bir BSA çözeltisi ekleyin ve sarsıntılı bir platform üzerinde hafif ajitasyonla dört derece Celsius'da gece boyunca inkübe edin. Bu işlem, ertesi gün baskısız bölgelerin bloke edilmesini sağlayacaktır. Damgalanmış hidroksi poliakrilamid hidrojeli, steril koşullarda, her biri 10 dakika süren üç kez PBS değişimiyle kapsamlı bir şekilde yıkayın.

Damgalanmış hidroksi poliakrilamid hidrojeller dört santigrat derecede bir haftaya kadar saklanabilir. Sonuçlar, hidroksi poliakrilamid hidrojellerin sertliğindeki değişim ile bisakrilamid çapraz bağlayıcı miktarı arasında doğrusal bir korelasyon olduğunu göstermektedir. Üç farklı sertlikteki hidroksi poliakrilamid hidrojeller üzerine yerleştirilen laminat dikdörtgen mikro desenlerin epifloresan görüntüleri, mikro desen geometrisi ile matriks sertliğinin birbirinden bağımsız olarak ayarlanabildiğini kanıtlamaktadır. Hücre ligand yoğunluğu, PDMS damgaları inkübe etmek için kullanılan protein çözeltisinin konsantrasyonu değiştirilerek modüle edilebilir.

Burada, ardışık mikro temas baskılamalardan elde edilen iki floresan görüntü gösterilmiştir. Kırmızıda fibronectin ve yeşilde laminin şeritleri 90 derece açıyla kesişmiş; fibrin laminin ve kollajen şeritleri ise 25 kilo pascal hidroksi poliakrilamid hidrojel alt tabaka üzerine ardışık olarak mikro baskılanmıştır. Primer hücreler, homojen olarak kaplanmış ve mikro desenli hidroksi poliakrilamid hidrojel yüzeylere ekildiğinde, hücre canlılığı ekimden sonraki üç güne kadar en az %80 düzeyindeydi.

Hücrelerin sert alt katmanlarda, yumuşak alt katmanlara kıyasla daha fazla çoğaldığı da gözlemlenmiştir. Üç farklı sertlikteki hidroksi poliakrilamid hidrojeller üzerine çöktürülmüş, dikdörtgen fibronektin kaplı mikro desenlere ekildiklerinde, primer endotel hücreleri yumuşak yüzeyde düşük aktin fiber yoğunluğu ve yuvarlak bir çekirdek sergilemektedir.

Daha sert alt tabakalar üzerindeki substratlarda, aktin fiberleri daha düz ve kalındır ve çekirdek gelişiminin ardından deforme olur. Bu teknik, mekanik transdüksiyon alanındaki araştırmacıların; primer veya kök hücreler, doku düzeyi, model organizmalar, moda, demografi veya organ sistemleri gibi geniş bir hücresel sistem yelpazesinde, hücre mikroçevre parametrelerinin bireysel rollerini keşfetmelerine yol açmıştır.