Name: İfade, Deterjan çözünürleştirme ve Membran Transporter, MexB ilaca Direnç Protein Saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Öğrenin, MexB membran proteininin ifadesini, deterjan çözünürleştirmesini ve saflaştırılmasını. Pseudomonas aeruginosa çoklu ilaç direnci taşıyıcısını E. coli'de rekombinant DNA yöntemleriyle çalışın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje, Ulusal Bilim Vakfı ve Biyomoleküler Bilimler Derneği CJJ hibe tarafından desteklenen oldu.

1. 1. Gün: Pseudomonas aeruginosa MexB pFB101 kodlanır. P. MexB geni amplifiye edildi aeruginosa genomik DNA ve NdeI ve XhoI kısıtlama siteleri pET30b + vektör eklenir. Bir yapı, bir C-terminal hexahistidine etiketi içerir. <ol><li> Plazmid E. dönüştürmek için kullanılır. coli C43 (de3) 12 suşu ve 30 ug / ml kanamisin içeren LB agar transformants kaplanmıştır. </li></ol> 2. 2. Gün: Gecelik Kültürler: <ol start="2"><li> Akşam, 30 ug / ml kanamisin içeren 4 x 3 ml LB kültürleri taze transformant koloniler inoküle. Alternatif olarak, donmuş bir perma kültürleri inoküle olabilir. Bu küçük kültürleri ° C gecede 37 rulo yetiştirilmektedir. </li></ol> 3. 3. Gün: 6 Litre Kültürler Büyüyen: <ol start="3"><li> Sabah, 30 ug / ml kanamisin içeren 150 ml LB aşılamak için gecelik kültürler kullanın. 37 ° C üzerinde bir çalkalayıcı kültür büyütün. </li><li> Öğleden sonra, 6 x 30 ug / ml kanamisin FERNBACH şişeler içeren 1L 2XYT medya aşılamak için küçük bir kültür kullanın. (01:40 seyreltme başına 25 ml kültür kullanın). 37 ° kültürler büyütün ° C, 1,5 saat, 0.4-0.6 bir OD 600 ulaşana kadar </li><li> Kültürler uygun yoğunluğa ulaştığında, 0.5 ml 1M IPTG ekleyerek protein ekspresyonu neden olur. Çalkalayıcı tüm şişeler geri koyun ve 30 ° C gece büyümeye devam ediyor. </li></ol> 4. 4. Gün: Hücreler Hasat ve Protein Arındırıcı: <ol start="6"><li> Tampon çözeltiler aşağıdaki gibi proteaz inhibitörleri, DNAz ve lizozim: 50 ml hücre tabanda tampon, 10 mg DNaseI (0.1 mg / ml son konsantrasyon), lizozim, EDTA-1 Komple proteaz inhibitörü tablet ve bir tutam ekleyin . Membran tabanda tampon 60 ml, 1 proteaz inhibitörü tablet ekleyin. Membran tabanda tampon başka bir 50 ml, 1 proteaz inhibitörü tablet ekleyin. Buz üzerinde her üç çözüm tutun. </li><li> Kültürler hücrelerin hasat büyük ölçekli santrifüj 30 dakika 5.000 rpm santrifüjleyin. </li><li> 100 ml hücre tabanda tamponu (50 mM lizozim NaP, pH 7.0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 Komple EDTA-proteaz inhibitörü tablet, 0.1 mg / ml DNAz I, çimdik) hücrelerin yeniden süspanse </li><li> 12.000 psi (762 gösterge basıncı) bir Fransız basınç hücresi ile iki kez hücre çözümü iletin. Bir şişe içinde hücre lizat toplayın buz soğuk tuttu. </li><li> SS34 santrifüj tüplerine hücre lizat transferi ve 10.000 rpm'de 30 dakika süreyle, 4 hücre enkaz kaldırmak için santrifüj ° C SS-34 rotor. </li><li> Süpernatantı Ti647.5 ultrasantrifüjdeki tüpler içine dikkatlice çıkarın. 4C az 40.000 rpm de 50 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın. </li><li> Yaklaşık, hücre zarları içeren pelet, tekrar Membran tabanda tampon 25 ml (50 NaP mM, pH 7.0, 300 mM NaCl,% 5 gliserol, 1 Komple EDTA-proteaz inhibitörü tablet). </li><li> 4 50 dakika için bir Ti647.5 rotor 40.000 rpm temiz bir santrifüj tüpüne ve santrifüj membran süspansiyon transfer ° C </li><li> Süpernatantı atın ve 25 ml membran tabanda tampon yıkanmış membran pelet (50 NaP mM, pH 7.0, 300 mM NaCl,% 5 gliserol, 1 Komple EDTA-proteaz inhibitörü tablet) tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> 5. TM Protein Solublization: <ol start="15"><li> Yeniden süspanse membranlar (yaklaşık 25 ml), 6 mL% 10 DDM (son deterjan konsantrasyonu = 2% DDM) Rock karışımı 4 ° C'de 2 saat. </li><li> 4 en az 40 dakika 40.000 rpm'de karışımı Santrifüj ° C çözünmez proteinler çözünür protein deterjan kompleksleri ayrı Ti647.5 rotor. MexB protein deterjan kompleksleri içeren süpernatant kaydedin. </li></ol> 6. IMAC: <ol start="17"><li> Tabanda tampon dengelenmiş masadan metal afinite boncuklar ile yüksek hızda spin elde edilen süpernatant karıştırın. 4 rulo 1hr inkübe ° C. </li><li> Gravite akışı sütun vücuda şerbeti dökün ve akış atmak. </li><li> IMAC Cilt ve Yıkama Tamponu 20 ml (10 sütun cilt) (50 mM NaP, pH 7, 300 mM NaCl,% 5 gliserol,% 0.2 DDM) ile sütun yıkayın </li><li> IMAC elüsyon tamponu (50 mM NaP, pH 7.0, 300 mM NaCl,% 5 gliserol, 250 mM imidazol,% 0.2 DDM) ile protein Zehir. </li><li> Elüsyon kesirler 15 mcL numune alınması, poliakrilamid jel elektroforez ile analizi için 15 mcL 2X SDS numune tamponu ile her karıştırın. Bir mikrosantrifüj 30sn Spin. Her bir fraksiyon MexB ve saflık miktarını tahmin etmek için% 10 poliakrilamid SDS jel örnekleri analiz edin. </li><li> MexB protein deterjanı kompleksleri ve 4 bir spin konsantratör onları konsantre içeren kesirler Havuzu ° C, protein, bu s çökelerek olmadığını dikkatli olunTep. </li></ol> 7. Jel Filtrasyon Sütun: <ol start="23"><li> 24 ml çalıştıran tamponu (50 mM NaP, pH 7.0, 300 mM NaCl,% 5 gliserol,% 0.2 beta-octylglucoside) ile Superose 12 HL 30/10 sütun Öncesi dengelenmesi ve düz bir taban için bekleyin. </li><li> Akta sistemi yükleme döngüsü çalışan tamponu ile durulayın. </li><li> Filtre sütun uygulamadan önce bir şırınga filtresi kullanarak protein solüsyonu. </li><li> 5 mg / ml 'ye kadar bir protein konsantrasyonu, protein çözüm sütun üzerine 240 mcL yükleyin. </li><li> Run 1.5 tampon sütun hacimleri (36 ml), 0.25 ml kesirler toplamak. Elüsyon hacmi 15 mL - MexB protein deterjan kompleksleri yaklaşık 10 pik olarak Zehir gerekir. </li><li> Pik kesirler 5 mcL örnekleri alın. Her örnek 01:01 2X SDS numune tamponu ile karıştırın. Her fraksiyonu MexB miktarı ve saflık tahmin etmek için% 10 poliakrilamid jel üzerinde numunelerin analiz </li><li> Saf MexB içeren kesirler Havuzu. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 1 jel filtrasyon sütundan IMAC sütun ve bireysel kesirler birleştirilmiş sütun fraksiyonları ile poliakrilamid jel içerir. Jel filtrasyon sütun sonra protein Coomassie lekeli poliakrilamid jel saf görünür. Şekil 2 jel filtrasyon sütun sütun protein deterjan kompleksi salınımlı ana zirve gösteren bir iz içerir. MexB protein ortalama verim, 2XYT kültür 6 litre başına yaklaşık olarak 2 mg. <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. SDS-PAGE jel MexB PDC saflaştırılması. Lane 1, Molekül ağırlığı işaretleri. 2, IMAC kesirler Pooled. 3-7, Jel filtrasyon sütun kesirler. <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. MexB protein deterjan kompleksleri (PDC) Jel Filtrasyon Sonuçlar örneği.

<ol><li>Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elegant+means+of+self-protection+in+gram-negative+bacteria+by+recognizing+and+extruding+xenobiotics+from+the+periplasmic+space%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space.</a> J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).</li>
<li>Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+efflux+pump%28s%29+in+intrinsic+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+active+efflux+as+a+contributing+factor+to+beta-lactam+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).</li>
<li>Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MexA-MexB-OprM+in+antibiotic+efflux+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).</li>
<li>Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificities+of+MexAB-OprM%2C+MexCD-OprJ%2C+and+MexXY-oprM+efflux+pumps+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).</li>
<li>Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AcrAB+efflux+pump+plays+a+major+role+in+the+antibiotic+resistance+phenotype+of+Escherichia+coli+multiple-antibiotic-resistance+%28Mar%29+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants.</a> J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).</li>
<li>Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug+efflux+pumps+MexA-MexB-OprM+and+MexC-MexD-OprJ+in+a+multidrug-sensitive+Escherichia+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).</li>
<li>Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AcrA%2C+AcrB%2C+and+TolC+of+Escherichia+coli+Form+a+Stable+Intermembrane+Multidrug+Efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Complex.+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux.</a> Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).</li>
<li>Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mex-gene+products+in+antibiotic+extrusion+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).</li>
<li>Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+and+surfactant+interactions+in+membrane-protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).</li>
<li>Jones, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactants+in+membrane+solubilisation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Surfactants in membrane solubilisation.</a> Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).</li>
<li>Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).</li>
</ol>

Direnci, iyon transportu, hücre-hücre iletişimi, vezikül taşıma, hücresel yapı bakım ve konak-patojen etkileşimi de dahil olmak üzere pek çok yaşamsal hücresel faaliyetler, ilaca ek olarak, hücre zarı içinde gömülü olan proteinler içerir. Transmembran proteinler bilinen proteinlerin% 30 üzerinde makyaj ve bugün kullanılan ilaçların büyük çoğunluğu için hedeflerdir. Transmembran proteinler yanlış katlama ya da etkinlik, kistik fibrozis ve diyabet gibi önemli genetik hastalıkların neden olur. Transmembran proteinler büyük...

<table><tbody><tr><td>SDS örnek tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>C43(DE3) E. coli suşu</td><td>Lucigen</td><td>60345-1</td><td></td></tr><tr><td>kanamisin sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4378</td><td></td></tr><tr><td>2XYT besiyeri</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2466-2</td><td></td></tr><tr><td>LB besiyeri</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61189-5000</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3226-1</td><td></td></tr><tr><td>Lizozim</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7651</td><td></td></tr><tr><td>Komplet EDTA içermeyen proteaz inhibitör tabletleri</td><td>Roche Group</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>NaP monobazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6566</td><td></td></tr><tr><td>NaP dibazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-dodesil-&amp;#946;-D-maltopiranozid</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>15ml tüpler</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>See-Saw Rocker sallayıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>SSL 4</td><td></td></tr><tr><td>Talon metal afinite reçinesi</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>%10 poliakrilamid SDS PAGE jelleri</td><td>Bio-Rad</td><td>161-1454</td><td></td></tr><tr><td>Tris/glisin/SDS PAGE yürütme tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0732</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidascope ön boyalı moleküler ağırlık markörleri</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0324</td><td></td></tr><tr><td>Superose 12 30/10 kolonu</td><td>GE Healthcare</td><td>12 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Amicon santrifüj konsantratörü</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLFG R04 NL</td><td></td></tr><tr><td>Fernbach erlenmayerleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-552-39</td><td></td></tr><tr><td>Fernbach erlenmayerleri için çalkalayıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akta sistemi</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000 rotorlu J6 büyük ölçekli santrifüj</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 l santrifüj şişeleri</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>969329</td><td></td></tr><tr><td>RC-5 santrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SS34 sabit açılı rotor ve tüpler</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall masaüstü Ultrasantrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapaklı T647.5 rotoru ve tüpleri</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>08322</td><td></td></tr><tr><td>French Basınç Hücresi</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr></tbody></table>

İfade, deterjan çözünürleştirme ve membran transporter, mexb ilaca direnç protein saflaştırılması

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Çok ilaca direnç (MDR), bir kanser hücresi ya da patojen yeteneği, geniş bir yelpazede yapısal ve işlevsel olarak ilgisi olmayan bir anti-kanser ilaçlar ya da antibiyotik dirençli olduğu, halk sağlığı alanında geçerli bir ciddi bir sorundur. Bu ilaca direnci büyük ölçüde bağımlı enerji ilaç dışarı atım pompaları nedeniyle. Pompaları, dış ortama toksik bir eşiğin altında kendi hücre içi konsantrasyonu düşürücü anti-kanser ilaçlar ya da antibiyotik sınırdışı. Biz örneğin, yanıklara veya kistik fibrozis, ve aynı zamanda immün sistemi zayıf olan kanser, diyaliz, ve transplantasyon hastaları, çok ilaca direnç Pseudomonas aeruginosa, birçok yaralanma veya hastalık türleri olan hastalarda enfeksiyonlarına neden olan fırsatçı bir bakteriyel patojen eğitim görmektedir. P. büyük MDR efflux pompaları aeruginosa bir iç membran proton-ilaç antiporter (RND), bir dış membran kanal (OMF) ve bir periplazmik bağlayıcının protein (MFP) 1-8 oluşan üçlü kompleksler. RND ve OMF proteinler transmembran proteinlerdir. Transmembran proteinler tüm proteinlerin% 30&#39;dan fazla makyaj ve% 65 ilaç hedefleri vardır. Hidrofobik transmembran alanları, sulu tampon proteinler çözünmez yapın. Transmembran protein saflaştırılmış önce, hafif bir deterjan içeren bir protein deterjan kompleksi (PDC) 9-11 olarak çözünür protein sağlayacak bir tampon koşulları bulmak için gerekli. Bu örnekte, bir RND protein, P. aeruginosa MexB transmembran taşıyıcı bir transmembran protein rekombinant formu, ifade, bu deterjan kullanarak çözünür ve ardından, protein deterjan kompleksleri arındırmak için nasıl göstermek için. Bu ifade, arıtma, ve diğer birçok recombinantly ifade zarı proteinleri çözünürleştirme genel yöntemi uygulanabilir. Protein deterjan kompleksleri, daha sonra X-ray kristal yapı tayini veya çapraz bağlanma çalışmaları da dahil olmak üzere biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonu için kullanılabilir.

Bu protokolde, çözünebilir bir protein deterjan kompleksi olarak, ifade, çözünmüş ve recombinantly ifade membran proteini, MexB arıtma göstermektedir. MexB fırsatçı bakteriyel patojen Pseudomonas aeruginosa bir çok ilaca direnç membran taşıyıcı.

İfade, Deterjan çözünürleştirme ve Membran Transporter, MexB ilaca Direnç Protein Saflaştırılması

Çoklu ilaç direnci (MDR), bir kanser hücresinin veya patojenin, yapısal ve işlevsel olarak birbiriyle ilişkisiz geniş bir yelpazedeki ilaçlara karşı direnç gösterme yeteneğidir...

Mex B membran proteinini saflaştırmak için, öncelikle rekombinant DNA yöntemleri kullanılarak Mex B'nin e coli'de eksprese edilmesi sağlanır. Ardından membranlar izole edilir ve membran proteinleri hafif bir deterjanla çözünür hale getirilir. Çözünür hale getirilen membran proteini iMac ile saflaştırılır ve protein daha sonra jel filtrasyon kromatografisi ile ileri düzeyde saflaştırılır.Proteinin saflaştırma düzeyi SDS poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak belirlenir. Bu prosedür çoklu ilaç direnci transmembran taşıyıcıları hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer membran proteinlerine de uygulanabilir; bugünkü prosedürler laboratuvarımdan bir lisansüstü öğrencisi tarafından gerçekleştirilecektir. Bu prosedür için, Pseudomonas aeruginosa'dan alınan Mex B, Mex B'nin C-terminali altı-histidin etiketiyle eksprese edilmesi için PET 30 B plus ekspresyon vektörüne subklonlanacaktır. Akşam saatlerinde, taze transformantlar veya dondurulmuş stok kullanarak dört adet 3 mL LB kanamisin kültürünü inoküle ederek başlayın ve kültürleri bir silindir üzerinde 37 °C'de gece boyunca büyütün.150 mililitre, mililitre başına 30 mikrogram Kanamisin içeren LB'yi inoküle etmek için gece boyu büyütülen kültürleri kullanın. Kültürü öğleden sonra 37 °C'de çalkalayıcıda büyütün. Küçük kültürü, mililitre başına 30 mikrogram içeren altı adet bir litrelik 2XYT besiyerini inoküle etmek için kullanın.Kanマイsin'i Erlen flasklara ekleyin. 1:40 dilüsyonu için kültür başına 25 mililitre kullanın. Kültürleri, optik yoğunluğa ulaşana kadar 37 derece Celsius'ta büyütün.0,4 ile 0,6 arası OD600 değerine ulaşana kadar yaklaşık 1,5 saat bekleyin. Kültürler uygun yoğunluğa ulaştığında, 0,5 mililitre bir molar IPTG ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin. Tüm erlenleri tekrar çalkalayıcıya yerleştirin ve bakterileri ertesi sabah hasat edene kadar gece boyunca 30 °C'de büyütmeye devam edin.Kültürleri çalkalayıcıdan çıkarın ve soğutun. Ardından hücreleri toplamak için kültürleri santrifüj tüplerine aktarın ve hücreler santrifüj edilirken büyük ölçekli bir santrifüjde 4 °C'de 30 dakika boyunca 5.000 rpm hızda santrifüj edin. 100 mL hücre resüspansiyon tamponuna DNAs proteaz inhibitörleri ve lizozim ekleyin.Ayrıca, bu tabloda gösterildiği gibi iki porsiyon membran Resus süspansiyon Tamponu'nu proteaz inhibitörleri ile takviye edin. Santrifüj işlemi tamamlandığında üç çözeltinin tamamını buz üzerinde tutun. Hücre peletlerini 100 milliliters hücre resus süspansiyon Tamponu içinde yeniden süspanse edin.Ardından, hücreleri ekstrakte edin. Hücre süspansiyonu French basınç hücresine yüklenir ve hücre French presine yerleştirilir. Basınç, 12, 000 pounds per square inch değerine ulaşana kadar uygulanır.Kırılan hücrelerin yavaşça akması için vana çok az miktarda açılır. Hücrelerin fışkırarak çıkmasına neden olacak kadar vanayı fazla açmamak önemlidir; aksi takdirde hücreler çok düşük bir basınçla salınacak ve etkili bir şekilde parçalanmayacaktır. Hücre lizatını, buz üzerinde soğuk tutulan bir şişeye toplayın.Hücre çözeltisini 12,000 pounds per square inch basınçta tekrar bir French basınç hücresinden geçirin. Hücre lizatını SS 34 santrifüj tüplerine aktarın ve hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için SS 34 rotorunda, dört derece Celsius'ta, 10,000 rotations per minute hızda 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Sırada berraklaştırılmış lizat bulunmaktadır.Membran fraksiyonunu hazırlamak için kullanılır. Süpernatanı dikkatlice ti. 6 4, 7 0.5 ultra santrifüj tüplerine aktarın, TI 6 4 7 0.5 rotorunda, dört derece santigrat sıcaklıkta, dakikada 40,000 devir ile 50 dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı atın. Bir pipet kullanarak, hücre membranlarını içeren peleti yaklaşık 25 mililitre membran Resus süspansiyon tamponu içerisinde nazikçe yeniden süspande edin; membran süspansiyonunu temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve TI I 6 4 7 0.5 rotorunda, 4 °C'de, 50 dakika boyunca dakikada 40.000 devir hızında tekrar santrifüjleyin ve yıkanmış membran peletini 25 mililitre membran Resus süspansiyon tamponu içerisinde yeniden süspande edin. Ardından, yeniden süspande edilen membranlardaki membran proteinlerini yaklaşık 25 mililitre ile solubilize edin.Final deterjan konsantrasyonu %2 DDM olacak şekilde altı mililitre %10 DDM ekleyin; karışımı dört derece santigrat sıcaklıkta iki saat boyunca sallayın. DDM varlığındaki iki saatlik inkübasyondan sonra, çözünür protein deterjan komplekslerini çözünmeyen proteinlerden ayırmak için karışımı TI I 6 4 7 0.5 rotorunda, dört derece santigrat sıcaklıkta, 40.000 devir/dakika hızla 40 dakika boyunca santrifüj edin. Mex B protein deterjan komplekslerini içeren süpernatantı, saflaştırmada kullanmak üzere saklayın. Mex B protein deterjan komplekslerini içeren süpernatantı, Resus süspansiyon tamponu ile dengelenmiş iki mililitre iyon metal afinite boncuğu ile karıştırın. Proteinlerin reçineye bağlanmasının ardından, bir dönerle dört derece santigrat sıcaklıkta bir saat boyunca inkübe edin.Süspansiyonu yer çekimi akışlı bir kolon gövdesine boşaltın ve dışarı akan sıvıyı atın. Kolonun yıkanması tamamlandığında, kolonu 20 mililitre veya 10 kolon hacmi iMac bağlama ve yıkama tamponu ile yıkayın. Bağlı proteinleri 10 mililitre iMac elüsyon tamponu ile elüe edin.Her bir elüsyon fraksiyonundan 10 µL örnek alın. Bu örnekleri 10 µL iki katı SDS örnek tamponu ile karıştırın ve %10'luk poliakrilamid SDS jelinde analiz edin.Her bir fraksiyondaki mex B miktarını ve saflığını tahmin edin. Mex B protein deterjan komplekslerini içeren fraksiyonları alın ve bunları dört derece santigrat sıcaklıkta bir santrifüj konsantratörle konsantre edin. Bu adımda proteinin çökelmemesine dikkat edin.Çökelme olup olmadığını gözlemlemek için birkaç kez kısa santrifüj uygulayın. Her santrifüjden sonra, havuzlanmış fraksiyonları bir jel filtrasyon kolonu kullanarak saflaştırma işlemine geçin. Bir super rose 12 HL 30 over 10 kolonunu 24 milliliters running buffer ile ön dengelemeye tabi tutun ve baz hattının düzleşmesini bekleyin.Ardından, aktör sistem yükleme döngüsünü akan tamponla durulayın. Proteini kolona uygulamadan önce, protein çözeltisini bir şırınga filtresi kullanarak süzün. Daha sonra, mililitre başına beş miligrama kadar protein içeren protein çözeltisinden 240 µL'ye kadar kolona yükleyin.Sütun hacminin 1,5 katı kadar tampon çözelti geçirin ve 0,25 mililitrelik fraksiyonlar toplayın. XB protein deterjan kompleksleri, yaklaşık 10 ila 15 mililitrelik elüsyon hacminde bir pik olarak elüe olur. Pik fraksiyonlarından beş mikrolitrelik numuneler alın.Her örneği, iki kat derişimli SDS örnek tamponu ile bire bir oranda karıştırın. Her fraksiyondaki Mex B miktarını ve saflığını tahmin etmek için örnekleri %10'luk poliakrilamid jel üzerinde analiz edin ve saf Mex B içeren fraksiyonları ayırın. Bu poliakrilamid jele, iMac kolonundan ayrıştırılan fraksiyonlar ve jel filtrasyon kolonundan elde edilen bireysel fraksiyonlar yüklendi. Jel filtrasyon kolonundan sonra, protein Coomassie ile boyanmış poliakrilamid jelde saf görünmektedir.Jel filtrasyon kolonundan alınan bir iz, kolondan elüye olan protein deterjan kompleksinin ana pikini göstermektedir. mxb proteininin ortalama verimi, altı litre 2 XYT kültür başına yaklaşık iki miligramdır. Uzmanlaşıldığında, bu prosedür uygun şekilde yürütülürse sekiz saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir membran proteininin nasıl eksprese edileceği, çözüleceği ve saflaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

expression-detergent-solubilization-purification-membrane-transporter

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz, Pseudomonas aeruginosa'dan akış pompaları in vitro incelenmesi için bir protokol mevcut. Bu protokol, lipozom zarı içinde sağlam, tersinir ve ayarlanabilir proton gradyanının oluşturulması için izin verir ve bu nedenle protomotive güç ile enerji herhangi bir zar proteini için uyarlanabilir olmalıdır.

Pseudomonas aeruginosa itibaren MexAB dışa atım pompa in vitro olarak incelenmesi

Yeşil floresan proteini füzyon göre, Escherichia coli içinde rekombinant zar proteinlerinin ifadesi için tarama için bir aerodinamik bir yaklaşım sunulmuştur.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

Proteolipozomlar, iyi tanımlanmış bir biyokimyasal ortamda yeniden oluşturulan saflaştırılmış kanalları ve taşıyıcıları incelemek için kullanılır. Bu proteinlerin aracılık ettiği akışı ölçmek için deneysel bir prosedür gösterilmiştir. Sulandırılmış proteinin fonksiyonel özelliklerini kantitatif olarak belirlemek için proteolipozomları hazırlama, kayıtları gerçekleştirme ve verileri analiz etme adımları açıklanmaktadır.

Bir Proteoliposome Tabanlı effluks Deney Cl Tek-molekül Properties belirleme<sup&gt; -</sup&gt; Kanallar ve Nakliyeciler

Sunulan protokol, gözenekleri kapsayan solvent içermeyen lipid çift katmanları kullanılarak tek taşıyıcı seviyesinde membran protein aracılı taşımanın analizini açıklar. Bu, yüksek derecede paralel veri toplama ve analizi ile birleştirilen toplu olarak üretilen nanopor dizi çiplerinin oluşturulmasıyla elde edilir ve gelecekte membran protein efektör taramalarının kurulmasını sağlar.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Burada hedef lipid bilayers postfusion bilayer içine bu membran proteinlerinin deterjan ücretsiz teslim etmek için ile ultrafast protokollerinden membran proteinlerinin fusogenic proteoliposomes içine sulandırma ve böyle proteoliposomes füzyonu için mevcut. Bu yaklaşımlardan birleşimini karmaşık çok bileşenli Membran sistemleri hızlı ve kolayca kontrollü montaj sağlar.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Burada hızlı, solubilize ve birçok ökaryotik Bor taşıyıcılar homoloji Maya kullanarak SLC4 taşıyıcı ailesi ile arındırmak için bir protokol mevcut. Ayrıca saf homomeric protein multimeric derleme için değerlendirmek için bir kimyasal cross-linking tahlil açıklar. Bu protokoller için zorlu diğer membran proteinlerinin adapte edilebilir.

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

E. coli'de heterolog ekspresyon ve fransız presi kullanılarak hücrelerin lysis'inde üretilen membran vezikül preparatlarında proton-tahrikli membran taşıyıcılarının karakterizasyonu için bir yöntem tanımladık.

E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Bu makalede, Saccharomyces cerevisiae'de aşırı ifade edilen Candida albicans ABC (ATP bağlayıcı kaset) protein Cdr1'in karakterizasyonu için küçük ölçekli bir plazma membran izolasyon protokolü sunulmaktadır. Cdr1 ile etiket arasında 16 kalıntılı bağlayıcı bulunan proteaz-bölünebilir C-terminal mGFPHis çift etiket, Cdr1'in saflaştırılmasını ve deterjan taramasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.

Candida albicans Cdr1-mGFPHis Analizi için Küçük Ölçekli Plazma Membran Hazırlama

İnsan zarı taşıyıcılarının yapısal ve biyokimyasal çalışmaları, miligram miktarlarda kararlı, sağlam ve homojen protein gerektirir. Burada, kodon için optimize edilmiş genleri kullanarak insan çözünen taşıyıcı taşıyıcıları taramak, eksprese etmek ve saflaştırmak için ölçeklenebilir yöntemleri açıklıyoruz.

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Bu protokol, son santrifüjleme adımında disakkarit trehalozu içeren geliştirilmiş bir SERCA saflaştırma yöntemini tanımlar. Bu karbonhidrat, zorlu koşullar altında proteinleri stabilize eder. Saflaştırılmış SERCA, katalitik olarak aktifti ve yüksek saflık sergiledi, bu da onu yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için uygun hale getirdi.

Sarko-Endoplazmik Retikulum Ca2+-ATPazın Tavşan Kasından Saflaştırılması

Öğrenin, MexB membran proteininin ifadesini, deterjan çözünürleştirmesini ve saflaştırılmasını. Pseudomonas aeruginosa çoklu ilaç direnci taşıyıcısını E. coli'de rekombinant DNA yöntemleriyle çalışın.

İfade, Deterjan çözünürleştirme ve Membran Transporter, MexB ilaca Direnç Protein Saflaştırılması

Daha fazla video keşfet