Edu Sinyal Amplifikasyon Bireysel Hücrelerde Mitokondriyal DNA replikasyonu Görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, kültürlenmiş nöronlarda mtDNA replikasyonunu işaretlemek ve görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle nöronların iki ila 24 saat boyunca timidid analoğu EDU ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, alkin içeren EDU'nun, bakır katalizli kovalent bir reaksiyon aracılığıyla floresan Oregon Green 488 azide ile işaretlenmesidir.

Prosedürün son adımı, yeni sentezlenen MT DNA'sına dahil edilen EDU'yu görselleştirmek amacıyla orgon green sinyalini aramide sinyal amplifikasyon adımı ile güçlendirmektir. Sonuç olarak, clicka EDU kimyası ve ardından gelen tear mind sinyal amplifikasyonunun kombinasyonu aracılığıyla nöronların spesifik hücre altı kompartımanlarında MT DNA replikasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin BRDU işaretlemesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, EDU işaretlemesinin daha kolay ve daha hafif olmasıdır; bu da nöronal belirteçlerin ek immünofloresan boyamasına olanak tanır.

Bu yöntem; nöronların hücre gövdeleri, aksonlar, dendritler ve sinaptik terminaller dahil olmak üzere hücre altı kompartımanlarındaki değişen enerji yüklerini nasıl karşıladıkları gibi, mitokondri sayısı düzenlemesine ilişkin temel soruları yanıtlayabilir. Dolayısıyla bu yöntem; nöropati ve nörodejenerasyon dahil olmak üzere, mitokondri temelli birçok nörolojik hastalığın patogenezinin altında yatan mekanizmalar hakkında bilgi sağlayabilir. Ancak daha da önemlisi; ilaç toksisitesi, kanser ve yaşlanma dahil olmak üzere, mitokondriyal DNA kopya sayısındaki değişikliklerin hastalık durumunun patogenezinin temelinde yattığı muhtemel diğer sistemlere de uygulanabilir.

Bu video, steril 12 milimetrelik cam lameller üzerinde büyütülmüş dorsal kök ganglion nöronlarında, yeni sentezlenmiş mitokondriyal DNA'nın (kısaltması M-T-D-N-A) nasıl işaretleneceğini gösterecektir. 24 kuyucuklu bir kültür plağında, Clicka EDO Mikroplaka analiz kitinden alınan 10 milimolar stok 5-etinoil-2'-deoksiridin (kısaltması EDU), 10 XEDU stok elde etmek için kültür ortamında 1'e 100 oranında seyreltilir. Ardından 10 XEDU stok, her kuyucuktaki ortama doğrudan eklenir; işlem görmüş nöronlar bir çeker ocak içerisinde 37 °C'de ve %5 karbondioksit altında 2 ila 24 saat inkübe edilir.

Nöronları oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca %2 Paraformaldehit ile sabitleyin. Her yıkama iki ila beş dakika sürecek şekilde, 1X PBS ile iki kez yıkayın. Sabitlenen nöronlar, taze 1X PBS içinde dört °C'de bir aya kadar saklanabilir.

Eşlik eden metinde açıklandığı şekilde nemli bir hazne hazırlayın. Pozitif ve negatif EDU kontrolleri dahil olmak üzere, fiksasyon yapılmış 28 lamelliği ince uçlu pens kullanarak nemli hazne içindeki hidrofobik paraform M tabakalarına aktarın. Her bir lamelliğin yüzeyini kaplamak için 200 ila 300 µL 1xPBS yeniden uygulayın.

Metinde ve üretici talimatlarında açıklandığı şekilde click it assay kitini hazırlayın ve mitokondriyal DNA'yı etiketlemek için her bir lam üzerine 1XPBS içinde %0,1 Triton X içeren 75 ila 80 µL geçirgen çözelti ekleyip oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Hücre kaybı yaşamadan sıvıyı nazikçe uzaklaştırmak için ucuna 200 µL uç takılmış bir ampul transfer pipeti kullanın.

Kapağı hafifçe doldurmak için bir balon pipet kullanın. Önceki çözeltiyi tamamen yıkamak için 200 ila 300 µL XPBS ekleyin. Her lamel kapağını iki kez yıkayın.

Her bir lamelye 75 ila 80 µL taze %1 hidrojen peroksit içeren 1x PBS ekleyin. Endojen peroksidaz aktivitesini söndürmek için kapalı olarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha önce olduğu gibi 1x PBS ile iki kez durulayın ve eşlik eden metinde detaylandırıldığı şekilde klik reaksiyon kokteylini taze olarak hazırlayın.

Karıştırmak için pipetle yukarı aşağı çekin. Vortekslemeyin. Nöronları, her lam başına 75 ila 80 µL click-iT EDU fiksatif ile oda sıcaklığında beş dakika boyunca son fiksasyona tabi tutun. Son fiksasyon inkübasyonu sırasında, reaksiyon kokteylini eşit hacimde click-iT EDU fiksatif ile seyreltin.

Işıktan korumak için her bir lamel kapağına reaksiyon kokteylini ekleyin ve oda sıcaklığında 25 dakika inkübe edin. Reaksiyon kokteylini nazikçe uzaklaştırın ve bir epi floresan mikroskop altında seyreltilmiş 1x bloklama tamponu ile iki kez yıkayın. EdU boyaması tamamlandığında, çekirdeklerdeki orgon green boyamasını kontrol edin.

Termite sinyal amplifikasyonuna (TSA) başlamak için, her bir lamelle her bir lamelin üzerine %1'lik TSA bloklama çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Atine yeşil yaban turbu peroksidaz (HRP) konjuge antikor stok çözeltisini kısa süreliğine santrifüjleyin. TSA işleminden 2 ila 24 saat önce hazırlanan primer antikoru, TSA bloklama çözeltisi içerisinde 1:300 oranında seyreltin ve karıştırmak için ters çevirin veya pipetleyin; vorteks kullanmayın. Her bir lamelin üzerine 75 µL ekleyin ve 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, oda sıcaklığında bir kez XPBS ile üç kez durulama yapın. Bağlanmamış primer antikorun uzaklaştırıldığından emin olmak için lamelleri son yıkama adımında 30 ila 60 dakika daha inkübe edin. IDE reaksiyonunu, kullanımdan hemen önce bu protokolün metin kısmına uygun olarak hazırlayın.

Lamine camları IDE reaksiyonu ile oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bir kez XPBS ile üç kez yıkayın ve son yıkama aşamasında, daha önce olduğu gibi mikroskop altında 30 ila 60 dakika inkübe edin. MT DNA etiketlemesini kontrol edin; başarıyla boyanmış nöronları DPI içeren bir ANTIFA montaj medyumu ile cam lamlara monte edin; burada gösterilenler, analizler için tipik olarak kullanılan embriyonik ve yetişkin dorsal kök ganglion nöronlarının temsili diferansiyel kontrast görüntüleridir.

Bu şematik diyagramlar, MTD NA'daki EDU'nun yeşil floresan sinyali ile işaretleme prosedürünü temsil etmektedir. Mitotik olarak aktif F 11 nöroblastoma hücreleri pozitif kontrol olarak hizmet etmekte ve parlak alan üzerine bindirilmiş bu temsili floresan görüntülerinde, nükleer ve mitokondriyal DNA'ya dahil edilen EDU'nun işaretleme paternini göstermektedir. Yeşil noktasal sinyaller, hem embriyonik hem de yetişkin dorsal kök ganglion nöronlarının yeni sentezlenmiş M-D-D-N-A'sına dahil edilen amplifiye EDU sinyalini göstermektedir.

EDU işaretleme prosedürü, nörofilament gibi nöronal belirteçlerin kırmızı renkte sonraki immünofloresan boyamasına olanak tanır. Bu şematik diyagramlar, EDU ve MTD NA'nın kırmızı floresan sinyali ile işaretleme prosedürünü temsil etmektedir. Mitotik olarak aktif F 11 nöroblastoma hücreleri pozitif kontrol görevi görür ve nükleer ve mitokondriyal DNA'ya dahil edilen EDU'nun işaretleme paternini örnekler.

Bu şematik diyagram, yeni sentezlenen M-T-D-N-A'daki BRDU'nun yeşil veya kırmızı floresan sinyalle işaretlenmesi prosedürünü temsil etmektedir. Bu prosedürü uygularken, MT DNA işaretlemesini görselleştirmek için amplifikasyon adımlarına geçmeden önce, başarılı EDU işaretlemesini ve hücre çekirdeklerini kontrol etmek amacıyla mitotik olarak aktif hücreler kullanarak kontrollerin çalıştırılmasının önemli olduğunu unutmamak gerekir. Mitokondriyal DNA sentezinin nöronların belirli alt popülasyonlarında veya nöronal kompartmanlarda nasıl düzenlendiği gibi ek soruları yanıtlamak için standart immunfloresans gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Geliştirilmiş olan bu teknik, nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların hem normal fizyolojinin hem de bozulmuş hastalık durumlarını simüle eden kültür modellerinin kültür modellerinde mitokondri sayısının düzenlenmesini keşfetmelerine yol açacaktır.

Nörolojik durumlar.