İfade, Deterjan çözünürleştirme ve Membran Transporter, MexB ilaca Direnç Protein Saflaştırılması

Mex B zar proteinini saflaştırmak için Mex B ilk olarak rekombinant DNA yöntemleri kullanılarak e coli cinsinden eksprese edilir. Daha sonra zarlar izole edilir ve zar proteinleri hafif bir deterjanla çözündürülür. Çözündürülmüş membran proteini, iMac ile saflaştırılır ve protein, jel filtrasyon kromatografisi ile daha da saflaştırılır.

Proteinin saflaştırma seviyesi, SDS poli AKRİLAMİT Jel elektroforezi kullanılarak belirlenir. Bu prosedür, çoklu ilaç dirençli transmembran taşıyıcılar hakkında fikir verebilse de, bugün laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi tarafından oluşturulacak prosedürleri gösteren diğer membran proteinlerine de uygulanabilir. Bu prosedür için, pseudomonas Aosa'dan Mex B, PET 30 B artı ekspresyon vektörüne alt klonlanacaktır, böylece Mex B bir C terminali HEXA histamin etiketi ile ifade edilir. Akşamları dört adet üç mililitrelik lb kutu misin kültürünü taze dönüştürücülerle aşılayarak başlayın veya donmuş bir stok kullanın, kültürleri sabahları gece boyunca 37 santigrat derecede bir silindirde büyütün.

Mililitre başına 30 mikrogram içeren 150 mililitre LB'yi aşılamak için gece boyunca kültürleri kullanın. Mycin, öğleden sonra bir çalkalayıcıda kültürü 37 santigrat derecede büyütebilir mi? Mililitre başına 30 mikrogram içeren iki XYT ortamını altı kez bir litre aşılamak için küçük kültürü kullanın.

Eğrelti otu sırt şişelerindeki misin olabilir mi? Bir ila 40 seyreltme için kültür başına 25 mililitre kullanın. Kültürleri optik yoğunluğa ulaşana kadar 37 santigrat derecede büyütün.

0,4 ila 0,6 arasında 600, yaklaşık 1,5 saat. Kültürler uygun yoğunluğa ulaştığında, bir azı dişinden 0,5 mililitre ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin. IPTG'yi seçin. Tüm şişeleri çalkalayıcıya geri koyun ve ertesi sabah bakterileri toplayana kadar gece boyunca 30 santigrat derecede büyütmeye devam edin.

Kültürleri çalkalayıcıdan alın ve soğutun. Daha sonra hücreleri hasat etmek için, kültürleri santrifüj tüplerine aktarın ve hücreler santrifüjlenirken büyük ölçekli bir santrifüjde dakikada 5.000 dönüşte 30 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. 100 mililitre hücre yeniden süspansiyon tamponunu DNA'lar, proteaz inhibitörleri ve lizozim ile destekleyin.

Ayrıca, bu tabloda gösterildiği gibi proteaz inhibitörleri ile iki membran Resus süspansiyon Tamponu alikotunu destekleyin. Santrifüjleme tamamlandığında üç çözeltiyi de buz üzerinde tutun. Resus, hücre peletlerini 100 mililitre hücre reçine süspansiyon Tamponunda harcar.

Ardından, hücreleri çıkarın. Hücre süspansiyonu Fransız basınç hücresine yüklenir ve hücre Fransız presinin üzerine yerleştirilir. Basınç, inç kare başına 12.000 pound'a ulaşana kadar uygulanır.

Valf çok küçük bir miktar açılır, böylece kırık hücreler dışarı damlar. Valfi çok fazla açmamak ve hücrelerin dışarı çıkmasına izin vermemek önemlidir çünkü çok az basınçla serbest bırakılacaklar ve verimli bir şekilde kırılmayacaklardır. Hücre lizatını bir şişede toplayın, buz üzerinde soğuk tutun.

Hücre çözeltisini, inç kare başına 12.000 pound'da tekrar bir Fransız basınç hücresinden geçirin. Hücre lizatını SS 34 santrifüj tüplerine aktarın ve bir SS 34 rotorunda dört santigrat derecede 30 dakika boyunca dakikada 10.000 dönüşte hücre kalıntılarını gidermek için santrifüjleyin. Sırada açıklığa kavuşturulmuş lizat var.

Membran fraksiyonunu hazırlamak için kullanılır. Supinatı dikkatlice ti'ye aktarın. 6 4, 7 0.5 ultra santrifüj tüpleri, dört santigrat derecede 50 dakika boyunca dakikada 40.000 dönüşte bir TI 6 4 7 0.5 rotorda santrifüjleyin.

Supinate'ı atın. Hücre zarlarını yaklaşık 25 mililitre membran Resus süspansiyon tamponunda içeren peleti nazikçe yeniden süspanse etmek için bir pipet kullanın, membran süspansiyonunu temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüj kazancını dakikada 40.000 dönüşlü bir TI I 6 4 7 0.5 rotorda 50 dakika boyunca dört santigrat derece Ve yıkanmış membran paletini 25 mililitre membran Resus süspansiyon tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, zar proteinlerini yaklaşık 25 mililitrede yeniden asılı zarlara çözündürün.

Nihai deterjan konsantrasyonunun% 2 DDM olması için altı mililitre% 10 DDM ekleyin, karışımı DDM santrifüj varlığında iki saatlik inkübasyondan sonra iki saat boyunca dört santigrat derecede sallayın, karışım dakikada 40.000 dönüşte 40 dakika boyunca dört santigrat derecede TI I 6 4 7 0.5 rotorunda. Çözünür protein deterjan komplekslerini çözünmeyen proteinlerden ayırmak için. Saflaştırmada kullanmak üzere Mex B protein deterjan komplekslerini içeren sırt üstü besleyiciyi, Resus süspansiyon Tamponunda dengelenmiş iki mililitre lon metal afinite boncukları ile Mex B protein deterjan komplekslerini içeren sırtüstü besleyiciyi saklayın, proteinlerin reçineye bağlanmasından sonra dört santigrat derecede bir silindir üzerinde bir saat inkübe edin.

Bulamacı bir yerçekimi akış sütunu gövdesine dökün ve akışı atın. Kolonu 20 mililitre veya 10 kolon hacminde iMac ciltleme ve yıkama tamponu ile yıkayın, kolonun yıkanması tamamlandığında. Bağlı proteinleri 10 mililitre iMac elüsyon tamponu ile elute edin.

Her elüsyon fraksiyonundan 10 mikrolitre numune alın. 10 mikrolitre iki kez SDS numunesi ile karıştırın, tamponlayın ve %10'luk bir poli akrilamid üzerinde analiz edin. SDS jeli.

Her bir fraksiyondaki mex B'nin miktarını ve saflığını tahmin edin. Mex B proteini deterjan komplekslerini içeren fraksiyonları çekin ve bunları dört santigrat derecede bir spin yoğunlaştırıcıda konsantre edin. Bu adımda proteinin çökelmemesine dikkat edin.

Birkaç kısa dönüş kullanın ve yağışı izleyin. Her döndürmeden sonra, bir jel filtrasyon sütunu kullanarak havuzlanmış fraksiyonları saflaştırmaya devam edin. 24 mililitre çalışma tamponu ile 10 sütun üzerinde bir süper gül 12 HL 30'u önceden dengeleyin ve düz bir taban çizgisi bekleyin.

Ardından, aktör sistemi yükleme döngüsünü çalışan arabellek ile durulayın. Proteini kolona uygulamadan önce, bir şırınga filtresi kullanarak protein çözeltisini süzün. Daha sonra, mililitre başına beş miligrama kadar bir protein ile kolona 240 mikrolitreye kadar protein çözeltisi yükleyin.

1,5 sütun hacminde tampon çalıştırın ve 0,25 mililitrelik fraksiyonları toplayın. XB protein deterjan kompleksleri, yaklaşık 10 ila 15 mililitre elüsyon hacminde bir tepe olarak elüte olur. Tepe fraksiyonlarından beş mikrolitre numune alın.

Her numuneyi iki kez SDS numune tamponu ile bire bir karıştırın. Her fraksiyondaki me Mex B'nin miktarını ve saflığını tahmin etmek için numuneleri %10'luk bir poli akrilamid jel üzerinde analiz edin, saf ME B içeren fraksiyonları çekin. Jel filtrasyon kolonundan sonra protein, kumasi lekeli poli akrilamid jel üzerinde saf görünür.

Jel filtrasyon kolonundan gelen bir iz, kolondan sızan protein deterjan kompleksinin ana tepe noktasını gösterir. Mxb proteininin ortalama verimi, iki XYT kültürünün altı litresi başına yaklaşık iki miligramdır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür uygun şekilde yapılırsa sekiz saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir zar proteininin nasıl ifade edileceğini, çözündürüleceğini ve saflaştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.