Deneysel Yaklaşımlar Mitokondriyal Yerelleşme ve Nükleer Hücre Döngüsü Kinaz, Cdk1 Fonksiyonu Eğitim için

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, normalde nükleer olan bir hücre döngüsü kinazının submitokondriyal lokalizasyonunu belirlemek ve ardından mitokondriyal lokalizasyonun hücre döngüsü ilerlemesini nasıl etkilediğini analiz etmektir. Bu yöntem, hücre döngüsü sırasında çekirdeğin mitokondrilerle nasıl iletişim kurduğu gibi mitokondriyal araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Proteinleri bir mitokondriyal yönlendirici dizi ile etiketleyerek, proteinlerin mitokondrideki spesifik aşırı ekspresyonlarından yararlanabilir ve böylece onların mitokondriye özgü işlevlerini inceleyebiliriz.

Bu yöntem belirli proteinlerin mitokondri hedeflemesi hakkında bilgi sağlayabilse de çekirdek, ER, golgi ve lizozom gibi diğer organellere de uygulanabilir. Hücreleri metin protokolüne uygun olarak kültürledikten, homojenize ettikten ve pelletledikten sonra süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Ardından örneği 7,000 g ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından pellet'i yeniden süspande etmek için 200 µL buz soğukluğunda IBC tamponu kullanın ve homojenatı iki alikota bölün. Örnekleri 7.000 g ve 4 °C'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Yıkama işlemini tekrarlayın.

Süpernatant atıldıktan sonra, pelletlerden birine 30 µL hücre lizis tamponu ekleyin ve lizatı immunoblotleme için -80 °C'de saklayın. Çözünür ve membrana bağlı proteinleri ayırmak için ikinci pellet ile sodyum karbonat ekstraksiyonu gerçekleştirmek üzere, 250 µL 0,1 M sodyum karbonat (pH 11,0) ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. 100.000 g'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından süpernatantı toplayın ve proteinleri çöktürmek için üzerine taze hazırlanmış, %20 trichloroacetic acid'den eşit hacimde ekleyin. 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Bu sırada, pelete 30 µL hücre liziz tamponu ekleyin ve immunoblotting için -80 °C'de saklamadan önce metin protokolüne göre sonikasyon uygulayın.

30 dakikalık TCA inkübasyonundan sonra, reaksiyonu 10 dakika boyunca 15,000 g ile santrifüj edin. Süpernatantı atın, ardından pelleti yeniden süspande etmek için 80 µL hücre liziz tamponu kullanın. Metin protokolünde açıklandığı şekilde hücrelerden mitokondriyal fraksiyonları izole ettikten sonra, mitokondriyal fraksiyonları 10 eşit porsiyona ayırın.

Numuneleri 7.000 g'de ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. Her bir peleti çözmek için tripsin içeren veya içermeyen, farklı konsantrasyonlardaki hipotonik sükroz tamponlarından 30 µL kullanın. Ardından 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Tripsin sindirimini durdurmak için tripsin içeren tüplere 3 µL 10 mM PMSF ekleyin. Ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Örnekleri 14,000 g'de ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Peleti liz etmek için 30 microliters hücre liz tamponu ekleyin. Örnekleri metin protokolünde açıklandığı şekilde sonike edin ve 80 degrees Celsius'ta saklayın.

Mitokondri hedefli GFP/RFP etiketli cyclinB-1 Cdk-1 vektörlerini oluşturmak için, standart moleküler klonlama tekniklerini kullanarak insan sitokrom-c oksidaz alt birim 8A öncülünden mitokondri hedefleme dizisini klonlayın ve pEGFP-N1 veya pERFP-N1'in Nhe1 ve bAmH1 bölgelerinde GFP veya RFP'nin n-terminali ile çerçeveleyin. Metin protokolünde belirtilen primerleri kullanarak, standart teknikleri takip ederek Cdk1 ve cyclinB1 genlerini amplifiye edin. Ardından, PCR ürünlerini sindirmek için BamH1 kullanın.

Reaksiyonları %1'lik agaroz jel üzerinde yürütün ve ardından jilet kullanarak doğru boyuttaki DNA fragmanlarını kesin. Daha sonra DNA'yı saflaştırmak için bir jel ekstraksiyon kiti kullanın. Ardından, 1 µg MTS-pEGFP-N1 ve MTS-pERFP-N1 plazmidlerini 1 µL BamH1 ile 37 °C'de 2 saat boyunca sindirin.

Ardından 1 µL buzağı bağırsak alkali fosfataz ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Sindirim ürünlerini %1'lik agaroz jelde yürütüp DNA'yı az önce açıklandığı şekilde saflaştırdıktan sonra, metin protokolünde listelenen reaktifleri kullanarak bir ligasyon reaksiyonu hazırlayın. Daha sonra reaksiyonu 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.

10 µL ligasyon karışımı ile e. coli dH5-alpha kompetan hücreleri transforme edin. Ardından bakterileri, 10 mg/mL kanamisin içeren LB agar plaklarında 37 °C'de gece boyunca büyütün.

Ertesi gün, bir plakadan koloni seçmek için steril bir pipet ucu kullanın. Ardından ucu, 5 milliliters LB kanamycin içeren bir tüpe yerleştirin. Kültürü gece boyunca inkübe edin ve ertesi sabah, plazmidi izole etmek için metin protokolüne uygun olarak bir mini prep kiti kullanın.

Eksponansiyel olarak büyüyen MCF-10A hücrelerini transfekte etmek için, 100 µL serum ve antibiyotik içermeyen ortamda 1:2 oranında plazmid transfeksiyon reaktifi hazırlamak amacıyla Cdk1 veya cyclinB-1 plazmidlerini kullanın. Hücreleri transfekte edin ve 37 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. Mitokondrileri metin protokolüne uygun olarak boyayın ve görüntüleyin.

Hücre ayırma işlemini gerçekleştirmek için, 2,5 mililitre serum ve antibiyotik içermeyen ortamda hazırlanan 1:2 DNA/transfeksiyon reaktanı oranıyla, 6 kuyucuklu plakadaki 2x10⁵ hücreyi istenen vektörlerle transfekte edin. Transfeksiyon için 48 saatlik inkübasyonun ardından, GFP etiketli Cdk-1 ve RFP etiketli cyclinB1 proteinlerini stabil olarak eksprese eden hücreleri, metin protokolüne uygun olarak akış sitometrisi ile canlı olarak ayırın. EdU işaretleme akış sitometrisi analizi ile hücre döngüsü uzunluğunu ölçmek için, ayrıştırılmış hücreleri 6 kuyucuklu plakalara kuyucuk başına 2,5x10⁵ hücre yoğunluğunda ekleyin.

Gece boyu inkübasyonun ardından, kültür ortamına 25 micromolar nihai konsantrasyonda EdU ekleyin ve bir saat daha inkübe edin. Ardından iki saatlik aralıklarla, hücrelerin bulunduğu bir kuyuyu yıkamak için 500 microliters PBS içinde %1BSA kullanın. Ve bir 1.5-milliliter tüpe toplayın.

Hücreleri 350 g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Ardından süpernatanı uzaklaştırın. 100 microliter tespit çözeltisi ekleyerek peleti çözün.

İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri üç kez yıkamak için PBS içinde %1 BSA'dan 1 mililitre kullanın. Daha sonra hücreleri 4 °C'de gece boyunca sabitlemek için %70 etanol'den 0,5 mililitre kullanın.

GFP ve RFP etiketli proteinlerle transfekte edilmiş hücrelerde EdU etiketlemesi yapılırken, GFP ve RFP'den gelen floresan sinyallerin söndürülmesi kritiktir. Bunu başarmak için, %70 etanol kullanarak hücrelerin gece boyunca fiksasyonunun yapıldığı ekstra bir adım ekliyoruz. Ertesi gün, hücreler metin protokolüne uygun olarak yıkandıktan ve permeabilize edildikten sonra, her tüpe 0,5 mililitre reaksiyon kokteyli ekleyin ve iyice karıştırın.

Karanlıkta inkübasyon ve ardından yapılan bir başka yıkama işleminin ardından, DNA'yı boyamak için %1 BSA içeren PBS içerisinde 50 µg/mL propidyum iyodür veya PI kullanın. EdU-pozitif popülasyonu takip etmek için hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin. DNA içeriği ve EdU için boyanmış EdU-işaretli hücrelerin dağılım grafiğini (scattered dot plot) sunun.

670 30-bandpass filtrenin üzerine 685 nanometreden küçük tüm ışıkların düştüğü APC kanalını Alexa 647 EdU için ve 581 15-bandpass filtrenin üzerine 600 nanometreden küçük tüm ışıkların düştüğü phycoerythrin kanalını PI için kullanın. Veri toplama için standart bir kapılama (gating) stratejisi ile, önce morfoloji için FSC alanını SSC alanına göre, ardından hücre boyaması için PI'yi Alexa 647 EdU'ya göre grafiğe dökün. Tüm tüplerin verilerini sırayla, örnek başına 10.000 olay (event) toplayarak kaydedin.

Bu şekilde, mitokondriyal matriks proteini Hsp60 ve intermembran boşluk proteini Timm13, submitokondriyal lokalizasyon belirteçleri olarak kullanılmıştır. Hsp60 ile benzer şekilde, ancak Timm13'ün aksine, cyclinB1 ve Cdk1 tripsin sindiriminden korunmuştur; bu durum, bu proteinlerin mitokondriyal matrikste lokalize olduğunu göstermektedir. Burada, MTS ve GFP etiketli cyclinB1 ve Cdk-1 konstrüktları kullanılarak izole edilen mitokondriyal fraksiyonların Western blotting analizi ile gösterildiği üzere, mitokondrilerde cyclinB1 ve/veya Cdk-1 aşırı ekspresyonu gerçekleştirilmiştir.

Bir EdU pulse-chase deneyi kullanılarak, yaban tip mitochondrial cyclinB1 Cdk-1 eksprese eden hücrelerde, işaretlenmiş S fazı hücrelerinin G2M fazından geçerek 4 saat kadar kısa bir sürede G1 fazında ortaya çıktığı gösterilmiştir. Vektör kontrolü veya mutant cyclinB1 Cdk-1 ile transfekte edilen hücrelerde bu sürenin 6 saat olmasıyla kıyaslandığında, bu durum mitochondrial cyclinB1 Cdk-1 artışının hücre döngüsü ilerlemesini hızlandırdığını göstermektedir. Bu prosedürün ardından, hücre döngüsü kinazı Cdk-1'in mitokondriyal lokalizasyonunun mitokondriyal respirasyonu ve enerji çıktısını nasıl değiştirdiği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla mitokondriyal ATP üretimi, oksijen tüketimi, membran potansiyeli ve reaktif oksijen türleri gibi diğer yöntemler ölçülebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, nükleer bir kinazın mitokondriyal lokalizasyonunu ve mitokondriye özgü fonksiyonlarını nasıl inceleyeceğiniz konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.