DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Bu prosedürün genel amacı, DNA replikasyonunu tek molekül düzeyinde görselleştirmektir. Yeni sentezlenen DNA'ya halojenli nükleotid analogları dahil ederek başlayın. Canlı hücrelerde, etiketli DNA içeren hücreleri bir mikroskop üzerine damlatın.

Ardından hücreler slayda yayılır ve DNA mikroskop lamı üzerine uzatılır. DNA fiberlerinin ardından yapılan immün boyama ve floresan mikroskopi görüntülerinin analizi, genel replikasyon programını etkileyen parametrelerin kantitatif analizine olanak tanıyacak şekilde küresel replikasyon çatalı dinamiklerini aydınlatabilir. Geçtiğimiz yıllarda, canlı hücreler içindeki bireysel replikasyon çatallarının hareketini görselleştirmek için farklı DNA fiber floresan teknikleri geliştirilmiştir.

Az sonra izleyeceğiniz, DT 40 hücrelerinde gerçekleştirilen bu in vivo deney bir gün içinde tamamlanabilir; yalnızca genel laboratuvar ekipmanları ve bir floresan mikroskop gerektirir. Prosedürü laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr. Rebecca Schwab uygulamalı olarak gösterecektir. DT 40 hücrelerini in vivo olarak işaretlemek için, eksponansiyel fazda büyüyen bir kültürle başlayın. 25 micromolar nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde IDU etiketi ekleyin ve hücre süspansiyonunu karıştırın.

Hücreleri 38 °C ve %5 karbondioksit ortamında 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, CLDU etiketini 250 µM son konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin. Hücre süspansiyonunu karıştırın ve inkübe edin.

Şimdi DT 40 hücrelerini buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Hücre peletlerini soğuk PBS içinde süspande edin ve işaretli hücreleri buz üzerinde tutun. Hücre süspansiyonundan iki mikrolitreyi lamın bir ucuna damlatın ve damla hacmi önemli ölçüde azalana kadar, ancak tamamen kurumadan hava ile kurutun.

Şimdi, hücre süspansiyonunun üzerine yedi µL fiber lizis solüsyonu ekleyin ve solüsyonları bir pipet ucuyla karıştırarak nazikçe harmanlayın, ardından iki dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, fiberlerin lam boyunca yayılmasını sağlamak için lamları 15 derece eğin. Fiber solüsyonu lamın altına ulaştığında, hava ile kuruması için lamı yatay konuma getirin.

Bu aşamada, lam boyunca ince, opak bir çizgi görünür olmalıdır. Gerilmiş fiberlerin başlangıcını bir kurşun kalemle işaretleyin. Öncelikle lamları 10 dakika boyunca üç birim metanol ve bir birim asetik asit karışımına daldırın.

Slaytları distile su ile yıkayın, ardından 80 dakika boyunca 2,5 molar hidroklorik asit içinde bekletin. Slaytları PBS ile beşer dakikalık üç yıkama işleminden geçirin. Fazla PBS'yi bir kağıt havlu yardımıyla alın.

Ardından lamları yatay olarak yönlendirin. Şimdi her bir lamın üzerine PBS içinde %5 BSA pipetleyin, bir kapatma camı yerleştirin ve 20 dakika boyunca inkübe edin. Kapatma camını cam lam üzerinde nazikçe aşağıya doğru kaydırın.

Fazla BSA'yı bir kağıt havlu ile temizleyin. Ardından, her bir lamın üzerine 50 µL anti BRDU primer antikor çözeltisi pipetleyin.

Bir lamı lamelle kapatın ve nemlendirilmiş bir inkübasyon kabında iki saat boyunca inkübe edin. Lamelleri çıkardıktan sonra, lamları PBS ile beşer dakikalık üç yıkama işlemine tabi tutun. 50 µL sekonder antikor çözeltisi uygulayıp lamelleri yerleştirin ve lamları ışıktan koruyun.

Ardından bir saat boyunca inkübe edin. Lamelleri kaldırın ve lamları PBS ile beşer dakika süreyle üç kez yıkayın. Son olarak, her lamın üzerine bir damla vector shield montaj medyumu ekleyin.

Lamelin üzerine hafifçe bastırın ve etrafındaki fazla sıvıyı alın. Bir kağıt havlu yardımıyla, lamelleri şeffaf oje ile mühürleyin ve havada kurumaya bırakın. Lamları -20 °C'de saklayın.

Lam üzerine, kurşun kalemle işaretlenen yerin yakınına bir damla immersiyon yağı damlatın ve fiberleri konumlandırmaya başlayın. Fiberlerin birbirinden net bir şekilde ayrıldığı bölgeleri bulmak için ana demetten uzaklaşın. Tipik bir deneyde, yanlılığı önlemek için sadece tek bir renk kanalı kullanarak görüntüler seçin.

Ardından her örneğin yaklaşık 10 fotoğrafını çekin. Bir lam üzerindeki tek bir alan, temsili fiber uzunlukları veya replikasyon yapıları sağlamayabileceği için farklı fotoğraflar çekmek amacıyla lam boyunca ilerleyin. Fotoğrafları bir görüntü analiz programına aktarın.

100 fiber demetinin uzunluklarını ölçün veya 150 ila 200 farklı replikasyon yapısını sayın. Çift etiketleme fiber tekniği, farklı replikasyon yapıları arasında ayrım yapmaya olanak tanır. Yeni replike olan DNA, antikorla etiketlenmiş nükleotid analoglarının oluşturduğu çizgiler şeklinde görselleştirilebilir.

Burada, devam eden bir uzama çatalı, bitişik kırmızı ve yeşil sinyallerle temsil edilmektedir. Yeni başlatma olayları, hücreler ilk etiketle inkübe edilirken aktive olan orijinler ve ikinci etiketle inkübasyon sırasında aktive olan orijinler olarak ikiye ayrılabilir. İlki komşu yeşil, kırmızı yeşil sinyallerden; ikincisi ise sadece yeşil bir çizgiden oluşur.

Terminasyon olayları, bitişik kırmızı yeşil olarak kendini gösterir. Kırmızı sinyaller aralara serpilmiştir. Başlangıç bölgeleri, ardışık başlangıç ve terminasyon sinyallerinden oluşur.

Deneysel tasarıma bağlı olarak, duraklamış veya çökmüş çatallar ya sadece kırmızı bir sinyal ya da kısa bir yeşil hat tarafından takip edilen kırmızı bir çizgi olarak tanımlanabilir. Bu deneyde, vahşi tip DT 40 hücreleri dakikada ortalama 0,4 mikron çatal hızına sahiptir. %63 devam eden çatal, %10 orijin, %16 duraklamış çatal, %8 terminasyon ve %3 aralıklı fiber bulunmaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, DT 40 hücrelerinde replikasyon çatalı dinamiklerinin nasıl görselleştirileceği ve analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu, DNA replikasyonundaki kusurları incelemeniz için size temel bir araç sağlayacaktır.