Name: DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Öğrenin, DT40 hücrelerinde DNA replikasyonunu tek molekül düzeyinde görselleştirmek için DNA fiber tekniğini. Bu yöntem, replikasyon çatalı dinamiklerini analiz ederek genetik stabilite araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dr T. Helleday fiber tekniği yanı sıra yararlı bir tartışma için laboratuar üyeleri ile yardım ve Dr E. Petermann teşekkür ederim. WN, Uluslararası Kanser Araştırma Derneği Kıdemli Uluslararası Araştırma Bursu ve Bilimsel Araştırma hibe (N301 165.935) Polonya Devlet Komitesi tarafından desteklenmektedir.

Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5: Bu yöntem şu yayında kullanılan Burada anlatılan. 1. DT40 hücre Kültür Malzemeler: Fetal sığır serumu (FBS), tavuk serumu, penisilin / streptomisin, 2 merkaptoetanol, RPMI <ol><li> Hücre kültürü ortamı hazırlayın:% 7 FBS eklemek,% 3 tavuk serumu, 1x penisilin / streptomisin ve 10 mcM 2-merkaptoetanol RPMI medyum. </li><li> DT40 hücreler steril hücre kültürü şişeleri yetiştirilen 38 ° C ve% 5 CO 2 nemlendirilmelidir inkübatör. 5 x 5 10 hücre / ml 6 yoğunluğu her geçen gün hücreleri bölme. </li></ol> 2 in vivo etiketleme Malzemeler: EUK, CldU <ol><li> Nükleotid analogları stok çözümleri hazırlayın: 5 mM ve CldU orta ve 2.5 mM IDU çözülür. Her iki çözümü de kısaca 60 Isı ° C ve nükleotid analog kadar vorteksues tamamen çözülür. </li><li> 25 mcM DT40 hücreler katlanarak büyüyen bir final konsantrasyonu IDU ekleyin ve hücre süspansiyonu iyi karıştırın. 38 ° C ve% 5 CO 2 hücreleri 20 dakika inkübe. </li><li> Ilk etiket ile inkübasyondan sonra, nihai konsantrasyonu 250 mcM CldU eklemek ve önceki adımda açıklandığı gibi hücre tedavisi. </li><li> Hücreleri buz PBS ile yıkayın ve 7.5 x 10 5 hücre / ml soğuk PBS bir konsantrasyon onları tekrar süspansiyon haline getirin. Etiketli hücreleri buz üzerinde tutun. </li></ol> Açıklanan etiketleme işlemi sadece bir öneridir ve özel soruları yanıtlamak için modifiye edilebilir. Deneysel tasarım hakkında daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakınız. 3. Hücre parçalama ve DNA yayılıyor Malzemeler: Cam slaytlar, lif lizis çözüm <ol><li> 200 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM EDTA ve% 0.5 SDS: fiber lizis çözüm hazırlayın </li><licam slayt sonuna kadar bir h s spot ul. hava kuru dakika veya damla hacminin b azal ancak de><li> Pipetleyin 7 ul lizis hücre süspansiyonu çözüm ve çözümler karıştırmak için pipet ucu ile hafifçe karıştırın. Devam etmek için hücre erimesi için 2 dakika inkübe edin. </li><li> 15 ° lifleri slayt yayılabilir izin slaytlar yatırın. </li><li> Fiber çözümü slayt alt ulaştığında, kuru hava yatay olarak yerleştirin. Kuruduktan sonra ince, opak bir çizgi slayt boyunca görünür olmalıdır. Bu noktada, çizgi artık görünür olmayacak boyandıktan sonra gergin liflerin başında bir kalem ile işaretlenmiş olmalıdır. Bu işaret, daha sonra mikroskop altında lifleri bulmak için yardımcı olacaktır. </li></licam></ol> 4. Immünofloresan boyaması Malzemeler: Metanol, asetik asit, HCl, PBS içinde% 5 BSA, boyama kavanoz, anti-BrdU (fare) antikor,anti-BrdU (sıçan) antikor, koyun anti-fare Cy3 antikor, keçi anti-sıçan Alexa Fluor 488 antikor, Vectashield montaj orta lamelleri, oje <ol><li> Metanol / asetik asit (3:1), 10 dakika boyunca bir boyama kavanoz ve inkübe daldırın slaytlar. </li><li> 80 dakika sonra 2.5 M HCl batırmayın distile H 2 O slaytlar, yıkayın. </li><li> Yıkama 5 dakika PBS içinde üç kez slaytlar. </li><li> Boyama kavanoz slaytları çıkarın ve kağıt havlu ile fazla PBS toplamak. Slaytları yatay olarak yerleştirin ve her slaytın üstüne pipetlemeyin% 5 BSA. BSA slayt üzerinde eşit biçimde yaymak ve 20 dakika boyunca inkübe slaytları bir lamel ile hafifçe örtün. </li><li> 01:25 anti-BrdU (fare) ve 1:400 anti-BrdU (sıçan):% 5 BSA aşağıdaki konsantrasyonlarda primer antikorlar sulandırınız. </li><li> Çıkarmak için cam slayt aşağı lamel yavaşça hareket ettirin. Kapak kayma slayt yapışıyor kuvvet uygulamayın. Lamel gevşek bir hale gelinceye kadar slayt PBS rehidrated kolaylıkla silinebilir. Bir kağıt havlu ile fazla BSA toplayın ve slaytlar yatay olarak yerleştirin. Her bir slayt üzerine primer antikor çözüm pipetleyin 50 ul. Slayt üzerinde eşit antikor çözüm yaymak ve nemlendirilmiş bir odasında 2 saat süreyle inkübe bir lamel ile tekrar örtün. </li><li> Lamelleri çıkardıktan sonra 5 dakika boyunca slayt PBS içinde üç defa yıkamak </li><li> : Aşağıdaki konsantrasyonlarda 1:500 koyun anti-fare Cy3 ve 1:400 keçi anti-fare Alexa Fluor 488% 5 BSA sekonder antikor sulandırınız. </li><li> 50 primer antikorlar için açıklandığı gibi ikincil antikor çözüm ul uygulayın. Işık ve 1 saat süreyle inkübe slaytlar koruyun. </li><li> Lamelleri çıkardıktan sonra 5 dakika boyunca slayt PBS içinde üç defa yıkamak. </li><li> Her bir slayt üzerine Vectashield montaj orta bir damla ekleyin ve bir lamel uygulayın. Lamelleri hafifçe basın ve kağıt havlu ile çevresinde aşırı sıvı kaldırmak. Seal lamelleri şeffaf tırnak polish ve onlara kuru sağlar. -20 ° C'de slaytlar Mağaza </li></ol> 5. Görüntü elde etme Malzemeler: floresan mikroskop, kamera Kalem işareti yakın bir slayt üzerine bir damla immersiyon yağı koyun ve liflerin yerini başlayın. Tipik olarak, bir ana elyaf demeti, ancak bu liflerin çok dolaşmış ve daha sonra analiz edilemez. Lifleri (Şekil 2) birbirinden açıkça ayrılmış alanlar bulmak için ana paket uzağa taşıyın. Biz sadece önyargı önlemek için tek bir renk kanalı kullanarak resimleri seçmek. Sonra, her bir zaman noktasında, konsantrasyon veya hücre hattının yaklaşık 10 fotoğraf çekmek. Ancak, resimlerin sayısı her resmi sayılır kaç lifleri bağlıdır. Bir slayt bir bölge temsilcisi fiber uzunluğu veya çoğaltma yapıları sağlamak değil, farklı fotoğraf çekmek için slayt boyunca hareket ettirin. 6. Veri analizi Malzemeler: Resim analiz programı, örneğin ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) İthalat bir resim analiz programı resim. Uzunlukları ölçün lif yolları ve / veya farklı çoğaltma yapıları sayısı (Şekil 3). Sadece resmin kenarına uzatmak açıkça görülebilir ve liflerin sayısı. Biz genellikle yaklaşık 100 liflerinin uzunluğu ölçmek ve 150-200 çoğaltma yapıların sayısı ve bireysel deneyler en az üç kez tekrarlayın. 7. Temsilcisi Sonuçlar: Yeni çoğaltılmış DNA antikor etiketli nükleotid analogları hatları olarak görüntülenebilir. Deneyler devam eden bir çatal bitişik kırmızı ve yeşil sinyaller (Şekil 3) olarak temsil edilir. Çift etiketleme protokolü de bize çoğaltma yapıları dört ana sınıfı tanımlamak için izin verir: 1) yeni başlanması olayları divid olabilir hücreleri ilk etiket ve ikinci etiketi ile inkübasyon sırasında ateş kökenleri ile inkübe edildi ateş var kökenleri içine ed. Eski komşu, yeşil-kırmızı-yeşil sinyaller ve yeşil hat sadece ikinci oluşur. 2) fesih olaylar bitişik kırmızı-yeşil-kırmızı sinyaller olarak tezahür eder. 3) serpiştirilmiş kökenleri dizilmesinin kökeni ile genom siteleri. Bu tür siteler, ardışık kökenleri ve sonlandırma sinyalleri oluşur. 4), deneysel tasarım bağlı olarak durdu / çökmüş çatal ya da yalnızca kırmızı bir sinyal 7 veya daha kısa bir yeşil yolu 8,9 takip eden bir kırmızı çizgi olarak tarif edilebilir. Koşullar vahşi tip DT40 hücreleri ortalama çatal hızı 0.4 mm / dak, burada açıklanan. Biz yaklaşık% 63,% 10 devam eden çatal kökenleri,% 16 durmuş çatal (kırmızı tek yollarında),% 8 sonlandırmaları ve% 3 serpiştirilmiş lifleri algılayabilir. ure 1 "/&gt; Şekil 1 (A) karikatür sol tarafta DNA etiketleme prosedürünün ilk adımı anlatıyor: katlanarak büyüyor DT40 hücrelere IDU ekleyerek kolayca yeni sentezlenen DNA ipliklerini önde gelen ve geri kalmış dahil nükleotid analog açar. Bu spesifik antikor kullanarak görüntülendi olabilir ve mikroskop altında bakıldığında kırmızı bir çizgi olarak görünecektir. Daha sonra, bu rakam sağ tarafta gösterildiği gibi aynı prosedürü CldU tekrarlanır. Ikinci nükleotid analoğu ile inkübasyondan sonra, aktif bir çatal bitişik kırmızı-yeşil bir yolu olarak görülebilir. Ortalama lif uzunluğu nükleotid analogları inkübasyon süresi ile doğru orantılıdır. (B) parçalanan DT40 hücrelerin DNA, bir mikroskop lamı üzerine ağırlık gergin ve nükleotid analogları dahil spesifik antikorların kullanımı ve floresan mikroskobu tarafından görüntülenmiştir. igure 2 "/&gt; Şekil 2 bir temsilci floresan görüntü daha sonra her 20 dakika için IDU ve CldU etiketli yabani tip DT40 hücreleri lif gösterir . Liflerinin çoğu birbirinden ayrılır ve böylece kolayca analiz edilebilir. 10 mikron beyaz çubuğu temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 çift etiketleme fiber tekniği biri farklı çoğaltma yapıları arasında ayırt etmek için izin verir; 1 - aktif kopyalayan çatal, 2 - DNA replikasyonu (yeni kökeni ateş), 3 yeni siteleri - çatal sonlandırmaları (iki yakınsak çatal), 4 - serpiştirilmiş lifler (dizilmesinin kökeni siteleri) ve 5 - durmuş çatal (kırmızı sinyal).

<ol><li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li>
<li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li>
<li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner%27s+syndrome+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li>
<li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure%3A+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li>
<li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li>
<li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+cell+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li>
<li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint%3A+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Cycle%22%5BJournal%5D)">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li>
<li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz tek bir molekül düzeyinde S-fazında DNA sentezi etkileyen parametrelerin kantitatif analiz için veren bir yöntem açıklanmaktadır. Geçtiğimiz on yıl içinde, DNA fiber Fluorografi tekniği farklı sürümleri, canlı hücreler içinde bireysel çoğaltma çatal hareket görselleştirmek için geliştirilmiştir. Tüm bu tekniklerin kritik parametre ayrılmış DNA liflerinin sağlayan cam yüzeyler üzerinde DNA uzanan mümkün olan en iyi ulaşmak için kullanılan bir işlemdir. Bunu başarmak için çok önemli bir adım mikroskop lamı gibi lizis zaman hücre süspansiyonu inkübasyon süresi. Bu parametreler, belirli bir laboratuarda sıcaklık ve hava akımı bağlıdır ve ampirik olarak tespit edilmelidir. DNA fiber deney pratik kısmı genellikle bir gün içinde gerçekleştirilir. Ancak, sonraki bir görüntü elde edilmesi ve analizi daha zaman alıcı ve pratik gerektirir. Etiketleme protokol reklam olabilirçeşitli bilimsel sorunlara cevap Apted: ikinci darbe etiketleme sırasında çoğaltma engelleyen bir ajan kullanarak çatal uzama / replikatif stres yanıt durdurduklarını izler. Bu senaryoda, ilk etiket ikinci nükleotid olarak yıkanabilir gerekmez aşırı eklenir. Alternatif olarak, çoğaltma engelleyen ilaçların kombinasyonu ya da sadece ilk etiket eklenmesinden sonra kullanılabilir. Bu ilk etiket gerektirir ve ikinci nükleotid analog önce çıkarılması için ilaç uygulanır. Bu prosedür, bir replikatif stres koşulları altında (yani çatal durdurduklarını ve / veya daraltmak) replikatif çatal istikrar / kurtarma çeşitli DNA onarım faktörlerin önemini belirlemek için olanak sağlar. Kayda Değer, DNA replikasyonu programı özelliklerden penye DNA ve floresan in situ hibridizasyon birleştiren bir alternatif yaklaşımların kullanımı ile daha detaylı bir analiz yapılabilir. Ancak bu, teknik olarak daha zor ve pahalı gerektirirsive donanımları. , Kalitatif ve kantitatif DNA replikasyonu hususlar analiz yeteneği, DNA replikasyonu kendisi kusurlar gibi çoğaltma çatal ile ilişkili genomik istikrarsızlık bastırmak yollar araştırıyor için gerekli bir araç sağlar. Kuşkusuz, bu testte daha normal hücrelere yanıt / kanser hücrelerini çoğaltma çatal hedefleyen ilaçların toksisitesi direnmek için bu mekanizmaları kullanan yanı sıra çevresel değişimlere uyum sağlayan çoğaltma aracılı DNA onarım mekanizmaları ışık tutacak yardımcı olacaktır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifi Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Fetal sığır serumu altın (FBS) </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td></td></tr><tr><td> Tavuk serum </td><td> Sigma </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Iodo-2&#39;-dezoksiuridin (EUK) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Kloro-2&#39;-deoksi-üridin (CldU) </td><td> Sigma </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop SuperFrost slaytlar </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> Kapak No1 fişleri </td><td> Bilimsel laboratuar suppplies </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield montaj orta </td><td> H-1000 Vektör laboratuar </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-BrdU antikor (fare) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-BrdU antikor (sıçan) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> koyun anti-fare Cy3 </td><td> Sigma </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> keçi anti-sıçan Alexa Fluor 488 antikor </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dna replikasyonu görselleştirme omurgalı model sistemi dt40 dna fiber tekniği

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Replikasyon çatalı istikrar Bakım canlılığını korumak ve hastalığı önlemek için hücrelerin bölünmesi için büyük önem taşımaktadır. Ilgili süreçleri sadece endojen ve eksojen DNA hasarı karşısında sadık genom çoğaltılması sağlamak değil, aynı zamanda genomik instabilite, tümör gelişimini tanınmış bir etken faktörü engel değildir. Burada, basit ve maliyet-etkin floresan mikroskopi tabanlı DT40 kuş B-hücre hattı DNA replikasyonu görselleştirmek için yöntem açıklanmaktadır. Bu hücre hattı, omurgalı hücreler 1 ters genetik in vivo protein fonksiyonunu araştırmak için güçlü bir araç sağlar . Belirli bir geni eksik DT40 hücrelerinde DNA lif Fluorografi biri bu gen ürünü, DNA replikasyonu ve genom istikrar fonksiyonu açıklamak için izin verir. Omurgalı hücreler replikasyon çatal dinamiklerini analiz etmek için geleneksel yöntemlerle bir nüfus darbe etiketli hücrelerinin DNA sentezi genel oranı ölçüm güveniyor. Bu niceliksel bir yaklaşımdır ve DNA sentezi etkileyen parametrelerin nitel analiz için izin vermiyor. Buna karşın, DNA fiber tekniği 2-4 kullanırken aktif çatal hareketinin hızı doğrudan takip edilebilir. Bu yaklaşımda, doğmakta olan DNA halojenli nükleotidler dahil (Şekil 1A), in vivo olarak etiketlenmiştir . Daha sonra bir mikroskop lamı üzerine, bireysel lifler gerilir ve etiketli DNA çoğaltma yolları spesifik antikor ile boyandı ve floresan mikroskobu (Şekil 1B) ile görünür. Çoğaltma gibi çatal yönlülük başlatılması, iki farklı analogları ardışık kullanımı ile belirlenir. Ayrıca, dual-etiketleme yaklaşımı S-fazında DNA sentezi etkileyen parametrelerin kantitatif analiz sağlar, yani devam eden ve durdu çatal, çoğaltma kökenli yoğunluğu yanı sıra çatal sonlandırmaları çoğaltma yapılar. Sonuç olarak, deneysel prosedür başarmak olabilir.ed, bir gün içinde sadece genel laboratuar cihazları ve floresan mikroskop gerektirir.

DT40 bir model omurgalı genetik sistemi, protein fonksiyonu analiz etmek için güçlü bir araç sağlar. Burada tek bir molekül düzeyinde DT40 hücrelerinde S-fazında DNA sentezi etkileyen parametreler nitel analiz sağlayan basit bir yöntem açıklanmaktadır.

DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Replikasyon çatalı stabilitesinin korunması, bölünen hücrelerin canlılığını sürdürmesi ve hastalıkların önlenmesi açısından son derece önemlidir. Sürece dahil olan mekanizmalar...

Bu prosedürün genel amacı, DNA replikasyonunu tek molekül düzeyinde görselleştirmektir. Yeni sentezlenen DNA'ya halojenli nükleotid analogları dahil ederek başlayın. Canlı hücrelerde, etiketli DNA içeren hücreleri bir mikroskop üzerine damlatın.Ardından hücreler slayda yayılır ve DNA mikroskop lamı üzerine uzatılır. DNA fiberlerinin ardından yapılan immün boyama ve floresan mikroskopi görüntülerinin analizi, genel replikasyon programını etkileyen parametrelerin kantitatif analizine olanak tanıyacak şekilde küresel replikasyon çatalı dinamiklerini aydınlatabilir. Geçtiğimiz yıllarda, canlı hücreler içindeki bireysel replikasyon çatallarının hareketini görselleştirmek için farklı DNA fiber floresan teknikleri geliştirilmiştir.Az sonra izleyeceğiniz, DT 40 hücrelerinde gerçekleştirilen bu in vivo deney bir gün içinde tamamlanabilir; yalnızca genel laboratuvar ekipmanları ve bir floresan mikroskop gerektirir. Prosedürü laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr. Rebecca Schwab uygulamalı olarak gösterecektir. DT 40 hücrelerini in vivo olarak işaretlemek için, eksponansiyel fazda büyüyen bir kültürle başlayın. 25 micromolar nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde IDU etiketi ekleyin ve hücre süspansiyonunu karıştırın.Hücreleri 38 °C ve %5 karbondioksit ortamında 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, CLDU etiketini 250 µM son konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin. Hücre süspansiyonunu karıştırın ve inkübe edin.Şimdi DT 40 hücrelerini buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Hücre peletlerini soğuk PBS içinde süspande edin ve işaretli hücreleri buz üzerinde tutun. Hücre süspansiyonundan iki mikrolitreyi lamın bir ucuna damlatın ve damla hacmi önemli ölçüde azalana kadar, ancak tamamen kurumadan hava ile kurutun.Şimdi, hücre süspansiyonunun üzerine yedi µL fiber lizis solüsyonu ekleyin ve solüsyonları bir pipet ucuyla karıştırarak nazikçe harmanlayın, ardından iki dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, fiberlerin lam boyunca yayılmasını sağlamak için lamları 15 derece eğin. Fiber solüsyonu lamın altına ulaştığında, hava ile kuruması için lamı yatay konuma getirin.Bu aşamada, lam boyunca ince, opak bir çizgi görünür olmalıdır. Gerilmiş fiberlerin başlangıcını bir kurşun kalemle işaretleyin. Öncelikle lamları 10 dakika boyunca üç birim metanol ve bir birim asetik asit karışımına daldırın.Slaytları distile su ile yıkayın, ardından 80 dakika boyunca 2,5 molar hidroklorik asit içinde bekletin. Slaytları PBS ile beşer dakikalık üç yıkama işleminden geçirin. Fazla PBS'yi bir kağıt havlu yardımıyla alın.Ardından lamları yatay olarak yönlendirin. Şimdi her bir lamın üzerine PBS içinde %5 BSA pipetleyin, bir kapatma camı yerleştirin ve 20 dakika boyunca inkübe edin. Kapatma camını cam lam üzerinde nazikçe aşağıya doğru kaydırın.Fazla BSA'yı bir kağıt havlu ile temizleyin. Ardından, her bir lamın üzerine 50 µL anti BRDU primer antikor çözeltisi pipetleyin.Bir lamı lamelle kapatın ve nemlendirilmiş bir inkübasyon kabında iki saat boyunca inkübe edin. Lamelleri çıkardıktan sonra, lamları PBS ile beşer dakikalık üç yıkama işlemine tabi tutun. 50 µL sekonder antikor çözeltisi uygulayıp lamelleri yerleştirin ve lamları ışıktan koruyun.Ardından bir saat boyunca inkübe edin. Lamelleri kaldırın ve lamları PBS ile beşer dakika süreyle üç kez yıkayın. Son olarak, her lamın üzerine bir damla vector shield montaj medyumu ekleyin.Lamelin üzerine hafifçe bastırın ve etrafındaki fazla sıvıyı alın. Bir kağıt havlu yardımıyla, lamelleri şeffaf oje ile mühürleyin ve havada kurumaya bırakın. Lamları -20 °C'de saklayın.Lam üzerine, kurşun kalemle işaretlenen yerin yakınına bir damla immersiyon yağı damlatın ve fiberleri konumlandırmaya başlayın. Fiberlerin birbirinden net bir şekilde ayrıldığı bölgeleri bulmak için ana demetten uzaklaşın. Tipik bir deneyde, yanlılığı önlemek için sadece tek bir renk kanalı kullanarak görüntüler seçin.Ardından her örneğin yaklaşık 10 fotoğrafını çekin. Bir lam üzerindeki tek bir alan, temsili fiber uzunlukları veya replikasyon yapıları sağlamayabileceği için farklı fotoğraflar çekmek amacıyla lam boyunca ilerleyin. Fotoğrafları bir görüntü analiz programına aktarın.100 fiber demetinin uzunluklarını ölçün veya 150 ila 200 farklı replikasyon yapısını sayın. Çift etiketleme fiber tekniği, farklı replikasyon yapıları arasında ayrım yapmaya olanak tanır. Yeni replike olan DNA, antikorla etiketlenmiş nükleotid analoglarının oluşturduğu çizgiler şeklinde görselleştirilebilir.Burada, devam eden bir uzama çatalı, bitişik kırmızı ve yeşil sinyallerle temsil edilmektedir. Yeni başlatma olayları, hücreler ilk etiketle inkübe edilirken aktive olan orijinler ve ikinci etiketle inkübasyon sırasında aktive olan orijinler olarak ikiye ayrılabilir. İlki komşu yeşil, kırmızı yeşil sinyallerden; ikincisi ise sadece yeşil bir çizgiden oluşur.Terminasyon olayları, bitişik kırmızı yeşil olarak kendini gösterir. Kırmızı sinyaller aralara serpilmiştir. Başlangıç bölgeleri, ardışık başlangıç ve terminasyon sinyallerinden oluşur.Deneysel tasarıma bağlı olarak, duraklamış veya çökmüş çatallar ya sadece kırmızı bir sinyal ya da kısa bir yeşil hat tarafından takip edilen kırmızı bir çizgi olarak tanımlanabilir. Bu deneyde, vahşi tip DT 40 hücreleri dakikada ortalama 0,4 mikron çatal hızına sahiptir. %63 devam eden çatal, %10 orijin, %16 duraklamış çatal, %8 terminasyon ve %3 aralıklı fiber bulunmaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, DT 40 hücrelerinde replikasyon çatalı dinamiklerinin nasıl görselleştirileceği ve analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu, DNA replikasyonundaki kusurları incelemeniz için size temel bir araç sağlayacaktır.

visualization-dna-replication-vertebrate-model-system-dt40-using-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, gerçek zamanlı olarak bireysel replisomes DNA replikasyonu görselleştirmek için basit bir tek-molekül floresan mikroskopi tekniği gösterir.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

Biz bireysel DNA molekülleri bakteriyofaj çoğaltma sistemi proteinleri aracılığı ile gerçek zamanlı çoğaltma gözlemlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

Biz, iki boyutlu agaroz-jel analizi, UV ışını meydana çoğaltma ara yapısını tanımlamak için kullanılır olabilir bir prosedür sunuyoruz.

UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi

Kromozom replikasyonu zamanlama analizi için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem floresan ile kombinasyon halinde BrdU eklenmesi...

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Burada, Escherichia coli'deki replikasyon çatallarını durdurmak ve çökertmek için bölgeye özgü, geri dönüşümlü in vivo protein bloğu kullanan bir sistemi tarif ediyoruz. Replikasyon bloğunun kurulması floresan mikroskobu ile değerlendirilir ve replikasyon ara ürünlerini görselleştirmek için nötr-nötr 2 boyutlu agaroz jel elektroforezi kullanılır.

Bir Siteye Özel çoğaltma Blokaj içinde uyaran<i&gt; E. E. coli</i&gt; Bir Floresan Baskılayıcı Operatör Sisteminin Kullanılması

Bu protokol, yapısal olarak korunmuş kromatin in situ içindeki replikasyon bölgelerinin yüksek çözünürlüklü haritalanması için, önceden gömülmüş EdU-streptavidin-Nanogold etiketleme ve ChromEMT'nin bir kombinasyonunu kullanan bir teknik sunar.

Elektron Tomografisi ile Ultrayapısal Olarak Korunmuş Kromatinde Görüntüleme Replikasyon Alanları

Metodoloji, nanopartiküllerin varlığında DNA replikasyon dinamiklerindeki varyasyonun analizine yardımcı olur. İlgilenilen malzemenin sitotoksisite seviyesine bağlı olarak farklı metodolojiler benimsenebilir. Ek olarak, DNA lifi analizine yardımcı olmak için görüntü analizinin bir açıklaması sağlanmıştır.

DNA Hasarını Araştırmak ve Nanopartiküllerin İndüklediği Onarım Dinamiklerini Araştırmak için DNA Fiber Testinin Gösterilmesi

Bu protokol, CMG sarmal ile çözülen DNA'nın canlı görselleştirilmesi için tek moleküllü bir testin gerçekleştirilmesini gösterir. (1) bir DNA substratının hazırlanmasını, (2) floresan etiketli Drosophila melanogaster CMG helikazının saflaştırılmasını, (3) toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için bir mikroakışkan akış hücresinin hazırlanmasını ve (4) tek moleküllü DNA çözme tahlilini açıklar.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Burada, 2 boyutlu jel elektroforezi kullanarak patojenik, yapıya eğilimli tekrarlar yoluyla replikasyon ilerlemesini analiz etme prosedürünü özetliyoruz.

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

Bu protokol, DNA polimerazlar ve G-dörtlü yapılar gibi engeller arasındaki etkileşimlerin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayan floresan mikroskobu tabanlı tek moleküllü DNA replikasyon testini ana hatlarıyla belirtir.

G-Dörtlülerinde DNA Polimeraz Dinamiğinin Tek Moleküllü Floresan Görselleştirmesi

Öğrenin, DT40 hücrelerinde DNA replikasyonunu tek molekül düzeyinde görselleştirmek için DNA fiber tekniğini. Bu yöntem, replikasyon çatalı dinamiklerini analiz ederek genetik stabilite araştırmalarına katkı sağlar.

DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Daha fazla video keşfet