Deneysel Yaklaşımlar Mitokondriyal Yerelleşme ve Nükleer Hücre Döngüsü Kinaz, Cdk1 Fonksiyonu Eğitim için

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, normal bir nükleer hücre döngüsü kinazının submitochondrial lokalizasyonunu belirlemek ve daha sonra mitokondriyal lokalizasyonunun hücre döngüsünün ilerlemesini nasıl etkilediğini analiz etmektir. Bu yöntem, hücre döngüsü sırasında çekirdeğin mitokondri ile nasıl iletişim kurduğu gibi mitokondriyal araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Proteinleri bir mitokondri öncü dizisi ile etiketleyerek, mitokondrideki proteindeki aşırı ifadelerden özellikle yararlanabiliriz, böylece mitokondriye özgü işlevlerini inceleyebiliriz.

Bu yöntem, belirli proteinlerin mitokondri hedeflemesi hakkında bilgi sağlayabilse de, çekirdek, ER, golgi ve lizozom gibi diğer organellere de uygulanabilir. Metin protokolüne göre hücreleri kültürledikten, homojenize ettikten ve peletledikten sonra, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Ve numuneyi 7.000 g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Daha sonra peleti yeniden süspanse etmek için 200 mikrolitre buz gibi IBC tamponu kullanın ve homojenatı iki alikota bölün. Numuneleri tekrar 7.000 g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ve yıkamayı tekrarlayın.

Süpernatanı attıktan sonra, peletlerden birine 30 mikrolitre hücre lizis tamponu ekleyin ve immünoblotlama için lizatı 80 santigrat derecede saklayın. Çözünür ve zara bağlı proteinleri ayırmak için ikinci pelet ile sodyum karbonat ekstraksiyonu yapmak için 250 mikrolitre 0.1 molar sodyum karbonat pH 11.0 ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. 20 dakika boyunca 100.000 g'da santrifüjleyin.

Daha sonra süpernatanı toplayın ve proteinleri çökeltmek için eşit hacimde taze yapılmış% 20 trikloroasetik asit ekleyin. 30 dakika buz üzerinde tutun. Bu arada, pelete 30 mikrolitre hücre lizis tamponu ekleyin ve immünoblotlama için 80 santigrat derecede saklamadan önce metin protokolüne göre sonikat yapın.

30 dakikalık TCA inkübasyonundan sonra, reaksiyonu 10 dakika boyunca 15.000 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın, ardından peleti yeniden süspanse etmek için 80 mikrolitre hücre lizis tamponu kullanın. Mitokondriyal fraksiyonları metin protokolünde açıklandığı gibi hücrelerden izole ettikten sonra, mitokondriyal fraksiyonları 10 eşit parçaya ayırın.

Numuneleri 7.000 g ve 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca peletleyin. Her bir peleti çözmek için tripsin içeren veya içermeyen bir dizi konsantrasyonda hipotonik sükroz tamponundan 30 mikrolitre kullanın. Ve 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya yatırın.

Tripsin sindirimini durdurmak için tripsin içeren şişelere 3 mikrolitre 10 milimolar PMSF ekleyin. Ve 10 dakika buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Numuneleri 14.000 g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Peleti parçalamak için, 30 mikrolitre hücre lizis tamponu ekleyin. Örnekleri metin protokolünde açıklandığı gibi sonikasyon yapın ve 80 santigrat derecede saklayın.

Mitokondri hedefli GFP/RFP etiketli siklinB-1 Cdk-1 vektörleri oluşturmak için, insan sitokrom-c oksidaz alt birimi 8A'nın öncüsünden mitokondri hedefleme dizisini klonlayın ve standart moleküler klonlama tekniklerini kullanarak pEGFP-N1 veya pERFP-N1'in Nhe1 ve bAmH1 bölgelerinde GFP veya RFP'nin n-terminali ile çerçeveleyin. Metin protokolünde belirtilen primerleri kullanarak, standart teknikleri izleyerek Cdk1 ve cyclinB1 genlerini çoğaltın. Daha sonra PCR ürünlerini sindirmek için BamH1 kullanın.

Doğru boyuttaki DNA parçalarını kesmek için bir tıraş bıçağı kullanmadan önce reaksiyonları %1'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın. Daha sonra DNA'yı saflaştırmak için bir jel ekstraksiyon kiti kullanın. Daha sonra, bir mikrogram MTS-pEGFP-N1 ve MTS-pERFP-N1 plazmitlerini 1 mikrolitre BamH1 ile 37 saat boyunca 37 saat boyunca sindirin.

Daha sonra 1 mikrolitre buzağı bağırsak alkalin fosfataz ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Sindirim ürünlerini %1'lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırdıktan ve DNA'yı az önce tarif edildiği gibi saflaştırdıktan sonra, metin protokolünde listelenen reaktifleri kullanarak bir ligasyon reaksiyonu ayarlayın. Daha sonra reaksiyonu gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

E. coli dH5-alfa yetkin hücreleri 10 mikrolitre ligasyon karışımı ile dönüştürün. Ve bakterileri LB agar plakaları üzerinde artı gece boyunca 37 santigrat derecede mililitre kanamisin başına 10 miligram büyütün.

Ertesi gün, bir plakadan bir koloni koparmak için steril bir pipet ucu kullanın. Ve ucu 5 mililitre LB kanamisin içeren bir tüpe yerleştirin. Kültürü gece boyunca inkübe edin ve ertesi sabah, plazmidi izole etmek için metin protokolüne göre bir mini hazırlık kiti kullanın.

Katlanarak büyüyen MCF-10A hücrelerini dönüştürmek için, 100 mikrolitre serum ve antibiyotik içermeyen ortamda 1: 2 oranında plazmit transfeksiyon reaktifi hazırlamak için Cdk1 veya siklinB-1 plazmitleri kullanın. Hücreleri transfekte edin ve 48 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Mitokondriyi metin protokolüne göre boyayın ve görselleştirin.

Hücre sıralamasını gerçekleştirmek için, 2.5 mililitre serum ve antibiyotik içermeyen ortamda hazırlanan DNA'nın transfeksiyon reaktifine 1: 2 oranında DNA kullanarak 6 oyuklu bir plakada istenen vektörlerle 2 kez 10 ila 5. hücrelere aktarın. Transfeksiyonu 48 saat boyunca inkübe ettikten sonra, metin protokolüne göre GFP etiketli Cdk-1 ve RFP etiketli clyclinB1 proteinlerini stabil bir şekilde ifade eden hücreleri canlı sıralamak için akış sitometrisi kullanın. EdU etiketleme akış sitometrisi testini kullanarak hücre döngüsü uzunluğunu ölçmek için, tohum hücreleri 6 oyuklu plakalarda 2,5 kat 10 ila 5. hücreler yoğunlukta sıraladı.

gece inkübasyondan sonra, EdU'yu kültür ortamına 25 mikromolar final konsantrasyonunda ekleyin ve bir saat daha inkübe edin. Daha sonra iki saatlik aralıklarla, bir hücre kuyusunu yıkamak için 500 mikrolitre PBS'de% 1 BSA kullanın. Ve 1,5 mililitrelik bir tüpte toplayın.

Hücreleri 350 g'da 5 dakika santrifüjleyin. Sonra süpernatanı atın. 100 mikrolitre sabitleme solüsyonu ekleyerek peleti yerinden çıkarın.

İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücreleri üç kez yıkamak için PBS'de 1 mililitre% 1 BSA kullanın. Ardından, hücreleri gece boyunca 4 santigrat derecede sabitlemek için 0,5 mililitre% 70 etanol kullanın.

GFP ve RFP etiketli proteinlerle transfekte edilmiş hücrelerle EdU etiketlemesi yapılırken, GFP ve RFP'den gelen floresan sinyallerini söndürmek çok önemlidir. Bunu başarmak için,% 70 etanol kullanarak gece boyunca hücre sabitlemesi için ekstra bir adım ekliyoruz. Ertesi gün, hücreleri metin protokolüne göre yıkadıktan ve geçirgen hale getirdikten sonra, her tüpe 0,5 mililitre reaksiyon kokteyli ekleyin ve iyice karıştırın.

Karanlıkta inkübasyon ve başka bir yıkamanın ardından, DNA'yı boyamak için% 1 BSA PBS'de mililitre propidyum iyodür veya PI başına 50 mikrogram kullanın. EdU pozitif popülasyonu takip etmek için hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin. DNA içeriği ve EdU için boyanmış EdU etiketli hücrelerin dağınık bir nokta grafiğini sunun.

Alexa 647 EdU için APC kanalını, tüm ışığın mevcut olduğu 670 30 bant geçiren bir filtre kullanarak, bu filtreye çarpan 685 nanometreden daha az ve önünde 581 15 bant geçiren bir filtre bulunan PI için fikoeritrin kanalını kullanın, mevcut tüm ışık bu filtreye 600 nanometreden daha az çarpıyor. Satın alma için standart bir geçit stratejisiyle, morfoloji için FSC alanını SSC alanına göre çizin, ardından hücre boyama için Alexa 647 EdU ile PI'yi çizin. Tüm tüpler için verileri tek tek kaydedin ve numune başına 10.000 olay elde edin.

Bu şekilde, mitokondriyal matriks proteini Hsp60 ve zarlar arası boşluk proteini Timm13, submitochondrial lokalizasyon belirteçleri olarak kullanılmıştır. Hsp60 ile benzer, ancak Timm13'ten farklı olarak, siklinB1 ve Cdk1, tripsin sindiriminden korundu, bu da mitokondriyal matrise lokalize olduklarını gösteriyor. Burada gösterildiği gibi, MTS ve GFP etiketli siklinB1 ve Cdk-1 yapıları kullanılarak izole edilmiş mitokondriyal fraksiyonların Western blotlaması ile mitokondride siklinB1 ve/veya Cdk-1'in aşırı ekspresyonu elde edildi.

Bir EdU nabız takip testi kullanılarak, etiketli S fazı hücrelerinin G2M fazı boyunca ilerlediği ve vahşi tip mitokondriyal siklinB1 Cdk-1 eksprese eden hücrelerde 4 saat kadar hızlı bir şekilde G1 fazında ortaya çıktığı gösterilmiştir. 6 saat ile karşılaştırıldığında, bir vektör kontrolü veya mutant siklinB1 Cdk-1 ile transfekte edilen hücrelerde, mitokondriyal siklinB1 Cdk-1'in artmasının hücre döngüsü ilerlemesini hızlandırdığını gösterir. Bu prosedürü takiben, hücre döngüsü kinaz Cdk-1'in mitokondriyal lokalizasyonunun mitokondriyal solunumu ve enerji çıkışını nasıl değiştirdiği gibi ek soruları yanıtlamak için mitokondriyal ATP üretimi, oksijen tüketimi, membran potansiyeli ve reaktif oksijen türleri gibi diğer yöntemler ölçülebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, bir nükleer kinazın mitokondriyal lokalizasyonunu ve mitokondriye özgü işlevlerini nasıl inceleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.