Name: Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Öğrenin, hücre mikroçevresinin parametrelerini bağımsız olarak kontrol etmek için hidroksi-PAAm hidrojellerde protein immobilizasyonu yöntemini. Mikrocontact baskı ile mekanotransdüksiyon çalışmalarını kolaylaştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Belçika Ulusal Bilimsel Araştırma Vakfı (F.R.S.-FNRS) tarafından "MIS Konfokal Mikroskopi", "Crédit aux Chercheurs" hibeleri ve "Nanomotility FRFC projesi" (no. 2.4622.11) aracılığıyla desteklenmiştir. T.G. doktora bursu, Endüstriyel ve Tarımsal Araştırma Eğitim Vakfı (FRIA) tarafından desteklenmektedir. Yazarlar, mekanik karakterizasyon için Sylvain Desprez'e ve konfokal görüntüleme için Géraldine Circelli'ye minnetle teşekkür ederler.

1. Cam lameller Yüzey etkinleştirme <ol><li> Bir Petri kabı ve smear (önerilen kimyasal davlumbaz) 5 dakika için üzerine 0,1 M NaOH çözeltisi koyun cam dairesel lamelleri (25 mm çap). </li><li> NaOH çözüm çıkarın ve yavaşça steril bir kültürü kaputu bir sallanan plaka üzerinde sallanan ise tam 20 dakika boyunca steril GKD 2 O ile lamelleri batırmayın. </li><li> Steril GKD 2 O boşaltın ve adımı 1.2 tekrarlayın. </li><li> Steril bir cımbız ile lamelleri çıkarın ve aktif yüzü yukarıya yeni bir Petri tabağına yerleştirin. </li><li> Yüksek saflıkta bir azot gazı akışı altında sabit bir kuru lamelleri. </li><li> Bir steril kültür kaput, 1 saat boyunca lamel aktive tarafında 3-(trimetoksisilil) propil akrilat (% 92) ince bir tabaka sürün. </li><li> Yaygın steril GKD 2 O 3 yıkar cam lamelleri yıkayın ve yeni bir Petri kabındaki steril GKD 2 O bunları bırakın. </li><li> Petri kabı dokununParafilm ile ve 10 dakika için hafif ajitasyon altında olan bir kavrama plakası üzerine yerleştirin. </li><li> Ince ipuçları ile steril bir cımbız ile GKD 2 O gelen lamelleri çıkarın ve aktif yüzü yukarıya yeni bir Petri tabağına yerleştirin. </li><li> Lamelleri yapışmasını toz önlemek için alüminyum folyo ile kuru bir yerde oda sıcaklığında saklayın. </li></ol> Hidroksi-PAAm hidrojellerin 2. Hazırlık <ol><li> , 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüpü içinde N-hidroksietil akrilamid (HEA) 65 mg ağırlığında hazırlayın. Bu taze HEA solüsyonu hazırlamak için önemlidir. </li><li> HEA kadar 50 mM HEPES tamponunun 1 ml ilave edilir ve tam çözünme gerçekleşene kadar HEA bir vorteks cihazı kullanılarak karıştırın. </li><li> İstenen hidrojel sertliği ulaşmak w / HEPES akrilamid çözeltisi ve / hepes-bis-akrilamid çözeltisi içinde ağırlık (Tablo 1 e bakınız) ağırlık oranı% 2 olan gerekli hacimde% 40 ağırlık 400 ul ilave edin. 5 ml&#39;lik bir nihai hacme, 50 mM HEPES ile ayarlayın. </li><li> Bir vorteks ve Degas kullanarak çözüm karıştırınhidroksi-PAAm polimerizasyonunu önleyen solüsyonu içindeki oksijen konsantrasyonunu azaltmak için 20 dakika boyunca vakum odasındaki. </li><li> , Steril bir başlık altında, sterilize etmek için bir 0.2 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre ile degased çözelti filtre. </li><li> 7 dakika boyunca UV / ozon temizleyici dairesel cam lamelleri (22 mm çap) etkinleştirin. </li><li> % 10 amonyum persülfat (APS) çözüm 100 ul hazırlayın, bu 100 ul GKD 2 O. 10 mg APS Bu taze APS-eriyiğinin hazırlanması önemlidir. </li><li> Polimerizasyonun başlatılması için tetrametilendiamin 2.5 ul (TEMED) ile sterilize hidroksi-PAAm çözeltisi (adım 2.5) APS çözeltisi 25 ul ekle. , Steril koşullar altında, kabarcıkların giriş olmadan 3 ardışık pipettings çözeltiyi karıştırın. </li><li> , Steril bir başlık altında, 22 mm yer gl hemen (adım 1.9 temin edilebilir) ve 25 mm örtücü kısım üzerine hidroksi-PAAm çözeltisi 25 ul damla yerleştirmekdamlasının üstüne eşek lamel (adım 2.5 ile elde edilmiş) çözeltisi hidroksi-PAAm sıkmak. Steril bir cımbız ile 22 mm cam lamel merkezi ve kabarcıkları yumuşatır. </li><li> Hidroksi-PAAm hidrojeller, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında polimerize olmaya bırakın. Polimerizasyon işleminin tamamlanmasını takip Eppendorf tüpü içinde el ile geriye kalan hidroksi-PAAm çözeltisi ters çevirin. </li><li> Tam steril GKD 2 O lamelleri sokmak ve dikkatli bir şekilde 22 mm &#39;lik cam lamelleri ve hidroksi-PAAm hidrojel tabakası arasında bir traş makinesi bıçak kenarına tanıtarak 22 mm ebadındaki bir cam lamelleri ayırın. </li><li> Steril PBS ile hidroksi-PAAm hidrojeller yıkayın (PBS 3 borsalar) ve tam hidrasyon korumak için steril PBS dalmış jeller edelim. </li><li> 3 güne kadar, 4 ° C&#39;de steril PBS hidroksi-PAAm hidrojeller saklayın. </li></ol> 3. Polidimetilsiloksan (PDMS) Microstamp imalatı NOT: Bir silikon usta imalat sta önce gerekliPDMS microstamp imalat rt. Bir silikon ustanın Bu mikroimalat özel ekipman ve eğitim gerektirir taşbaskı teknikleri ile yapılabilir. Bir Nanofabrikasyona tesisi ile işbirliği silikon ana imal teşvik edilmektedir. Alternatif olarak, talep üzerine ısmarlama mikrostrüktürlü silikon ustaları fabricates bir şirkete başvurun. Bu silikon master fabrikasyon tek ihtiyacı bir kez yapılması dikkat etmek önemlidir. Gerçekten de, mikrostrüktürlü silikon ustaları elastomerik pulları elde etmek için süresiz kullanılabilir. <ol><li> Karışım PDMS ve bir 10 sertleştirme ajanı: plastik bir şişeye 1 oranında 10 dakika boyunca, bir pipet kullanılarak iyice karıştırın. </li><li> Aşama 3.1 sırasında oluşmuş hava kabarcıklarını çıkarmak için vakum altında PDMS karışım gaz çıkışına. </li><li> Bir Petri kabındaki mikrostrüktürlü silikon ustası yerleştirin ve kabarcıklar oluşturan olmadan bunun üzerine gazdan arındırılmış PDMS karışımı bir 10 mm kalınlığında bir tabaka döküm. </li><li> Bir 60 ° C &#39;de 2 saat boyunca PDMS tedavi sağlarfırın. </li><li> Bir neşter ile tozsuz bir ortamda, soyulan PDMS katman ve tüketim 1 cm 2 microstamps. </li><li> Forseps kullanarak, yer PDMS bir Petri kabındaki desen-up microstamps. </li></ol> 4. micropatterning Hidroksi-PAAm hidrojeller <ol><li> 15 dakika boyunca, bir etanol / su içinde yer PDMS microstamps (50/50) çözeltisi ve sonikasyon. </li><li> Nitrojen akışı akımı ile pul kurutun ve onları, 7 dakika boyunca UV / ozon süpürge (λ &lt;200 nm) model-up yerleştirin. </li><li> , Steril bir başlık altında, bir 1 cm&#39;lik 2 PDMS damga mikroyapılı yüzeyi üzerine arzu edilen bir protein çözeltisi (örneğin, 100 ug / ml PBS içinde laminin veya 25 ug / ml PBS içinde fibronektin) bir 150-ul damla yerleştirin. </li><li> İsteğe bağlı: hücre yoğunluğu ligand modüle protein çözeltisinin konsantrasyonu değiştirin. </li><li> Her bir köşesine doğru bir pipetle steril bir ucu ile taşıyarak damga yüzeyi boyunca protein çözeltisi yayılırdamga. </li><li> , Steril bir başlık altında 60 dakika boyunca PDMS damga adsorbe etmek için protein çözeltisi bırakın. Protein zarar görmesini önlemek için lambalarını kapatın. </li><li> , Steril bir başlık altında, bir Petri kutusu içine (adım 2.13 den temin edilebilir), hidroksi-PAAm kaplı lamelleri aktarın. </li><li> Steril koşullar altında düşük bir azot akımı ile hidroksi-PAAm alt tabakaların yüzeyine aşırı PBS çıkarın. Kısa jel yüzeyde duran su olduğuna dair bir kanıt olarak görülmektedir işlemi durdurun. Jel, bu aşamada iyice kurutulmuştur olmamalıdır. </li><li> Kuru dikkatle PDMS yapılandırılmış yüzey, yüksek saflıkta bir azot gazı akımı ile sürekli bir damga. </li><li> Pansuman doku forseps ile, protein kaplı damgası tutun ve kurutuldu hidrojel yüzeyi ile temas edecek şekilde yapılandırılmış yüzey yerleştirin. Pul microfeatures ve hidrojel yüzeyi arasında iyi bir temas sağlamak için PDMS damga üstündeki cımbız ucu ile kısa bir basınç noktaları uygulanır. </li><li> Th PDMS damga bırakınoda sıcaklığında 1 saat e hidrojel yüzeyi. </li><li> Yavaşça soyunma doku forseps ile hidroksi-PAAm hidrojellerin PDMS pulları kaldırmak ve damga temizlemek için adım 4.1 izleyin. </li><li> Değişimi başına 10 dakika boyunca PBS içerisinde, steril koşullar 3 değişimi (pH = 7.4) ile yoğun bir şekilde hidroksi-damgalı PAAm hidrojeller yıkayın. </li><li> İsteğe Bağlı Diğer ECM proteinlerinin ek Micropatterns adımlarını 4,5-4,11 izleyerek hidroksi-PAAm yüzeye eklenebilir. </li><li> Sallanan plaka üzerinde hafif ajitasyon altında 4 ° C de bir gece boyunca PBS içinde 5 mg / ml BSA içinde steril bir çözelti ile Pasif yapma basılı olmayan bölgeleri. </li><li> Değişimi başına 10 dakika boyunca PBS içerisinde, steril koşullar 3 değişimi (pH = 7.4) ile iyice yıkayın. Bu aşamada, damgalı hidroksi-PAAm hidrojeller bir haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> Micropatterned hidroksi-PAAm Hidrojeller 5. Hücre Birikimi <ol><li> Önce kaplama c 30-45 dakika boyunca hücre ortamındaki hücre lamelleri inkübearşın. </li><li> 37 ° C&#39;de steril PBS ile 75 cm 2 kültürü şişesi içinde kültürlenmiş yapışmayan hücreler yıkanır ve 10 dakika boyunca tripsin-EDTA 3 ml ya da Accutase ile çıkarınız. </li><li> G müstakil hücreleri ihtiva eden şişe içine cep hattı için önceden ısıtılmış tam büyüme ortamı uygun istenen miktarda aktarın ve x, 650 ° C&#39;de 3 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj. </li><li> Mikropipet ile süpernatantı ve 15-20,000 hücre / ml komple kültür ortamında tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 1-2 saat için nem (Kademe 5.1 de elde edilmiş), bir lamel micropatterned hücre çözeltisi 4 ml ilave edilir ve hücre yer kaplı bir lamel kültürü inkübatöründe 37 ° C&#39;de ve% 5. </li><li> Aspire hafifçe bekâr hücreleri ve kültür ortamı değiştirin. Inkübatör bağlı hücreleri dönün ve onları (hücre tipine bağlı olarak, 3-6 saat) tam olarak yayılmasına izin. </li></ol>

<ol><li>Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+route+to+functionalize+polyacrylamide+gels+for+the+independent+tuning+of+mechanotransduction+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues.</a> Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).</li>
<li>Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+investigation+reveals+distinct+roles+for+actin+cytoskeleton+and+myosin+II+activity+in+capillary+leukocyte+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking.</a> Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).</li>
<li>Atmanli, A., Domian, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+aligned+functional+myocardial+tissue+through+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing.</a> J. Vis. Exp. (73), e50288(2013).</li>
<li>Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Théodoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+microfluidic+method+to+select%2C+isolate%2C+and+manipulate+single-cells+in+mechanical+and+biochemical+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays.</a> Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).</li>
<li>Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+control+of+nuclear+confinement+identifies+a+threshold+deformation+leading+to+lamina+rupture+and+induction+of+specific+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes.</a> Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).</li>
<li>Rundqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fidelity+functional+patterns+of+an+extracellular+matrix+protein+by+electron+beam-based+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).</li>
<li>Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+generation+of+proteins+micropatterns+for+neuron+culture+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications.</a> Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).</li>
<li>Holden, M. A., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activated+patterning+of+dye-labeled+molecules+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).</li>
<li>Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-assisted+surface+chemical+patterning+for+single-cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture.</a> Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).</li>
<li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+gold+having+micrometer+to+centimeter+dimensions+can+be+formed+through+a+combination+of+stamping+with+an+elastomeric+stamp+and+an+alkanethiol+%22ink%22+followed+by+chemical+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching.</a> Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).</li>
<li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).</li>
<li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Polydimethylsiloxane+Substrates+with+Tunable+Elastic+Modulus+to+Study+Cell+Mechanobiology+in+Muscle+and+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve.</a> PLoS ONE. 7, e51499(2012).</li>
<li>Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-Phosphorylcholine+hydrogels+as+tunable+and+versatile+platforms+for+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology.</a> Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).</li>
<li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+hydroxy-PAAm+hydrogels+and+sylgard+184+silicone+elastomers+with+tunable+elastic+moduli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli.</a> Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).</li>
<li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics%3A+steps+towards+optimization+and+alternative+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses.</a> Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).</li>
<li>Hemphill, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+role+for+integrin+signaling+in+diffuse+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22899(2011).</li>
<li>Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamide+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays.</a> BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li>
<li>Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cell+growth+on+protein-functionalized+hydrogel+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).</li>
<li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li>
<li>Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+coordination+between+cell+and+nuclear+shape+within+micropatterned+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells.</a> Nat. Commun. 3, 671(2012).</li>
<li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Confinement%3A+Putting+the+squeeze+on+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus.</a> Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).</li>
<li>Trappman, B., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+sense+extracellular+matrix+stiffness%3A+a+material%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective.</a> Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Modern hücre biyolojisi, in vitro gözlemler çoğu, çoğunlukla ECM proteinleri veya RGD sekansı ihtiva eden sentetik peptitler, ince bir tabaka ile kaplanmış katı bir cam lameller üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu temel kültür alt-tabakalar hücresel süreçler üzerinde çalışılması için mekanotransdüksiyon doğru bir model sağlamaz ve böylece ECM&#39;nin bütün fizikokimyasal ve karmaşıklığını büyük ölçüde özetleyebildiğini yoktur. Bu sorunu çözmek için, biz istenilen miktarda ve ECM proteinleri doğa...

Yerel mikro-hücresel birçok yönü (örneğin, sertlik, gözenek boyutu, protein yapısı, ya da hücre-ligand yoğunluğu) böyle bir motilite, hücre proliferasyonu, farklılaşması ve gen sentezlemesi gibi hücresel işlemleri kontrol eden düzenleyici ipuçlarının çalışmalarının oluşturulması sağlar. Hücre dışı ortama fizikokimyasal özelliklerine modifikasyonları, hücreler tarafından algılanan ve hücresel polarizasyon, göç ve farklılaşma dahil olmak üzere farklı deformasyonu fizyolojik sonuçlar, sebep olabilir. Bu hücreleri hücresel biyokimyasal sinyallerin içine ECM değişiklikleri tercüme Ancak, ne kadar belirsizliğini koruyor. Bu nedenle, büyük öneme mekanotransdüksiyon yollarını incelemek için hücreler ile bunların mikro çevreleri arasındaki etkileşimleri üretebileceği in vitro mikro çevrelerinde kontrol Mühendisi etmektir. Bu sorunu çözmek için, biz son zamanlarda kolayca iki kuruş oluşturmak için, hidroksi-PAAm hidrojeller denilen yeni bir yöntem 1, girmiştikburadakilerin yumuşak bağımsız önemli mekanotransdüksiyon ipuçlarını kontrol etmek izin matrisler: matris sertlik, hücre geometrisi ve lohusalık, protein ve hücre-ligand yoğunluğunun doğası. ECM morphogens -degradeler aracılığıyla hücresel süreçleri (kemotaksisini), yapışkan proteinleri (haptotaxis) ve sertlik (durotaxis) yönlendirir. Son birkaç yıldır, in vitro platformlarda ileri hücreler fizyolojik süreçlere 2-5 içine biyokimyasal ve biyofizik özellikleri çeviremez nasıl didiklemek için bu hücre dışı ipuçlarını izole etmek için geliştirilmiştir. Elektron ışın 6, 7 fotolitografi, fotokimyasal hareketsizlik 8, ya da plazma destekli teknikleri 9 micropatterned substratlar üzerinde yaşayan hücrelerin büyümesini yönlendirmek için geliştirilmiştir. Bu teknikler önemli sonuçlar vermiştir rağmen, çoğu hücre davranışı farklı ipuçlarının bireysel etkisi arasındaki ayrımcılığa izin vermezve onlar birkaç laboratuvarları gelemez teknik olanaklar gerektirir. Bu teknikler arasında, microcontact baskı (μCP), hücre-yapışkan mikro-adalar 10 oluşturmak için sağlam ve erişilebilir bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Daha yakın zamanda, bu alanda harcanan çabaların 11-14 canlı dokularda gözlenen katılıklarının geniş yeniden üretilmesi için ayarlanabilir bükülmezliklerde hidrojel μCP geliştirilmesi için girişimlerde bulunulmuştur. Bu yapıtlar arasında, poliakrilamid (PAAm) 15 popüler hale zaten hücre biyomekanik analizleri için en yaygın olarak kullanılan polimer esaslı matrisler biridir. PAAm yüzeylerinin, N-sülfosükinimidil-6-[4&#39;-azido-2&#39;-nitrophenylamido] (sülfo-SANPAH) ve ECM proteinlerinin sülfo-SANPAH nitrofenil UV aktivasyonu ile yüzeye bağlı olan heterobifonksiyonel çapraz bağlayıcı ile işlevselleştirilen azid gruplarının 16. Bir başka teknik, ciddi bir şekilde okside edilmiş proteinlere bağlanma hidrazin oluşurperiodat ile 17. Hynd ve arkadaşları bir acroyl-streptavidin monomer 18 varlığında fotopolimerizasyonu gerektirir protein ve peptitler ile biomimetic hidrojel yüzeyleri desenlendirme için bir tekniği tanıttı. Daha yakın zamanda, Tseng ve ark. 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür ile aktif hale Pensilvanya jeller inkübe gerektiren bir optik kuvars maske aracılığıyla PAAM derin, UV&#39;ye maruz dayalı yeni bir yöntem micropatterning 19 (EDC) bildirmişlerdir ve N-hidroksisukinimid (NHS) su solüsyonları, önceki protein ekleyin. Uzun sentez yöntemleri (örneğin, diyaliz, liyofilizasyon, vb), pahalı kimyasal bileşikleri (örneğin, hiyaluronik asit, sülfo-SANPAH) ya da derin UV: homojen ve yeniden üretilebilir bir proteinler micropatterns oluşturmak için bu tekniklerin yeteneği rağmen, çoğu büyük sınırlamaları acı ışınlama. Buna ek olarak, bu teknikler, alt-tabaka sertliği mikrodesenlerle bağımsız modülasyonuna izin vermezGeometri, ECM protein yapısı ve hücre-ligand yoğunluğu. Dikkate bu sınırlamaları alırsak, biz yumuşak hidrojel proteinlerin ve biyomoleküllerin çeşitli immobilizasyon sağlar ve hücresel fonksiyonlarda rollerini deşifre etmek için mekanotransdüksiyon ipuçlarının bağımsız ayar veren bir roman ve basit akrilamid-temelli bir yaklaşım geliştirdik. Bunun yerine sert kimyasal bileşikler ile tedavi edilmesi için PAAm hidrojeller, biz PAAm polimerizasyon sırasında hidroksil grupları ile ticari bir akrilamid getirmektedir. Bu basit işlem herhangi diğer teknik gereksinimleri olmadan PAAm hidrojellerin içsel anti-yapışkan özelliği üstesinden gelir. Hidroksil gruplarının varlığı hidrojen bağı etkileşimlerini oluşturan proteinler ve biyomoleküllerin hidroksi-PAAm hidrojellerin yüksek afinite yol açar. ΜCP ile birlikte, hidroksi-PAAm hidrojeller bağımsız kontrolü olan iki boyutlu bir kültür platformunun hızlı bir üretimini mümkün kılmakmekanotransdüksiyonu eğitimi için güçlü bir platform olması öngörülen matriks katılık, ECM proteinleri türü, hücre-ligand yoğunluğu ve sınırlı yapışabilmede, üzerinde. Bu protokolün amacı, kolaylıkla malzeme bilimleri herhangi uzmanlığı olmadan hidroksi-PAAm hidrojeller yapmak için gerekli bilgileri sağlamaktır. Araştırmacılar patofizyolojik mekanizmaları içinde yer mekanotransdüksiyon yollarının daha iyi anlaşılmasına yol açabilir hücresel ve doku düzeyinde fizyolojik ilgili soru sormak için nihai hedefi bir araç sağlamaktır.

<table><tbody><tr><td>UV/Ozon Fotoreaktör</td><td>Ultraviyole Ürünler</td><td>Model PR-100</td><td></td></tr><tr><td>Sallanan plaka</td><td>IKAcWerke</td><td>Model KS 130 Temel</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Bilimsel Endüstriler</td><td>Modeli Vortex Genie2</td><td></td></tr><tr><td>Vakumlu gaz giderme odası</td><td>Uygulamalı Vakum Mühendisliği</td><td>DP- 8-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>İnce uçlu paslanmaz çelik forseps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z225304-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Pansuman doku forseps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4392-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Polistirende Petri kapları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum folyo, kalınlık 0.5&nbsp; mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>266574-3.4G</td><td></td></tr><tr><td>İzogor membran filtre (0.2 & mikro; m gözenek boyutu)</td><td>Millipore</td><td>GTTP Filtre kodu</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak cam lamel (22 mm çap)</td><td>Neuvitro</td><td>GG-22</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak cam lamel (25 mm çap)</td><td>Neuvitro</td><td>GG-25</td><td></td></tr><tr><td>Değişken hacimli mikropipet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z114820</td><td></td></tr><tr><td>Protein mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Neşter kolları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2896-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Neşter bıçakları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2771-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişeleri (75 cm2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik banyo tepsisi, katı (paslanmaz çelik)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z613983-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 silikon elastomer kiti</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid (toz)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td></td></tr><tr><td>N, N'-Metilenbis (akrilamid)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>N-Hidroksietilaklamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>697931</td><td></td></tr><tr><td>N, N, N', N'-Tetrametiletilendiamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum PerSülfat (APS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>3- (Trimetoksisilil) propilen akrilat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Plazma Fibronektin</td><td>Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>EHS'den Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-25G</td><td></td></tr><tr><td>Çift damıtılmış su (ddH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endotel hücre büyüme ortamı</td><td>Hücre Uygulamaları</td><td>211K-500</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Göbek Veni Endotel Hücreleri (HUVEC)</td><td>Invitrogen</td><td>C-003-5C</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA laboratuvarları</td><td>L11-007</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tampon çözeltisi 1 M H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotikler-antimikotikler</td><td>PAA laboratuvarları</td><td>P11-002</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Tuzlu su çözeltisi</td><td>PAA laboratuvarları</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phaloidin</td><td>Moleküler Problar</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Farede üretilen anti-vinculin antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare antikor-tetrametilrodamin</td><td>Moleküler Problar</td><td>T-2762</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fibronektin (tavşan)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F3648</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41469</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Laminin antikoru (tavşan)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tavşan IgG-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7512</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Mutlak etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-2.5L</td><td></td></tr></tbody></table>

mechanotransduction cues etkileri ayırma için hidroksi-paam hidrojeller hazırlanması

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Şimdi de, hücresel işlevleri, hücre dışı matris (ECM), çevre fizikokimyasal ve mekanik hissi veren hücre etkileşimleri düzenlenir olduğu saptanmıştır. Ökaryotik hücreler sürekli biyokimyasal sinyallerin içine ECM fiziksel değişiklikler transdüksivonu için yüzey mechanosensors yoluyla kendi yerel mikroortam duygusu ve gen ifadesi belirli değişiklikleri gerçekleştirmek için bu sinyalleri entegre. İlginç bir şekilde, birbirleriyle ECM kutu çift fizikokimyasal ve mekanik belirleyici değerleri saptanmış, hücre kaderine düzenler. Bu nedenle, mekanotransdüksiyonu anlamak için bir anahtar hücresel fonksiyonları ECM ipuçlarının göreceli katkısını decouple etmektir. Burada hızlı ve kolay bir in vitro mekanotransdüksiyon ipuçlarının bağımsız ayarlama için biyolojik ilgili hidrojeller oluşturmak için detaylı bir deneysel protokol mevcut. Biz kimyasal olarak modifiye poliakrilamid hidrojeller (PAAm) kendi özünde olmayan ADHES aşmak içinPolimerizasyon sırasında Hidroksil-fonksiyonu akrilamid monomerleri içeren göre özellikleri ive. Bu ECM proteinleri arzu edilen herhangi bir doğada hareketsizleştirilmesine olanak hidroksi-PAAm olarak adlandırılan yeni bir PAAm hidrojel, elde edilmiştir. Microcontact baskı bağımsız olarak, tek-hücre morfolojisi, matris sertlik, doğası ve ECM proteinlerinin yoğunluğunu kontrol etmek için kullanılmasına olanak hidroksi-PAAM kombinasyonu hidrojellerinin. Bu in vitro hücre mekanotransdüksiyon işlemlerinde incelemek için her biyoloji laboratuarda ayarlanabilir basit ve hızlı bir yöntem sağlar. Biz ECM sertlik ve çekirdeği arasındaki mekanik bir bağlantıya göstermek endotel hücreleri üzerinde deneyler yaparak bu romanına iki boyutlu bir platform doğrulamak.

Şekil 1A ile akrilamidin kopolimerleştirme (akrilamid) ve bisakrilamid (bis-akrilamid), N-sunulur hydroxyethylacrylamide gömülü hidroksil grupları ile rastgele radikal polimerizasyonu ile poliakrilamid, su-teşekkül eden bir primer hidroksil ihtiva eden (HEA) monomerler, (hidroksi-PAAm) . Bu protokol, HEA bir ağırlık 65 mg HEPES 1 ml&#39;lik bir hacim içinde seyreltilmelidir. HEA yoğunluğu birine kabaca eşit olduğunu bilerek, biz 1.065 ul (HEA + HEPES) bir çalışma hacmi elde varsayalım. Tablo 1 &...

Biz minimum maliyetle veya uzmanlık ECM proteinlerinin doğrudan bağlanma sağlar hidroksi-PAAm adında yeni bir poliakrilamid hidrojel, sunuyoruz. Microcontact baskı hücresel mechanostransduction eğitim için doğal hücre mikroçevresinin birçok ipuçlarının bağımsız kontrolünü kolaylaştırır ile hidroksi-PAAm kombinasyonu hidrojellerinin.

Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Bu prosedürün genel amacı, hücre mikroçevresinin çeşitli parametrelerini bağımsız olarak kontrol edebilmek amacıyla, herhangi bir ilgi çekici proteini poliakrilamid hidrojeller üzerine immobilize etmek için basit ve etkili bir strateji geliştirmektir. Bu işlem, öncelikle protein solüsyonunun PDMS damga yüzeyine yayılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, PDMS damganın yapılandırılmış yüzeyinin yüksek saflıkta azot gazının sabit akışıyla dikkatlice kurutulmasıdır.Ardından, protein kaplı damga, yapılandırılmış yüzeyi kurutulmuş hidrojel yüzeyine temas edecek şekilde yerleştirilir ve damga mikro yapıları ile hidrojel yüzeyi arasında iyi bir temas sağlamak için PDMS damganın üst kısmına kısa süreli basınç noktaları uygulanır; son adım ise PDMS damganın hidrojel yüzeyinden nazikçe kaldırılması ve baskısız bölgelerin temizlenmesinden sonra damganın temizlenmesidir. BSA ile hücreler, mikro desenli hidrojel yüzeyine yerleştirilebilir. Son olarak, protein mikro yapılarını gözlemlemek için ters floresan mikroskop kullanılır.Bu yöntem, hücre dışı matris özelliklerinin (örneğin sertlik, hücre ligand yoğunluğu veya protein yapısı) göreceli katkısı gibi mekanotransdüksiyon alanındaki temel sorul

preparation-hydroxy-paam-hydrogels-for-decoupling-effects

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hücresel fonksiyonları katmanlarından sertlik etkisi modellenmiş...

Matrix Rijitlik Akrilamid tabanlı Hidrojeller kullanarak Hücresel Fonksiyon Üzerindeki Etkilerinin incelenmesi

Bu videoda, hücre dışı matris sertliğine bağlı Listeria monocytogenes'in endotel hücreleri yoluyla yayılımını değerlendirmek için kantitatif hızlandırılmış mikroskopi gösterilmektedir. Daha yumuşak bir hidrojel, daha sert muadillerine kıyasla endotel hücreleri yoluyla daha hızlı bakteri yayılımını kolaylaştırır ve matris sertliğinin bakteri yayılımı üzerindeki etkisini vurgular.

Hücre Dışı Matriks Sertliğine Bağlı Bakteri Yayılımını Değerlendirmek için Kantitatif Hızlandırılmış Mikroskopi

Burada, poliakrilamid jellerin çok kuyulu plaka formatında hızlı, verimli ve ucuz bir şekilde hazırlanmasını sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından kolayca benimsenebilir. Sertliğe bağlı hücre tepkilerini anlamaya odaklanan araştırmalarda özellikle yararlı olacaktır.

Basit Poliakrilamid-tabanlı Sertlik bağımlı Hücre Yanıtların Çalışmaları multiwell Sertlik Deneyi

Bu yöntemde, photopolymerization kullanıyoruz ve polietilen glikol (PEG) hydrogels, sağlayan yüzeyinde protein veya peptid desen oluşturmak için tıklatın kimya teknikleri biyoaktif sinyaller hücresel yanıt vitro incelenmesi için immobilize .

Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

Bakteriyel enfeksiyon yapisan hücre hücre dışı matriks sertlik etkisi problama için çok iyi biçim polyacrylamide tabanlı tahlil geliştirdik. Bu tahlil akış sitometresi, immunostaining ve çekiş kuvvet mikroskobu, hücreler, hücre dışı matriks ve patojen bakteriler arasında biyomekanik etkileşimlerin nicel ölçümler için izin ile uyumludur.

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Burada, bir protokol Kapsüllenen ve bir fluorogenic matriks metalloproteinaz (MMP) functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels hücrelerde kültür sunulan-parçalanabilir peptid. Hücresel MMP ve metabolik aktivite doğrudan bir standart Mikroplaka Okuyucu kullanarak hidrojel kültürler ölçülür.

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Burada, connexin 43 arasındaki boşluk kavşağını bozacak ve bunun endotel biyomekaniği üzerindeki etkisini çekişler ve hücreler arası gerilimlerin gözlemi yoluyla ölçmek için mekanik tabanlı bir protokol salıyoruz.

Connexin 43 Yapısal Bozulma ile Perturbing Endotel Biyomekanik

Çok güçlü O9-1 nöral kret hücreleri ve değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojeller kullanılarak in vitro mekanik sinyallerin incelenmesi için ayrıntılı adım adım protokoller burada açıklanmıştır.

Nöral Kret Hücrelerindeki Mekanik Sinyalleri İncelemek İçin Optimize Edilmiş Bir O9-1/Hydrogel Sistemi

UV'ye yakın litografi ve çekiş kuvveti mikroskopisi, mikropatterned hidrojeller üzerindeki hücresel kuvvetleri ölçmek için birleştirilir. Tek hücrelerin hedeflenen ışık kaynaklı salınımı, aynı numune üzerinde yüksek sayıda ölçüm sağlar.

Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü

Burada, epitel dokusu homeostazının elektromekanik regülasyonunu incelemek için benzersiz bir iki katmanlı mikroakışkan cihaz üretmek için bir protokol sunuyoruz. Cihaz, doku düzlemine dik olarak statik fizyolojik elektrik akımları uygulayarak hücre-hücre yapışmasını, çoğalmasını ve ekstrüzyonunu etkiler. Canlı hücre görüntüleme ve mekanik stres ölçümleri, bu süreçlerin mekanizmalarını ortaya çıkarır.

İki katmanlı mikroakışkan cihaz kullanarak doku homeostazının elektromekanik kontrolünün ortaya çıkarılması

Öğrenin, hücre mikroçevresinin parametrelerini bağımsız olarak kontrol etmek için hidroksi-PAAm hidrojellerde protein immobilizasyonu yöntemini. Mikrocontact baskı ile mekanotransdüksiyon çalışmalarını kolaylaştırın.

Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

Daha fazla video keşfet