DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Bu prosedürün genel amacı, DNA replikasyonunu tek molekül seviyesinde görselleştirmektir. Halojenli nükleotid analoglarını yeni sentezlenmiş DNA'ya dahil ederek başlayın. Canlı hücrelerde, etiketli DNA'ya sahip hücreleri mikroskopta tespit edin.

Slayt daha sonra hücreleri yatırır ve DNA'yı mikroskop lamı üzerine gerer. DNA liflerinin müteakip immün boyaması ve floresan mikroskopi görüntülerinin analizi, genel replikasyon programını etkileyen parametrelerin kantitatif analizine izin vermek için küresel replikasyon çatalı dinamiklerini aydınlatabilir. Geçtiğimiz yıllarda, canlı hücreler içindeki bireysel replikasyon çatalının hareketini görselleştirmek için DNA lifi Fluor tekniklerinin farklı versiyonları geliştirildi.

DT 40 hücrelerinde tanık olmak üzere olduğunuz bu in vivo deney bir gün içinde gerçekleştirilebilir ve sadece genel laboratuvar ekipmanı ve prosedürü gösteren bir floresan mikroskobu gerektirir Laboratuvarım için bir doktora sonrası araştırmacı olan Dr.Rebecca Schwab olacaktır. DT 40 hücrelerini in vivo olarak etiketlemek için, katlanarak büyüyen bir kültürle başlayın. IDU etiketini 25 mikromolar nihai konsantrasyona ekleyin ve hücre süspansiyonunu karıştırın.

Hücreleri 38 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 20 dakika inkübe edin. Ardından, CLDU etiketini 250 mikromolar nihai konsantrasyona ekleyin. Hücre süspansiyonunu karıştırın ve inkübe edin.

Şimdi DT 40 hücrelerini buz gibi PBS reus ile yıkayın. Hücre peletlerini soğuk PBS'de askıya alın ve etiketli hücreleri buz üzerinde tutun. Hücre süspansiyonunun iki mikrolitresini camın bir ucuna yerleştirin, damlanın hacmi büyük ölçüde azalana kadar ancak tamamen kuruyana kadar havayla kurutun.

Şimdi, hücre süspansiyonunun üzerine yedi mikrolitre lif lizis çözeltisi ekleyin ve çözeltileri bir pipet ucu ile karıştırarak iki dakika inkübe ederek hafifçe karıştırın. Ardından, liflerin slayt boyunca yayılmasını sağlamak için slaytları 15 dereceye kadar eğin. Elyaf çözeltisi sürgünün dibine ulaştığında, havayla kuruması için yatay olarak yerleştirin.

Bu noktada, slayt boyunca ince bir opak çizgi görünmelidir. Gerilmiş liflerin başlangıcını bir kalemle işaretleyin. İlk olarak, slaytları üç ila bir metanol içinde 10 dakika boyunca asetik aside daldırın.

Slaytları damıtılmış suda yıkayın, ardından 80 dakika boyunca 2,5 molar hidroklorik aside batırın. Slaytları PBS'de beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Fazla PBS'yi bir kağıt havlu üzerine toplayın.

Ardından slaytları yatay olarak yönlendirin. Şimdi her slaytın üzerine PBS'de %5 BSA'yı pipetleyin ve 20 dakika boyunca bir kapak fişi inkübe edin. Kapak sürgüsünü cam sürgüden yavaşça aşağı doğru hareket ettirin.

Fazla BSA'yı bir kağıt havluyla çıkarın. Daha sonra 50 mikrolitre anti BRDU birincil antikor solüsyonunu pipetleyin. Her slaytın üzerine.

Bir oyunu bir kapak fişi ile örtün ve nemlendirilmiş bir odada iki saat boyunca inkübe edin. Kapak fişlerini çıkardıktan sonra, slaytları PBS'de beş dakika boyunca üç kez yıkayın. İkincil antikor çözeltisinin 50 mikrolitresini uygulayın ve ayrıca slaytları ışıktan koruyun.

Sonra bir saat kuluçkaya yatırın. Kapak fişlerini çıkarın ve slaytları PBS'de beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Son olarak, her slayta bir damla vektör kalkanı montaj ortamı ekleyin.

Bir kapak kızağına hafifçe bastırın ve etrafındaki fazla sıvıyı alın. Bir kağıt havluyla, kapak fişlerini şeffaf oje ile kapatın ve havayla kurutun. Slaytları eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Kalem işaretine yakın bir slayta bir damla daldırma yağı koyun ve lifleri bulmaya başlayın. Liflerin birbirinden net bir şekilde ayrıldığı alanları bulmak için ana demetten uzaklaşın. Tipik bir deneyde, sapmayı önlemek için resimleri yalnızca bir renk kanalı kullanarak seçin.

Daha sonra her numunenin yaklaşık 10 fotoğrafını çekin. Farklı resimler çekmek için slayt boyunca hareket edin, çünkü slaytın bir alanı temsili fiber uzunlukları veya çoğaltma yapıları sağlamayabilir. Resimleri bir görüntü analiz programına alın.

100 fiber yolunun uzunluklarını ölçün ve/veya 150 ila 200 farklı replikasyon yapısını sayın. Çift etiketlemeli fiber tekniği, farklı replikasyon yapıları arasında ayrım yapılmasına izin verir. Yeni kopyalanan DNA, antikor etiketli nükleotid analogları çizgileri olarak görselleştirilebilir.

Burada, devam eden bir uzama çatalı, bitişik kırmızı ve yeşil sinyaller olarak temsil edilir. Yeni başlatma olayları, hücreler ilk etiketle kuluçkaya yatırılırken ateşlenen kökenlere ve ikinci etiketle kuluçka sırasında ateşlenen kökenlere ayrılabilir. İlki komşu yeşil, kırmızı yeşil sinyallerden ve ikincisi yeşil bir çizgiden oluşur. Sadece.

Sonlandırma olayları bitişik kırmızı yeşil olarak görünür. Kırmızı sinyaller serpiştirilmiş. Kökenler, ardışık kökenler ve sonlandırma sinyallerinden oluşur.

Deneysel tasarıma bağlı olarak, durmuş veya çökmüş çatallar, yalnızca kırmızı bir sinyal veya kırmızı bir çizgi olarak tanımlanabilir ve ardından kısa bir yeşil yol takip edilebilir. Bu deneyde, vahşi tip DT 40 hücreleri dakikada ortalama 0.4 mikron çatal hızına sahiptir. %63 devam eden çatallar, %10 kökenler, %16 durmuş çatallar, %8 sonlandırmalar ve %3 serpiştirilmiş lifler ile.

Bu videoyu izledikten sonra, DT 40 hücrelerinde replikasyon çatalı dinamiklerini nasıl görselleştireceğinizi ve analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu size DNA replikasyonundaki kusurları araştırmak için önemli bir araç sağlayacaktır.