Edu Sinyal Amplifikasyon Bireysel Hücrelerde Mitokondriyal DNA replikasyonu Görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, kültürlenmiş nöronlarda M-T-D-N-A replikasyonunu etiketlemek ve görselleştirmektir. Bu, ilk önce nöronların timidin analoğu EDU ile iki ila 24 saat boyunca inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, bir alkin içeren EDU'yu bakır katalizli bir kovalent reaksiyon yoluyla floresan orgon yeşili 4 88 azid ile etiketlemektir.

Prosedürün son adımı, yeni sentezlenen MT DNA'sına dahil edilen EDU'yu görselleştirmek için orgon yeşil sinyalini aramid sinyal amplifikasyon adımı ile amplifiye etmektir. Sonuç olarak, clicka EDU kimyası ve müteakip gözyaşı zihin sinyali amplifikasyonunun kombinasyonu yoluyla nöronların belirli hücre altı bölmelerinde MT DNA replikasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin BRDU etiketleme gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, EDU etiketlemesinin daha kolay ve daha hafif olması ve nöronal belirteçlerin ek immünofloresan boyanmasına izin vermesidir.

Bu yöntem, nöronların hücre gövdeleri, aksonlar, dendritler ve sinaptik terminal dahil olmak üzere hücre altı bölmelerinde değişen enerji yüklerini nasıl karşıladığı gibi mitokondri sayısının düzenlenmesindeki temel soruları yanıtlayabilir. Dolayısıyla bu yöntem, nöropati ve nörodejenerasyon dahil olmak üzere çoklu mitokondriyal temelli nörolojik hastalıkların patogenezinin altında yatan mekanizmalar hakkında bilgi sağlayabilir. Ancak daha da önemlisi, mitokondriyal DNA kopyasındaki değişikliklerin, ilaç toksisitesi, kanser ve yaşlanma dahil olmak üzere hastalık durumunun patogenezinin altında yatan diğer sistemlere de uygulanabilir.

Bu video, steril 12 milimetrelik cam örtü kızakları üzerinde büyütülmüş dorsal kök ganglion nöronlarında yeni sentezlenen M-T-D-N-A kısaltılmış mitokondriyal DNA'nın nasıl etiketleneceğini gösterecektir. 24 oyuklu bir kültür plakasında, 10 milimolar beş etanol iki doxy uridin stoğunu seyreltin, Clicka EDO Mikroplaka tahlil kitinden kısaltılmış EDU, 10 XEDU stoğu için kültür ortamında bir ila 100 arasında kısaltın. 10 XEDU stoğu daha sonra her bir kuyucukta doğrudan ortama eklenir, tedavi edilen nöronları 37 santigrat derecede ve bir davlumbazda% 5 karbondioksitte iki ila 24 saat inkübe eder.

Nöronları oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca% 2 Paraform aldehit içinde sabitleyin. Her yıkamada iki ila beş dakika boyunca bir XPBS'de iki kez yıkayın. Sabit nöronlar, bir aya kadar dört santigrat derecede taze bir XPBS'de saklanabilir.

Ekteki metinde açıklandığı gibi nemli bir oda hazırlayın. Pozitif ve negatif EDU kontrolleri de dahil olmak üzere 28 sabit kapak kızağını nemli oda içindeki hidrofobik paraform M tabakalarına aktarmak için ince uçlu forseps kullanın. Her bir kapak kaymasının yüzeyini kaplamak için 200 ila 300 mikrolitre bir XPBS'yi yeniden uygulayın.

Metinde açıklandığı gibi tıklama tahlil kitini ve üreticiler ve mitokondriyal DNA'yı her bir XPBS'de bir XPBS'de% 0.1 tritton X içeren geçirgen bir çözeltinin 75 ila 80 mikrolitresinde etiketlemek için hazırlayın, kaydırın, örtün ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ucuna 200 mikrolitrelik uç eklenmiş bir ampul transfer pipeti kullanın. Hücreleri kaybetmeden sıvıyı nazikçe çıkarmak için.

Kapağı nazikçe doldurmak için bir ampul pipeti kullanın. Önceki çözeltiyi iyice yıkamak için 200 ila 300 mikrolitre bir XPBS ile kaydırın. Her kapak fişini iki kez yıkayın.

Her bir kapak fişine bir XPBS'de 75 ila 80 mikrolitre taze %1 hidrojen peroksit pipetleyin. Endojen peroksidaz aktivitesini söndürmek için oda sıcaklığında 30 dakika kapalı olarak inkübe edin. Daha önce olduğu gibi bir XPBS ile iki kez durulayın, ekteki metinde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi klik reaksiyon kokteylini taze olarak hazırlayın.

Karıştırmak için yukarı ve aşağı sıkın. Kapak kayması başına EDU fiksatifinde 75 ila 80 mikrolitre tıklama ile nöronları girdap haline getirmeyin, oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Postfix inkübasyonu sırasında, reaksiyon kokteylini eşit hacimde clicka EDU fiksatifi ile seyreltin.

Işıktan korumak için her bir kapak kayma kapağına reaksiyon kokteylini ekleyin ve oda sıcaklığında 25 dakika inkübe edin. Reaksiyon kokteylini nazikçe çıkarın, epi floresan mikroskobu altında seyreltilmiş bir x bloke edici tampon ile iki kez yıkayın. EDU boyaması tamamlandığında çekirdeklerde orgon yeşili lekelenmesi olup olmadığını kontrol edin.

Termit sinyal amplifikasyonunu veya TSA'yı başlatın, her bir kapak kızağına% 1 TSA blok çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığını 30 dakika inkübe edin. TSA'dan iki ila 24 saat önce hazırlanan antion yeşil at turp peroksidaz konjuge antikor stoğunu kısaca döndürün, birincil antikoru TSA bloke etme çözeltisinde bir ila 300 oranında seyreltin ve tune düğüm girdabını karıştırmak için ters çevirin veya pipetleyin. Her kapağa 75 mikrolitre ekleyin, kaydırın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, oda sıcaklığında bir XPBS ile üç kez durulayın. Bağlanmamış primer antikorun çıkarıldığından emin olmak için kapak fişlerini son yıkamada 30 ila 60 dakika daha inkübe edin. IDE reaksiyonunu kullanmadan hemen önce bu protokolün metin kısmına göre hazırlayın.

Kapak fişlerini IDE reaksiyonu ile oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bir XPBS ile üç kez yıkayın ve son yıkamada mikroskop altında daha önce olduğu gibi 30 ila 60 dakika inkübe edin. MT DNA etiketlemesini kontrol edin, DPI içeren bir ANTIFA montaj ortamı ile cam slaytlara başarıyla boyanmış nöronları monte edin, burada gösterilen, tipik olarak analiz için kullanılan embriyonik ve yetişkin dorsal kök ganglion nöronlarının temsili diferansiyel girişim kontrast görüntüleridir.

Bu şematik diyagramlar, EDU'yu MTD NA'da yeşil bir floresan sinyaliyle etiketleme prosedürünü temsil eder. Mitotik olarak aktif F 11 nöroblastom hücreleri, pozitif bir kontrol görevi görür ve parlak alan üzerine yerleştirilmiş bu temsili floresan görüntülerde nükleer ve mitokondriyal DNA'ya dahil edilen EDU'nun etiketleme modelini gösterir. Yeşil punktat sinyalleri, hem embriyonik hem de yetişkin dorsal kök ganglion nöronlarının yeni sentezlenmiş M-D-D-N-A'sına dahil edilen güçlendirilmiş EDU sinyalini gösterir.

EDU etiketleme prosedürü, kırmızı renkte nörofilament gibi nöronal belirteçlerin müteakip immünofloresan boyanmasına izin verir. Bu şematik diyagramlar, EDU ve MTD NA'yı kırmızı bir floresan sinyalle etiketleme prosedürünü temsil eder. Mitotik olarak aktif F 11 nöroblastom hücreleri, pozitif bir kontrol görevi görür ve nükleer ve mitokondriyal DNA'ya dahil edilen EDU'nun etiketleme modelini gösterir.

Bu şematik diyagram, BRDU'yu yeni sentezlenmiş M-T-D-N-A'da yeşil veya kırmızı bir floresan sinyali ile etiketleme prosedürünü temsil eder. Bu prosedürü denerken, MT DNA etiketlemesini görselleştirmek için amplifikasyon adımlarına geçmeden önce başarılı EDU etiketlemesini ve hücre çekirdeklerini kontrol etmek için mitotik olarak aktif hücreler kullanarak kontrolleri çalıştırmayı unutmamak önemlidir. Mitokondri DNA sentezinin nöronların veya nöronal bölmelerin belirli alt popülasyonlarında nasıl düzenlendiği gibi ek soruları yanıtlamak için standart immünofloresan gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Nörolojik durumlar.