Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, hücre mikro ortamının çeşitli parametrelerini bağımsız olarak kontrol etmek için poli akrilamid hidrojeller üzerinde ilgilenilen herhangi bir proteini hareketsiz hale getirmek için basit ve verimli bir strateji geliştirmektir. Bu, önce protein çözeltisinin PDMS damga yüzeyine yayılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, PDMS damgasının yapılandırılmış yüzeyini sabit bir yüksek saflıkta nitrojen gazı akışıyla dikkatlice kurutmaktır.

Daha sonra, protein kaplı damga, kurutulmuş hidrojel yüzeyi ile temas halinde yapılandırılmış bir yüzeye yerleştirilir ve damga mikro özellikleri ile hidrojel yüzeyi arasında iyi bir temas sağlamak için PDMS damgasının üstüne kısa basınç noktaları uygulanır, son adım, PDMS damgasını hidrojel yüzeyinden nazikçe çıkarmak ve baskı olmayan bölgelerin yerleştirilmesinden sonra damgayı temizlemektir. BSA ile hücreler mikro desenli hidrojel yüzeyine oturtulabilir. Sonuç olarak, protein mikro özelliklerini gözlemlemek için ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanılır.

Bu yöntem, örneğin sertlik, hücre ligon yoğunluğu veya protein doğası gibi hücre dışı matris özelliklerinin göreceli katkısı gibi mekanik transdüksiyon alanındaki kilit soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Ano işlem sürecinde, bu işlemin kimyasal çeker ocakta yapılması tavsiye edilir. 25 milimetre çapında dairesel cam kapak fişlerini bir Petri kabına yerleştirerek ve üzerlerine beş dakika boyunca 0.1 molar sodyum hidroksit çözeltisi sürerek başlayın.

Sodyum hidroksit çözeltisini çıkarın ve kapak fişlerini steril DD H2O'ya tamamen daldırın, sallanan bir plaka üzerinde 20 dakika hafifçe sallayın, steril DDH iki O'yu boşaltın, kapak fişlerini tamamen daldırmak için daha fazla steril DDH iki O ekleyin ve 20 dakika daha hafifçe sallayın. Kapak fişlerini steril cımbızla çıkarın ve yeni bir Petri kabına yerleştirin. Aktif taraf kuru olarak baktığında, kapak sabit bir yüksek saflıkta nitrojen gazı akışıyla kayar.

Kapak fişleri kuruduktan sonra, onları steril kültür başlığına geri götürün ve her bir kapağın aktif tarafına ince bir üç trimetil propil acrl tabakası sürün. Bir saat sonra bir saat kaydırın. Cam kapak kızaklarını steril DD H2O ile iyice yıkayın.

Daha sonra kapak fişlerini steril DD H2O'ya yeni bir Petri kabına daldırın. Petri kabını para film ile kapatın ve 10 dakika boyunca hafif çalkalama altında sallanan bir plaka üzerine yerleştirin. Son olarak, lamel kapakları DDH two O'dan yeni bir Petri kabına aktarmak için ince uçlu steril cımbız kullanın.

Etkinleştirilmiş yüzü yukarı bakacak şekilde. Kapak kızaklarına toz yapışmasını önlemek için kalıbı alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında kuru bir yerde saklayın. Bu işleme başlamak için, sülfat çözeltisi başına beş mililitre steril hidroksi poli akrilamid hidrojel çözeltisi ve 100 mikrolitre taze% 10 amonyum hazırlayın.

Protokol metninde açıklandığı gibi, hidroksi poli akrilamid hidrojel çözeltisine sülfat çözeltisi başına 2,5 mikrolitre tetra metilen diamin ve 25 mikrolitre amonyum ekleyin. Polimerizasyonu başlatmak için, çözeltiyi steril bir başlık altında steril koşullar altında kabarcıklar sokmadan art arda üç pipetleme ile karıştırın, 25 milimetrelik dairesel bir kapak kızağı üzerine 25 mikrolitrelik bir hidroksi poli akrilamid hidrojel çözeltisi damlatın ve hidroksi poli akrilamid hidrojel çözeltisini sıkmak için damlacığın üzerine hemen 22 milimetrelik dairesel bir cam örtü yerleştirin. 22 milimetrelik cam kapak kayması, daha önce bir UV ozon temizleyicide yedi dakikalık bir maruz bırakma ile etkinleştirildi.

Cam kapak kayışını steril cımbızla ortalayın ve kabarcıkları düzeltin. Hidroksi poli akrilamid hidrojelin oda sıcaklığında 15 dakika polimerize olmasına izin verin. Tüpte kalan hidroksi poli akrilamid hidrojel çözeltisini manuel olarak ters çevirin.

Polimerizasyon işleminin tamamlanmasını takip etmek için, lamele fişlerini steril D DH iki o ile tamamen daldırın. 22 milimetrelik cam kapak kızağı ile hidroksi poli akrilamid hidrojel tabakası arasına bir tıraş bıçağının kenarını sokarak 22 milimetrelik cam kapak kızağını dikkatlice ayırın. Hidroksi poli akrilamid hidrojeli steril PBS ile üç kez yıkayın ve hidrasyonu korumak için jeli tamamen steril PBS'ye daldırın.

Bu prosedürde kullanılan poli dimetil soane veya PDMS mikro damgaları, metin protokolünde açıklandığı gibi üretilmiştir. PDMS mikro pullarını 50 ila 50 etanol su çözeltisine yerleştirin ve 15 dakika boyunca sonikat yapın. Pulları bir nitrojen akışı buharı ile kurutun ve yedi dakika boyunca bir UV ozon temizleyiciye yerleştirin.

Steril bir başlık altında, istenen bir protein çözeltisinden 150 mikrolitrelik bir damla A-P-D-M-S'nin mikro yapılı yüzeyine yerleştirin. Bu gösteride FI nin damgası kullanılmıştır. Protein solüsyonunu steril bir pipet ucu ile damganın her bir köşesine doğru hareket ettirerek damga yüzeyine yayın.

Protein çözeltisini 60 dakika boyunca PDMS damgası üzerinde emilmesi için bırakın. Bu steril kaputun altında, protein hasarını önlemek için lambaları kapatın. Ardından, hidroksi poli akrilamid hidrojel kaplı kapak fişlerini yeni bir Petri kabına aktarın.

Steril koşullar altında düşük nitrojen akışı ile hidroksi poli akrilamid hidrojel substratlarının yüzeyinden fazla PBS'yi çıkarın. Prosedürü durdurun. Jel yüzeyinde durgun su olduğuna dair bir kanıt gözlenmez.

Jel bu aşamada iyice kurutulmamalıdır. PDMS damgasının yapılandırılmış yüzeyini sabit bir yüksek saflıkta nitrojen gazı akışıyla dikkatlice kurulayın. Protein kaplı damgayı pansuman dokusu forseps ile kavrayın ve kurutulmuş hidrojel yüzeyi ile temas edecek şekilde yapılandırılmış bir yüzey yerleştirin.

Damga mikro özellikleri ile hidrojel yüzeyi arasında iyi bir temas sağlamak için cımbızın ucu ile PDMS damgasının üstüne kısa basınç noktaları uygulayın, PDMS damgasını bir saat sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca hidrojel yüzeyinde bırakın. PDMS damgasını hidroksi poli akrilamid hidrojelden pansuman dokusu forseps ile nazikçe çıkarın ve 15 dakika boyunca bir etanol su çözeltisinde zina yaparak damgayı temizleyin. Damgalı hidroksi poli akrilamid hidrojeli, değişim başına 10 dakika boyunca steril koşullarda üç PBS değişimi ile yoğun bir şekilde yıkayın.

Son PBS yıkamasından sonra, steril bir BSA çözeltisi ekleyin ve sallanan bir plaka üzerinde hafif çalkalama altında gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Bu, ertesi gün baskı yapılmayan bölgeleri yiyecektir. Damgalı hidroksi poli akrilamid hidrojeli, değişim başına 10 dakika boyunca steril koşullarda üç PBS değişimi ile yoğun bir şekilde yıkayın.

Damgalı hidroksi poli akrilamid hidrojeller, bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklanabilir. Sonuçlar, hidroksi poli akrilamid hidrojellerin sertliğinin evrimi ile bis akrilamid çapraz bağlayıcı epi floresan miktarı arasında doğrusal bir korelasyon olduğunu göstermektedir hidroksi poli akrilamid üzerinde biriken laminat dikdörtgen mikro desenlerin görüntüleri, üç farklı sertliğe sahip hidrojeller, mikro model geometrisinin ve matris sertliğinin bağımsız olarak ayarlanmasını göstermektedir. Hücre ligandı yoğunluğu, PDMS damgalarını inkübe etmek için kullanılan protein çözeltisinin konsantrasyonu değiştirilerek modüle edilebilir.

Burada, sıralı mikro kontakt baskılardan elde edilen iki floresan görüntü gösterilmektedir. Kırmızı fibronektin ve yeşil laminin şeritleri, 90 derecede çaprazlanmış ve fibrin laminin ve kollajen şeritleri, 25 kilo pascal hidroksi poli akrilamid hidrojel substrat üzerine sırayla mikro olarak basılmıştır. Birincil hücreler homojen olarak kaplanmış ve mikro desenli hidroksi poli akrilamid hidrojel yüzeylere kaplandığında, hücre canlılığı kaplamadan üç gün sonrasına kadar en az %80 idi.

Hücrelerin yumuşak yüzeylere kıyasla sert yüzeylerde daha fazla çoğaldığı da gözlemlenmiştir. Dikdörtgen fibronektin kaplı mikro desenler üzerine kaplandığında, üç farklı sertlikte hidroksi poli akrilamid hidrojeller üzerinde biriktirilir. Primer endotel hücreleri, düşük aktin lif yoğunluğu ve yumuşak kısımda yuvarlak bir çekirdek sergiler.

Daha sert substratlar üzerindeki substratlar, aktin lifleri daha düz ve kalındır ve çekirdek gelişiminden sonra deforme olur. Bu teknik, mekanik transdüksiyon alanındaki araştırmacıların, birincil veya kök hücreler, doku seviyesi, model organizma, moda, demografik veya organ sistemleri gibi çok çeşitli hücresel sistemlerde hücre mikro ortamlarının parametrelerinin bireysel rolünü keşfetmesinin yolunu açtı.