İfade, Deterjan çözünürleştirme ve Membran Transporter, MexB ilaca Direnç Protein Saflaştırılması

Mex B membran proteinini saflaştırmak için, öncelikle rekombinant DNA yöntemleri kullanılarak Mex B'nin e coli'de eksprese edilmesi sağlanır. Ardından membranlar izole edilir ve membran proteinleri hafif bir deterjanla çözünür hale getirilir. Çözünür hale getirilen membran proteini iMac ile saflaştırılır ve protein daha sonra jel filtrasyon kromatografisi ile ileri düzeyde saflaştırılır.

Proteinin saflaştırma düzeyi SDS poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak belirlenir. Bu prosedür çoklu ilaç direnci transmembran taşıyıcıları hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer membran proteinlerine de uygulanabilir; bugünkü prosedürler laboratuvarımdan bir lisansüstü öğrencisi tarafından gerçekleştirilecektir. Bu prosedür için, Pseudomonas aeruginosa'dan alınan Mex B, Mex B'nin C-terminali altı-histidin etiketiyle eksprese edilmesi için PET 30 B plus ekspresyon vektörüne subklonlanacaktır. Akşam saatlerinde, taze transformantlar veya dondurulmuş stok kullanarak dört adet 3 mL LB kanamisin kültürünü inoküle ederek başlayın ve kültürleri bir silindir üzerinde 37 °C'de gece boyunca büyütün.

150 mililitre, mililitre başına 30 mikrogram Kanamisin içeren LB'yi inoküle etmek için gece boyu büyütülen kültürleri kullanın. Kültürü öğleden sonra 37 °C'de çalkalayıcıda büyütün. Küçük kültürü, mililitre başına 30 mikrogram içeren altı adet bir litrelik 2XYT besiyerini inoküle etmek için kullanın.

Kanマイsin'i Erlen flasklara ekleyin. 1:40 dilüsyonu için kültür başına 25 mililitre kullanın. Kültürleri, optik yoğunluğa ulaşana kadar 37 derece Celsius'ta büyütün.

0,4 ile 0,6 arası OD600 değerine ulaşana kadar yaklaşık 1,5 saat bekleyin. Kültürler uygun yoğunluğa ulaştığında, 0,5 mililitre bir molar IPTG ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin. Tüm erlenleri tekrar çalkalayıcıya yerleştirin ve bakterileri ertesi sabah hasat edene kadar gece boyunca 30 °C'de büyütmeye devam edin.

Kültürleri çalkalayıcıdan çıkarın ve soğutun. Ardından hücreleri toplamak için kültürleri santrifüj tüplerine aktarın ve hücreler santrifüj edilirken büyük ölçekli bir santrifüjde 4 °C'de 30 dakika boyunca 5.000 rpm hızda santrifüj edin. 100 mL hücre resüspansiyon tamponuna DNAs proteaz inhibitörleri ve lizozim ekleyin.

Ayrıca, bu tabloda gösterildiği gibi iki porsiyon membran Resus süspansiyon Tamponu'nu proteaz inhibitörleri ile takviye edin. Santrifüj işlemi tamamlandığında üç çözeltinin tamamını buz üzerinde tutun. Hücre peletlerini 100 milliliters hücre resus süspansiyon Tamponu içinde yeniden süspanse edin.

Ardından, hücreleri ekstrakte edin. Hücre süspansiyonu French basınç hücresine yüklenir ve hücre French presine yerleştirilir. Basınç, 12, 000 pounds per square inch değerine ulaşana kadar uygulanır.

Kırılan hücrelerin yavaşça akması için vana çok az miktarda açılır. Hücrelerin fışkırarak çıkmasına neden olacak kadar vanayı fazla açmamak önemlidir; aksi takdirde hücreler çok düşük bir basınçla salınacak ve etkili bir şekilde parçalanmayacaktır. Hücre lizatını, buz üzerinde soğuk tutulan bir şişeye toplayın.

Hücre çözeltisini 12,000 pounds per square inch basınçta tekrar bir French basınç hücresinden geçirin. Hücre lizatını SS 34 santrifüj tüplerine aktarın ve hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için SS 34 rotorunda, dört derece Celsius'ta, 10,000 rotations per minute hızda 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Sırada berraklaştırılmış lizat bulunmaktadır.

Membran fraksiyonunu hazırlamak için kullanılır. Süpernatanı dikkatlice ti. 6 4, 7 0.5 ultra santrifüj tüplerine aktarın, TI 6 4 7 0.5 rotorunda, dört derece santigrat sıcaklıkta, dakikada 40,000 devir ile 50 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı atın. Bir pipet kullanarak, hücre membranlarını içeren peleti yaklaşık 25 mililitre membran Resus süspansiyon tamponu içerisinde nazikçe yeniden süspande edin; membran süspansiyonunu temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve TI I 6 4 7 0.5 rotorunda, 4 °C'de, 50 dakika boyunca dakikada 40.000 devir hızında tekrar santrifüjleyin ve yıkanmış membran peletini 25 mililitre membran Resus süspansiyon tamponu içerisinde yeniden süspande edin. Ardından, yeniden süspande edilen membranlardaki membran proteinlerini yaklaşık 25 mililitre ile solubilize edin.

Final deterjan konsantrasyonu %2 DDM olacak şekilde altı mililitre %10 DDM ekleyin; karışımı dört derece santigrat sıcaklıkta iki saat boyunca sallayın. DDM varlığındaki iki saatlik inkübasyondan sonra, çözünür protein deterjan komplekslerini çözünmeyen proteinlerden ayırmak için karışımı TI I 6 4 7 0.5 rotorunda, dört derece santigrat sıcaklıkta, 40.000 devir/dakika hızla 40 dakika boyunca santrifüj edin. Mex B protein deterjan komplekslerini içeren süpernatantı, saflaştırmada kullanmak üzere saklayın. Mex B protein deterjan komplekslerini içeren süpernatantı, Resus süspansiyon tamponu ile dengelenmiş iki mililitre iyon metal afinite boncuğu ile karıştırın. Proteinlerin reçineye bağlanmasının ardından, bir dönerle dört derece santigrat sıcaklıkta bir saat boyunca inkübe edin.

Süspansiyonu yer çekimi akışlı bir kolon gövdesine boşaltın ve dışarı akan sıvıyı atın. Kolonun yıkanması tamamlandığında, kolonu 20 mililitre veya 10 kolon hacmi iMac bağlama ve yıkama tamponu ile yıkayın. Bağlı proteinleri 10 mililitre iMac elüsyon tamponu ile elüe edin.

Her bir elüsyon fraksiyonundan 10 µL örnek alın. Bu örnekleri 10 µL iki katı SDS örnek tamponu ile karıştırın ve %10'luk poliakrilamid SDS jelinde analiz edin.

Her bir fraksiyondaki mex B miktarını ve saflığını tahmin edin. Mex B protein deterjan komplekslerini içeren fraksiyonları alın ve bunları dört derece santigrat sıcaklıkta bir santrifüj konsantratörle konsantre edin. Bu adımda proteinin çökelmemesine dikkat edin.

Çökelme olup olmadığını gözlemlemek için birkaç kez kısa santrifüj uygulayın. Her santrifüjden sonra, havuzlanmış fraksiyonları bir jel filtrasyon kolonu kullanarak saflaştırma işlemine geçin. Bir super rose 12 HL 30 over 10 kolonunu 24 milliliters running buffer ile ön dengelemeye tabi tutun ve baz hattının düzleşmesini bekleyin.

Ardından, aktör sistem yükleme döngüsünü akan tamponla durulayın. Proteini kolona uygulamadan önce, protein çözeltisini bir şırınga filtresi kullanarak süzün. Daha sonra, mililitre başına beş miligrama kadar protein içeren protein çözeltisinden 240 µL'ye kadar kolona yükleyin.

Sütun hacminin 1,5 katı kadar tampon çözelti geçirin ve 0,25 mililitrelik fraksiyonlar toplayın. XB protein deterjan kompleksleri, yaklaşık 10 ila 15 mililitrelik elüsyon hacminde bir pik olarak elüe olur. Pik fraksiyonlarından beş mikrolitrelik numuneler alın.

Her örneği, iki kat derişimli SDS örnek tamponu ile bire bir oranda karıştırın. Her fraksiyondaki Mex B miktarını ve saflığını tahmin etmek için örnekleri %10'luk poliakrilamid jel üzerinde analiz edin ve saf Mex B içeren fraksiyonları ayırın. Bu poliakrilamid jele, iMac kolonundan ayrıştırılan fraksiyonlar ve jel filtrasyon kolonundan elde edilen bireysel fraksiyonlar yüklendi. Jel filtrasyon kolonundan sonra, protein Coomassie ile boyanmış poliakrilamid jelde saf görünmektedir.

Jel filtrasyon kolonundan alınan bir iz, kolondan elüye olan protein deterjan kompleksinin ana pikini göstermektedir. mxb proteininin ortalama verimi, altı litre 2 XYT kültür başına yaklaşık iki miligramdır. Uzmanlaşıldığında, bu prosedür uygun şekilde yürütülürse sekiz saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir membran proteininin nasıl eksprese edileceği, çözüleceği ve saflaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.