Name: Deneysel Yaklaşımlar Mitokondriyal Yerelleşme ve Nükleer Hücre Döngüsü Kinaz, Cdk1 Fonksiyonu Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: Öğrenin, mitokondriyal yerelleşme ve Cdk1 fonksiyonunu incelemek için hücre döngüsü kinazının mitokondri içindeki lokalizasyonunu belirleme yöntemini. Bu teknik, nükleus ve mitokondri arasındaki iletişimi anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, NIH hibeleri CA133402, CA152313 ve Enerji Bakanlığı Bilim Ofisi DE-SC0001271 tarafından desteklenmiştir. NCI P30 CA0933730 ve NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 ve S10 RR 026825 hibelerinden sağlanan finansman ve akış sitometrisi deneylerindeki yardımları için Bayan Bridget McLaughlin ve Bay Jonathan Van Dyke'ın teknik yardımı ile California Üniversitesi Davis Akış Sitometrisi Ortak Kaynak Laboratuvarı'na teşekkür ederiz.

<ol><li>Weinert, T., Hartwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+G2+delay+by+the+rad9+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci+Suppl%22%5BJournal%5D)">Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).</li>
<li>Takizawa, C. G., Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+mitosis+by+changes+in+the+subcellular+location+of+cyclin-B1-Cdk1+and+Cdc25C%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C.</a> Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).</li>
<li>Allan, L. A., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+caspase-9+by+CDK1%2Fcyclin+B1+protects+mitotic+cells+against+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis.</a> Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).</li>
<li>Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+fusion+and+division%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial fusion and division.</a> Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).</li>
<li>Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+converting+NADH%3Aquinone+oxidoreductase+%28complex+I%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I).</a> Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).</li>
<li>Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+analysis+of+the+peripheral+and+membrane+parts+of+mitochondrial+NADH+dehydrogenase+%28complex+I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I).</a> J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).</li>
<li>Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory-chain+NADH+dehydrogenase+%28complex+I%29+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria.</a> Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).</li>
<li>Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+complex+I%3A+structure%2C+function+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial complex I: structure, function and pathology.</a> J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).</li>
<li>Roessler, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+assignment+of+EPR+spectra+to+structurally+defined+iron-sulfur+clusters+in+complex+I+by+double+electron-electron+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).</li>
<li>Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mitochondrial+retrograde+signals+control+the+G1-S+cell+cycle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint.</a> Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B1%2FCdk1+coordinates+mitochondrial+respiration+for+cell-cycle+G2%2FM+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression.</a> Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).</li>
<li>Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-targeting+sequence%2C+a+multi-role+sorting+sequence+recognized+at+all+steps+of+protein+import+into+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria.</a> J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).</li>
<li>Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+heavy+ion+tracks+by+labeling+3%27-OH+termini+of+induced+DNA+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks.</a> J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).</li>
<li>Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history+of+the+initial+application+of+anti-5-BrdU+to+the+detection+and+measurement+of+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase.</a> Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).</li>
<li>Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+%27click%27+reaction+for+labeling+and+detection+of+DNA+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells.</a> Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).</li>
<li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+sensitive+fluorescent+dyes+in+linkage+of+laser+microdissection+and+two-dimensional+gel+electrophoresis+as+a+cancer+proteomic+study+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool.</a> Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).</li>
<li>Gundry, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+10%2C+Preparation+of+proteins+and+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+a+bottom-up+proteomics+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25(2009).</li>
<li>Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavies%2C+D+%22Flow+Cytometry%22">Flow Cytometry</a>. Macey, M. G. , Humana Press. 257-276 (2007).</li>
<li>van den Heuvel, S., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+cyclin-dependent+kinases+in+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control.</a> Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).</li>
<li>Terry, N. H. A., White, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+after+bromodeoxyuridine+labeling+to+measure+S+and+G2%2BM+phase+durations+plus+doubling+times+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protcols%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo.</a> Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).</li>
<li>Becker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preprotein+translocase+of+the+outer+mitochondrial+membrane%3A+reconstituted+Tom40+forms+a+characteristic+TOM+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore.</a> J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).</li>
<li>Karniely, S., Pines, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+translation--dual+destination%3A+mechanisms+of+dual+protein+targeting+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes.</a> EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).</li>
<li>Candas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyclinB1%2FCdk1+phosphorylates+mitochondrial+antioxidant+MnSOD+in+cell+adaptive+response+to+radiation+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress.</a> J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).</li>
<li>Nantajit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B1%2FCdk1+phosphorylation+of+mitochondrial+p53+induces+anti-apoptotic+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response.</a> PLoS One. 5 (8), e12341(2010).</li>
<li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+based+on+click+chemistry%2C+which+overcomes+limitations+of+cell+cycle+analysis+by+classical+determination+of+BrdU+incorporation%2C+allowing+multiplex+antibody+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining.</a> Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).</li>
<li>Niwa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+nature+of+the+light+emitter+of+the+Aequorea+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Marouga, R., David, S., Hawkins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+DIGE+system%3A+2D+fluorescence+difference+gel+analysis+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology.</a> Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).</li>
<li>Timms, J. F., Cramer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Difference gel electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).</li>
<li>Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrane%2C+J+%22BD+Biosciences+Appl+Notes%22">BD Biosciences Appl Notes</a>. , (2011).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Diğer hücre içi organellere için mukadder proteinler gibi, mitokondriyal hedeflenen proteinler ayrıntılı protein translocating ve katlama makineleri 21,22 yardımı ile organel onları yönlendirmek onların birincil veya ikincil yapı içinde hedefleme sinyalleri sahiptirler. Bu COX8 olarak sadece mitokondriyal yerleşik proteinlerden elde dizileri (MTS) hedefleme mitokondri, mitokondri 11,23,24 üzerine belirli proteinleri hedef için bir gen sekansının N-terminalinden eklenebilir. Burada, CyclinB1 ve Cdk1...

Memelilerde, hücre döngüsü ilerlemesinin siklinlerin ve sikline bağımlı kinazların (cdk&#39;lar) 1 ile kontrol çok düzenli olaylar bağlıdır. Onun sitoplazmik, nükleer ve centrosomal lokalizasyon yoluyla, CyclinB1 / Cdk1 nükleer zarf arıza ve sentrozom ayırma 2 olarak mitoz farklı etkinlikleri senkronize edebiliyor. CyclinB1 / Cdk1 apoptoz 3 karşı mitoz hücreleri korur ve mitokondriyal fisyon, yeni kurulan yavru hücreye 4 mitokondri eşit dağılımı için kritik bir adım teşvik etmektedir. Memeli hücre çoğalmasına olarak mitokondriyal ATP 5 çoklu alt birim kompleksi oluşur oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) makinelerini (elektron nakil zinciri) ile oluşturulur; kompleks I - Karmaşık V (CI-CV). Nikotinamid adenin dinükleotid (NADH): ubiquinone oksidoredüktazı ya da karmaşık I (CI), beş komplekslerinin 5 anlaşılan en az olur. karmaşık Cı45 alt birimden 14 onsists katalitik çekirdeğini oluşturur. Bir kez karmaşık bir kol matris ve iç zarı 6,7 gömülü diğer kol içine çıkıntılı bir L şeklinde bir yapı varsayar toplandı. Cl alt birimleri mutasyonlar mitokondriyal bozuklukların 8 çeşitli nedenidir. OXPHOS işlevsel olarak etkili bir CI genel mitokondriyal solunum 9, aynı zamanda, başarılı hücre döngüsü ilerlemesinin 10 için de gereklidir. Sağlıkta ve hastalıkta bu membran bağlı enzim kompleksinin işleyişini altında yatan mekanizmaları aydınlatmak yeni tanı yöntemleri ve gelişmiş tedavi stratejilerinin geliştirilmesini sağlayabilir. Yeni bir çalışmada, biz CyclinB1 / Cdk1 kompleksi hücrenin sırasında hücrelerin artan enerji ihtiyaçlarını karşılamak için (Gap 2) G2 / (Mitoz) M fazında mitokondri içine translocates ve potansiyel mitokondriyal enerji üretimini artırmak için CI alt birimleri fosforile bulduk döngüsü 11. Burada shoDeneysel prosedürler ve aksi çekirdek / sitoplazmik kinaz mitokondriyal translokasyon incelemek için kullanılabilir stratejileri Mitokondriyal substratlar yanı sıra örnek olarak CyclinB1 / CDK1 kullanarak mitokondriyal yerelleştirme fonksiyonel sonuçlarını wcase. gerekli mitokondri özgü aşırı ekspresyonu ve bu kompleksin demonte çalışmaları istendiğinde CyclinB1 / Cdk1 kompleksi mitokondri içine translocates bulgu. Proteinlerin mitokondriye özgü ekspresyonunu elde etmek için, tek bir ilgili proteinin N-ucunda bir mitokondri hedefleme sekansı (MTS) ekleyin. Dizileri hedef Mitokondri normalde 12 ikamet mitokondri içine mitokondriyal proteinlerin sıralama izin verir. Bu CyclinB1 veya kırmızı flöresanlı etiketli insan sitokrom C oksidaz alt-birimi 8A (COX8) öncüsü elde edilen bir 87 baz mitokondri hedefleme sekansı kullanılabilir ve yeşil floresan proteini (GFP) içine klonladıkProtein (RFP) Cdk1 çerçeve içinde plazmaları ihtiva etiketli. Bu yöntem, özellikle nükleer havuz etkilemeden bu proteinlerin mitokondriyal ifadesini değiştirerek, bize mitokondri içine CyclinB1 ve CDK1 hedeflemesine izin. floresan bu proteinleri etiketleyerek, biz gerçek zamanlı olarak yerelleştirme izlemek için başardık. Benzer şekilde, bize özellikle CDK1 mitokondriyal ifade ve işlevleri yıkmak için izin RFP etiketli baskın negatif Cdk1 içeren bir plazmid içine MTS girmiştik. CDK1 gibi çift lokalizasyonu sahip kinazlar, mitokondri ve çekirdek fonksiyonları arasında ayırt etmek için gereklidir. Bu çift fonksiyonlu kinazlann, N-terminaline Mühendislik MTS kullanılabilir kolay ve etkili olan büyük bir strateji vardır. Cdk1 bir hücre döngüsü kinaz olduğundan, Cdk1 mitokondri içine lokalize olduğunda hücre döngüsü ilerlemesini belirlemek için esastır. Bunu başarmak için, yeni bir yöntemii kullanmış olmasıd hücrelerde DNA içeriği izlemek için. Geleneksel yöntemler timidin yerine hücre döngüsünün S fazında yeni sentezlenmiş DNA içine içermektedir BrdU (bromodeoksiüridin), sentetik timidin analogu, kullanmayı içerir. Daha sonra aktif olarak kopyalayan DNA hücreler, anti-BrdU antikoru kullanılarak tespit edilebilir. Bu yöntemin bir dezavantajı, sonuç 13,14 arasında bir tutarsızlık ile sonuçlanabilir asit ya da ısı işlemi gibi sert yöntemlerle BrdU antikoru için erişim sağlamak için DNA denatürasyon gerektirmesidir. Alternatif olarak, biz farklı bir timidin analoğu, Edu ile aktif bölünen hücreleri izlemek için benzer bir yaklaşım kullanılmıştır. yumuşak deterjan işleme yeni sentezlenen DNA edu ulaşmak için saptama reajanı sağlayan şekilde edu algılama sert bir DNA denaturasyon gerektirmez. Edu yöntem daha güvenilir, tutarlı ve yüksek verimlilik analizi 15 potansiyeli olan kanıtlanmıştır. Son olarak, to CDK1 mitokondriyal substratlar belirlemek, klasik iki boyutlu jel elektroforezi gelişmiş bir sürümüdür 2D-DIGE adında bir proteomik aracı kullanılır. İki boyutlu elektroforez ile birinci boyut ve molekül ağırlığı izoelektrik noktasına göre proteinleri ayıran. fosforilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlar proteinlerin izoelektrik noktası ve moleküler ağırlık etkilediğinden, 2D jelleri farklı örnek içindeki proteinlerin fosforilasyon durumlarını arasındaki farkları belirleyebilir. protein boyutu (bölge ve yoğunluğu), birden çok örnekler arasında niceliksel karşılaştırılmasına izin veren, protein ekspresyon seviyesi ile değişiklik görür. Bu yöntemi kullanarak, mutant mitokondri hedefli Cdk1 eksprese eden hücreler karşı yabani tip fosforile proteinleri ayırt etmek mümkün oldu. Yabani tip gösterdi ama mitokondri hedefli mutant Cdk1 hazırlık eksik spesifik protein spotları izole edildi vekütle spektrometresi aracılığıyla belirledi. Geleneksel 2D jelleri içinde, trifenilmetan boyalar jeli üzerinde proteinleri görselleştirmek için kullanılır. 2D-DIGE proteini elektroforetik mobilite üzerine minimal etkisi ile floresan protein etiketleri kullanır. Farklı protein numuneleri farklı floresan boyalar, karıştırılır ve tek bir jel 16 üzerinde birden çok numune eş elektroforez sağlayan aynı jeller ayrılmış ile etiketlenebilir. Bu jel bazlı proteomik çalışmalarda önemli bir problemdir jel için jel varyasyonları en aza indirir.

<table><tbody><tr><td>32P ATP&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU002001MC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare ikincil antikoru</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A-11003</td><td>Alexa-546 konjuge</td></tr><tr><td>Anti-tavşan ikincil antikoru</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A11029</td><td>Alexa-488 konjuge</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Araştırma Organikleri</td><td>1166A</td><td>in vitro kinaz testi için</td></tr><tr><td>Cdk1 antikoru</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>9112</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1 kinaz tamponu</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Görüntüleme Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>C10337</td><td>EdU etiketlemeli</td></tr> <tr><td>hücre döngüsü analizi için</td><td>Mitokondriyal immün boyama için</td>COX IV antikor <td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>4844S</td></tr><tr><td>Siklin B1 antikoru</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-752</td><td></td></tr><tr><td>CyclinB1 / Cdk1 enzim kompleksi</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td>Donmayı/çözülmeyi önleyin</td></tr><tr><td>CyDye DIGE Fluor Etiketleme Kiti</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>DIGE Jel ve DIGE Tampon Kiti</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>28-9480-26 AA</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamid&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319937</td><td>DMF</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0611</td><td>DTT</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>EMD Millipore</td><td>71004</td><td>Sahaya yönelik mutajenez</td></tr><tr><td>için Dpn I enzimi</td><td>Stratagene</td><td>200519-53</td><td>Sahaya yönelik mutajenez için</td></tr><tr><td>Kuru Şerit kapak sıvısı</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1335-01</td><td>Mineral yağ</td></tr><tr><td>EDTA olarak kullanılır</td><td>J.T. Baker</td><td>4040-03</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Vacufuge Konsantratörü</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td>Vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcı olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Solmaya karşı dayanıklı montaj çözümü</td></tr><tr><td>Fortessa Akış Sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td>649908</td><td>Hücre döngüsü için EdU etiketleme ile analiz</td></tr><tr><td>Histone H1</td><td>Calbiochem</td><td>382150</td><td>İn vitro kinaz testi için</td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Agaroz jellerinden DNA fragmanlarını saflaştırmak için</td></tr><tr><td>İmmobilin DryStrip Jeller</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>18-1016-61</td><td>IEF (izoelektrik odaklama) şeritleri</td></tr><tr><td>İmmobilize Glutatyon</td><td>Thermo Scientific</td><td>15160</td><td>Glutatyon-agaroz boncuklar</td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>IAA</td></tr><tr><td>IPGphor 3 İzoelektrik Odaklama Ünitesi</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>11-0033-64</td><td>IPGfor şerit tutucular</td></tr><tr><td>İzopropil-b-D-tiyo-galaktopiranosid&nbsp;</td><td>RPI Corp</td><td>156000-5.0</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9783</td><td>Hücre lizis tamponu için</td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11668027</td><td>Transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Lizin</td><td>Sigma</td><td>Aldrich L5501</td><td>CyDye etiketleme için</td></tr><tr><td>Lizozim</td><td>EMD Kimyasalları</td><td>5960</td><td></td></tr><tr><td>Mitoctracker Kırmızı / Yeşil</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>M7512 / M7514</td><td>Mitokondriyal floresan boyalar</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>EMD Kimyasalları</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1</td><td>Clonetech</td><td>6085-1</td><td>GFP ifade eden vektör</td></tr><tr><td>Pfu</td><td>Stratagene</td><td>600-255-52</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-5X-1 &nbsp;</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>28-9545-53</td><td>GST ifade eden vektör</td></tr><tr><td>Fenilmetilsülfonil florür</td><td>Shelton Scientific</td><td>IB01090</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Spectra/Por 4 diyaliz tüpü diyaliz</td><td>için gözenekli membran tüpü olarak</td><td>Spectrum Labs</td><td>132700</td></tr><tr><td>Pro-Q Elmas Fosfoprotein Jel Lekesi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>P-33300</td><td>2D jeller üzerinde fosfoproteinleri boyamak için</td></tr><tr><td>Proteinaz inhibitör kokteyli</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td>Hücre lizis tamponu için</td></tr><tr><td>QuikChange bölgeye yönelik mutajenez kiti</td><td>Stratagene</td><td>200519-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>MiniPrep Plazmid İzolasyon Kiti</td></tr><tr><td>RO-3306</td><td>Alexis Biyokimyasallar</td><td>270-463-M001</td><td>Cdk1 inhibitörü</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>MP Biyomedikal</td><td>150154</td><td>Kompleks I inhibitörü</td></tr><tr><td>Sodyum karbonat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S93359</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>EMD Kimyasalları</td><td>SX0420-5</td><td>Hücre lizis tamponu için</td></tr><tr><td>Sodyum ortovanadat</td><td>MP Biyomedikal</td><td>159664</td><td>Hücre lizis tamponu için</td></tr><tr><td>Sodyum pirofosfat dekahidrat</td><td>Alfa Aesar</td><td>33385</td><td>Hücre lizis tamponu için</td></tr><tr><td>Sodyum ve beta;-gliserofosfat</td><td>Alfa Aesar</td><td>L03425</td><td>Hücre lizis tamponu için</td></tr><tr><td>SpectraMax M2e&nbsp;</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>M2E</td><td>Mikroplaka okuyucu</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Doku Öğütücü havaneli</td><td>Kimble Chase</td><td>885301-0007</td><td>Mitokondri izolasyonu için</td></tr><tr><td>Doku Öğütücü tüp</td><td>Kimble Chase</td><td>885303-0007</td><td>Mitokondri izolasyonu için</td></tr><tr><td>Trikloroasetik asit çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td>TCA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biyomedikal</td><td>103133</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Teknova</td><td>T1105</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Calbiochem</td><td>650211</td><td></td></tr><tr><td>Tayfun Görüntüleyici</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>28-9558-09</td><td>Lazer jel tarayıcı fro 2D-DIGE</td></tr><tr><td>Ubiquinone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7956</td><td></td></tr></tbody></table>

deneysel yaklaşımlar mitokondriyal yerelleşme ve nükleer hücre döngüsü kinaz, cdk1 fonksiyonu eğitim için

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Mitokondri kendi transkripsiyon mekanizmasına sahip olmasına rağmen, mitokondriyal proteinlerin sadece %1'i organel içinde sentezlenir. Nükleer olarak kodlanmış proteinler, mitokondri hedefleme dizileri (MTS) tarafından yönlendirilen mitokondriye taşınır; bununla birlikte, mitokondriyal lokalize proteinlerin çoğu tanımlanabilir bir MTS'den yoksundur. Bununla birlikte, MTS'nin proteinlere mitokondriye girme talimatı verebilmesi, normalde nükleer ve / veya sitoplazmik proteinlerin mitokondriyal fonksiyonlarını incelemek için değerli bir araç sağlar. Yakın zamanda mitokondride hücre döngüsü kinaz CyclinB1 / Cdk1 kompleksini tanımladık. Bu kompleksin mitokondriyal fonksiyonlarını spesifik olarak incelemek için, bu kompleksin nükleer veya sitoplazmik fonksiyonlarına müdahale etmeden mitokondriyal aşırı ekspresyonu ve yıkılması gerekliydi. CyclinB1 / Cdk1'i MTS ile etiketleyerek, mitokondriyal hedeflerini ve işlevlerini incelemek için bu kompleksin mitokondriyal aşırı ekspresyonunu elde edebildik. Baskın-negatif Cdk1'in MTS ile etiketlenmesi yoluyla, özellikle mitokondride Cdk1 aktivitesinin inhibisyonu gerçekleştirildi. CyclinB1 / Cdk1 kompleksinin potansiyel mitokondriyal hedefleri, jel bazlı bir proteomik yaklaşım kullanılarak tanımlandı. Geleneksel 2D jel analizinden farklı olarak, mitokondriyal Cdk1 eksprese eden hücrelerde diferansiyel olarak fosforile proteinleri floresan olarak etiketlemek için 2 boyutlu fark jel elektroforezi (2D-DIGE) teknolojisini ve ardından fosfoprotein boyamayı kullandık. Baskın negatif Cdk1 taşıyan mitokondriye karşı vahşi tipte değişen fosfoprotein lekelerinin tanımlanması, Cdk1'in mitokondriyal hedeflerinin kimliğini ortaya çıkardı. Son olarak, CyclinB1 / Cdk1 mitokondriyal lokalizasyonunun hücre döngüsü ilerlemesindeki etkisini belirlemek için, hücreleri hücre döngüsünden geçerken izlemek ve DNA'larını kopyalamak için sentetik bir timidin analoğu EdU (5-etinil-2'-deoksiuridin) kullanan bir hücre proliferasyon testi kullanıldı. Toplamda, bir hücre döngüsü kinazının mitokondriyal lokalizasyonunu ve aktivitesini incelemek için mevcut çeşitli yaklaşımları gösterdik. Bunlar, birçok hücre biyolojisi araştırmacısı için faydalı olacak gelişmiş, ancak takip etmesi kolay yöntemlerdir.

CyclinB1 ve CDK1 Alt mitokondrial yerelleştirme Sodyum karbonat ekstraksiyonu, bir protein mitokondri içinde ya da dış yüzeyi, yani, dış zar üzerinde yer olup olmadığını belirlemek için kullanılır. bir protein mitokondri içinde lokalize olduğu gösterilmiştir sonra, alt mitokondriyal yerelleştirme daha belirlenmesi proteaz sindirimi ile birlikte mitoplasting ile yapılabilir. CyclinB1 ya CDK1 alt mitokondriyal y...

Burada, bir (hücre döngüsü) kinazın mitokondriyal lokalizasyonunun nasıl çalışılacağını ve alt mitokondriyal konumunun yanı sıra potansiyel mitokondriyal substratların/hedeflerin nasıl belirleneceğini ana hatlarıyla açıklıyoruz. Proteinlerin mitokondriye zorla ekspresyonu, ilgilenilen bir proteinin mitokondriyal lokalizasyonunun fonksiyonel sonuçlarını incelemek için yararlı bir araç sağlar.

Deneysel Yaklaşımlar Mitokondriyal Yerelleşme ve Nükleer Hücre Döngüsü Kinaz, Cdk1 Fonksiyonu Eğitim için

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, normalde nükleer olan bir hücre döngüsü kinazının submitokondriyal lokalizasyonunu belirlemek ve ardından mitokondriyal lokalizasyonun hücre döngüsü ilerlemesini nasıl etkilediğini analiz etmektir. Bu yöntem, hücre döngüsü sırasında çekirdeğin mitokondrilerle nasıl iletişim kurduğu gibi mitokondriyal araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Proteinleri bir mitokondriyal yönlendirici dizi ile etiketleyerek, proteinlerin mitokondrideki spesifik aşırı ekspresyonlarından yararlanabilir ve böylece onların mitokondriye özgü işlevlerini inceleyebiliriz.Bu yöntem belirli proteinlerin mitokondri hedeflemesi hakkında bilgi sağlayabilse de çekirdek, ER, golgi ve lizozom gibi diğer organellere de uygulanabilir. Hücreleri metin protokolüne uygun olarak kültürledikten, homojenize ettikten ve pelletledikten sonra süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Ardından örneği 7,000 g ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından pellet'i yeniden süspande etmek için 200 µL buz soğukluğunda IBC tamponu kullanın ve homojenatı iki alikota bölün. Örnekleri 7.000 g ve 4 °C'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Yıkama işlemini tekrarlayın.Süpernatant atıldıktan sonra, pelletlerden birine 30 µL hücre lizis tamponu ekleyin ve lizatı immunoblotleme için -80 °C'de saklayın. Çözünür ve membrana bağlı proteinleri ayırmak için ikinci pellet ile sodyum karbonat ekstraksiyonu gerçekleştirmek üzere, 250 µL 0,1 M sodyum karbonat (pH 11,0) ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. 100.000 g'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından süpernatantı toplayın ve proteinleri çöktürmek için üzerine taze hazırlanmış, %20 trichloroacetic acid'den eşit hacimde ekleyin. 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Bu sırada, pelete 30 µL hücre liziz tamponu ekleyin ve immunoblotting için -80 °C'de saklamadan önce metin protokolüne göre sonikasyon uygulayın.30 dakikalık TCA inkübasyonundan sonra, reaksiyonu 10 dakika boyunca 15,000 g ile santrifüj edin. Süpernatantı atın, ardından pelleti yeniden süspande etmek için 80 µL hücre liziz tamponu kullanın. Metin protokolünde açıklandığı şekilde hücrelerden mitokondriyal fraksiyonları izole ettikten sonra, mitokondriyal fraksiyonları 10 eşit porsiyona ayırın.Numuneleri 7.000 g'de ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. Her bir peleti çözmek için tripsin içeren veya içermeyen, farklı konsantrasyonlardaki hipotonik sükroz tamponlarından 30 µL kullanın. Ardından 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.Tripsin sindirimini durdurmak için tripsin içeren tüplere 3 µL 10 mM PMSF ekleyin. Ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Örnekleri 14,000 g'de ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Peleti liz etmek için 30 microliters hücre liz tamponu ekleyin. Örnekleri metin protokolünde açıklandığı şekilde sonike edin ve 80 degrees Celsius'ta saklayın.Mitokondri hedefli GFP/RFP etiketli cyclinB-1 Cdk-1 vektörlerini oluşturmak için, standart moleküler klonlama tekniklerini kullanarak insan sitokrom-c oksidaz alt birim 8A öncülünden mitokondri hedefleme dizisini klonlayın ve pEGFP-N1 veya pERFP-N1'in Nhe1 ve bAmH1 bölgelerinde GFP veya RFP'nin n-terminali ile çerçeveleyin. Metin protokolünde belirtilen primerleri kullanarak, standart teknikleri takip ederek Cdk1 ve cyclinB1 genlerini amplifiye edin. Ardından, PCR ürünlerini sindirmek için BamH1 kullanın.Reaksiyonları %1'lik agaroz jel üzerinde yürütün ve ardından jilet kullanarak doğru boyuttaki DNA fragmanlarını kesin. Daha sonra DNA'yı saflaştırmak için bir jel ekstraksiyon kiti kullanın. Ardından, 1 µg MTS-pEGFP-N1 ve MTS-pERFP-N1 plazmidlerini 1 µL BamH1 ile 37 °C'de 2 saat boyunca sindirin.Ardından 1 µL buzağı bağırsak alkali fosfataz ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Sindirim ürünlerini %1'lik agaroz jelde yürütüp DNA'yı az önce açıklandığı şekilde saflaştırdıktan sonra, metin protokolünde listelenen reaktifleri kullanarak bir ligasyon reaksiyonu hazırlayın. Daha sonra reaksiyonu 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.10 µL ligasyon karışımı ile e. coli dH5-alpha kompetan hücreleri transforme edin. Ardından bakterileri, 10 mg/mL kanamisin içeren LB agar plaklarında 37 °C'de gece boyunca büyütün.Ertesi gün, bir plakadan koloni seçmek için steril bir pipet ucu kullanın. Ardından ucu, 5 milliliters LB kanamycin içeren bir tüpe yerleştirin. Kültürü gece boyunca inkübe edin ve ertesi sabah, plazmidi izole etmek için metin protokolüne uygun olarak bir mini prep kiti kullanın.Eksponansiyel olarak büyüyen MCF-10A hücrelerini transfekte etmek için, 100 µL serum ve antibiyotik içermeyen ortamda 1:2 oranında plazmid transfeksiyon reaktifi hazırlamak amacıyla Cdk1 veya cyclinB-1 plazmidlerini kullanın. Hücreleri transfekte edin ve 37 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. Mitokondrileri metin protokolüne uygun olarak boyayın ve görüntüleyin.Hücre ayırma işlemini gerçekleştirmek için, 2,5 mililitre serum ve antibiyotik içermeyen ortamda hazırlanan 1:2 DNA/transfeksiyon reaktanı oranıyla, 6 kuyucuklu plakadaki 2x10⁵ hücreyi istenen vektörlerle transfekte edin. Transfeksiyon için 48 saatlik inkübasyonun ardından, GFP etiketli Cdk-1 ve RFP etiketli cyclinB1 proteinlerini stabil olarak eksprese eden hücreleri, metin protokolüne uygun olarak akış sitometrisi ile canlı olarak ayırın. EdU işaretleme akış sitometrisi analizi ile hücre döngüsü uzunluğunu ölçmek için, ayrıştırılmış hücreleri 6 kuyucuklu plakalara kuyucuk başına 2,5x10⁵ hücre yoğunluğunda ekleyin.Gece boyu inkübasyonun ardından, kültür ortamına 25 micromolar nihai konsantrasyonda EdU ekleyin ve bir saat daha inkübe edin. Ardından iki saatlik aralıklarla, hücrelerin bulunduğu bir kuyuyu yıkamak için 500 microliters PBS içinde %1BSA kullanın. Ve bir 1.5-milliliter tüpe toplayın.Hücreleri 350 g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Ardından süpernatanı uzaklaştırın. 100 microliter tespit çözeltisi ekleyerek peleti çözün.İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri üç kez yıkamak için PBS içinde %1 BSA'dan 1 mililitre kullanın. Daha sonra hücreleri 4 °C'de gece boyunca sabitlemek için %70 etanol'den 0,5 mililitre kullanın.GFP ve RFP etiketli proteinlerle transfekte edilmiş hücrelerde EdU etiketlemesi yapılırken, GFP ve RFP'den gelen floresan sinyallerin söndürülmesi kritiktir. Bunu başarmak için, %70 etanol kullanarak hücrelerin gece boyunca fiksasyonunun yapıldığı ekstra bir adım ekliyoruz. Ertesi gün, hücreler metin protokolüne uygun olarak yıkandıktan ve permeabilize edildikten sonra, her tüpe 0,5 mililitre reaksiyon kokteyli ekleyin ve iyice karıştırın.Karanlıkta inkübasyon ve ardından yapılan bir başka yıkama işleminin ardından, DNA'yı boyamak için %1 BSA içeren PBS içerisinde 50 µg/mL propidyum iyodür veya PI kullanın. EdU-pozitif popülasyonu takip etmek için hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin. DNA içeriği ve EdU için boyanmış EdU-işaretli hücrelerin dağılım grafiğini (scattered dot plot) sunun.670 30-bandpass filtrenin üzerine 685 nanometreden küçük tüm ışıkların düştüğü APC kanalını Alexa 647 EdU için ve 581 15-bandpass filtrenin üzerine 600 nanometreden küçük tüm ışıkların düştüğü phycoerythrin kanalını PI için kullanın. Veri toplama için standart bir kapılama (gating) stratejisi ile, önce morfoloji için FSC alanını SSC alanına göre, ardından hücre boyaması için PI'yi Alexa 647 EdU'ya göre grafiğe dökün. Tüm tüplerin verilerini sırayla, örnek başına 10.000 olay (event) toplayarak kaydedin.Bu şekilde, mitokondriyal matriks proteini Hsp60 ve intermembran boşluk proteini Timm13, submitokondriyal lokalizasyon belirteçleri olarak kullanılmıştır. Hsp60 ile benzer şekilde, ancak Timm13'ün aksine, cyclinB1 ve Cdk1 tripsin sindiriminden korunmuştur; bu durum, bu proteinlerin mitokondriyal matrikste lokalize olduğunu göstermektedir. Burada, MTS ve GFP etiketli cyclinB1 ve Cdk-1 konstrüktları kullanılarak izole edilen mitokondriyal fraksiyonların Western blotting analizi ile gösterildiği üzere, mitokondrilerde cyclinB1 ve/veya Cdk-1 aşırı ekspresyonu gerçekleştirilmiştir.Bir EdU pulse-chase deneyi kullanılarak, yaban tip mitochondrial cyclinB1 Cdk-1 eksprese eden hücrelerde, işaretlenmiş S fazı hücrelerinin G2M fazından geçerek 4 saat kadar kısa bir sürede G1 fazında ortaya çıktığı gösterilmiştir. Vektör kontrolü veya mutant cyclinB1 Cdk-1 ile transfekte edilen hücrelerde bu sürenin 6 saat olmasıyla kıyaslandığında, bu durum mitochondrial cyclinB1 Cdk-1 artışının hücre döngüsü ilerlemesini hızlandırdığını göstermektedir. Bu prosedürün ardından, hücre döngüsü kinazı Cdk-1'in mitokondriyal lokalizasyonunun mitokondriyal respirasyonu ve enerji çıktısını nasıl değiştirdiği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla mitokondriyal ATP üretimi, oksijen tüketimi, membran potansiyeli ve reaktif oksijen türleri gibi diğer yöntemler ölçülebilir.Bu videoyu izledikten sonra, nükleer bir kinazın mitokondriyal lokalizasyonunu ve mitokondriye özgü fonksiyonlarını nasıl inceleyeceğiniz konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

experimental-approaches-to-study-mitochondrial-localization-function

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

FRET tabanlı gazetecilere giderek canlı hücre kinaz ve fosfataz aktiviteleri izlemek için kullanılır. Burada hedef fosforilasyon hücre döngüsü bağımlı değişiklikleri değerlendirmek için FRET tabanlı gazetecilere nasıl kullanılacağı hakkında bir metodu tanımlar.

Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

Geçiş anafaz-teşvik kompleksi (APC / C)-bağımlı ubikuitinasyon ve burada siklin B. sonraki yıkım, biz, darbe-kovalamaca etiketleme sonrasında, bir sistem kurulmuş tüm hücre popülasyonlarında siklin B proteoliz izleme sağlar ve tetiklenir anafaz için metafaz mitotik geçiş noktasından müdahale tespitini kolaylaştırır.

Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisinin analizi, mitokondriyal işlevselliğin düzenleyici mekanizmalarının tam olarak anlaşılması için gereklidir. Canlı ve sabit Drosophila yumurtalıklarında mitokondriyal yapı ve fonksiyonu incelemek için özel yöntemler bu yazıda açıklanmış ve gösterilmiştir.

Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi Drosophila Yumurtalıklar

Bu protokol, hücre farklılaşması ve Xenopus embriyonik gelişimi sırasında mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) aktivitesini modüle etmek için bir optogenetik strateji tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip Xenopus embriyoları gibi memeli hücre kültüründe ve çok hücreli canlı organizmalarda MAPK sinyal yolağının geri dönüşümlü aktivasyonuna izin verir.

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Gelişim

Biz bir protokol yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu kullanılarak analiz tarafından takip HeLa hücreleri Çift Kişilik timidin eşitlenmesi için mevcut. Bu yöntem de interfaz işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri üzerinde çalışmalar etkinleştirme mitoz, zaman uyumlu olarak S faz geçin hücreleri çok sayıda elde anahtarıdır.

Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

Siklin bağımlı kinaz 1 (Cdk1) hücre döngüsünün G2 aşamasında aktif ve birçok hücresel yolları düzenler. Burada, bir vitro kinaz tahlil için bir protokol ile bu önemli kinaz hücresel hedefleri oluşturmak üzere Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlaması sağlar Cdk1 mevcut.

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Burada mil oluşumu ve mitotik progresyon dinamiklerini değerlendirmek için bir protokol sıyoruz. Hızlandırılmış görüntüleme uygulamamız, kullanıcının mitozbölünmenin çeşitli aşamalarındaki hücreleri belirlemesini, mitotik defektleri izlemesini ve tanımlamasını ve anti-mitotik ilaçlara maruz kalındığında mil dinamiği ve mitotik hücre kaderini analiz etmesini sağlar.

Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi

Baker mayası mitokondriyal genom sekiz polipeptid kodlar. Mevcut protokolün amacı, hepsini etiketlemek ve daha sonra bunları ayrı bantlar olarak görselleştirmektir.

Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Transmitokondrial sibridler, mitokondriyal DNA (mtDNA) tükenmiş hücrelerin (rho0 hücreleri) mitokondriyal bozukluklardan etkilenen hastalardan türetilen sitoplastlarla (enüklee hücreler) kaynaştırılmasıyla elde edilen melez hücrelerdir. Hastalığın nükleer veya mitokondriyal kökeninin belirlenmesine, biyokimyasal aktivitenin değerlendirilmesine ve mtDNA ile ilişkili varyantların patogenetik rolünün doğrulanmasına izin verir.

Mitokondriyal Disfonksiyonu Incelemek İçin In Vitro Bir Yaklaşım: Bir Cybrid Modeli

Bu protokol, yaşlanma sırasında C. elegans'ın çoklu dokularında mitokondriyal morfolojiyi görüntülemek için standart bir yaklaşım sağlar.

Yaşlanma Sırasında C. elegans'ta Mitokondriyal Morfolojinin Görüntülenmesi ve Ölçülmesi

Bu makale, Dendra2 foto-anahtarlama floresansı yoluyla mitokondriyal fisyon/füzyon dinamiklerini değerlendirmek için konfokal mikroskopi ve ImageJ'nin kullanımını açıklamaktadır.

Böbrek Proksimal Tübüler Hücrelerinde Mitokondriyal Fisyon/Füzyon Dinamiklerinin Değerlendirilmesi

Öğrenin, mitokondriyal yerelleşme ve Cdk1 fonksiyonunu incelemek için hücre döngüsü kinazının mitokondri içindeki lokalizasyonunu belirleme yöntemini. Bu teknik, nükleus ve mitokondri arasındaki iletişimi anlamaya yardımcı olur.

Deneysel Yaklaşımlar Mitokondriyal Yerelleşme ve Nükleer Hücre Döngüsü Kinaz, Cdk1 Fonksiyonu Eğitim için

Daha fazla video keşfet