Name: UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Öğrenin, UV hasarı sonrası DNA çoğaltma ara yapılarını iki boyutlu agaroz-jel analizi ile görselleştirme yöntemini. Bu teknik, E. coli hücrelerinde DNA onarım mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratuarımızda NIGMS-Ulusal Sağlık Enstitüsü, Ulusal Bilim Vakfı ve ALANI hibe R15GM86839 KARİYER ödül MCB0551798 tarafından desteklenmektedir.

1. Büyüme ve UV Işınlama. <ol><li> Şekeri% 0.4,% 0.2 casamino asitler, ve 10 mg / ml timin (DGCthy orta) ve 100 mg / ml ampisilin ile desteklenmiş Davis orta 1 yetiştirilen plazmid pBR322 içeren taze bir gece kültür 200μl pelet. Hücre pelletini sonra ampisilin eksik 200μl DGCthy orta yeniden bekletildi ve 20 ml DGCthy orta aşılamak için kullanılır. </li><li> Kültürler 0.5 OD 600 (~ 5 x 10 8 hücre / ml) 37 sallayarak inkübatör ampisilin seçimi ° C olmadan yetiştirilmektedir. Büyüme ampisilin olmadan bazı mutantlar ortaya çıkabilecek anormal veya verimsiz çoğaltma ara karşı seçimi önler. Hasara neden UV ışık kullanıyorsanız, UV etkili doz azaltılması, bu dalga boylarında ve kalkanlar hücreleri güçlü emer çünkü ek olarak, medya ampisilin çıkarılması gereklidir. </li><li> Sarı ışıklar altında çalışan, kültür, ajitasyon için dönen bir platform üzerinde 15 cm çaplı Petri kabı yerleştirilir. Bizim kültür UVC fotometre ile ölçülür ~ 1 J/m2/sec, bir maruz kalma oranı üreten bir antiseptik lamba 15 watt bir mesafede yerleştirilir. Kültürler 50 J/m2 ışınlanmış ve ardından hemen arkasına yerleştirilen deney süresi boyunca 37 ° C inkübatör sallayarak. Bu doz, ortalama 1 Siklobütanın pirimidin dimer ssDNA her 4,5 kb, üretir. Sarı ışık fotolizaz Siklobütanın pirimidin dimerleri photoreactivation-ters önler. </li></ol> 2. DNA İzolasyonu. <ol><li> Çoğaltma ara incelenmesi gereken zamanlarda, kültür 0.75 ml kısım 0.75 ml buz gibi NET30 Buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0, 30 mM EDTA) içine yerleştirilir ve sonuna kadar buz üzerinde yerleştirilen zaman elbette. Genellikle 0 ile incelenen örneklerin, 15, 30, 45, 60 ve 90 dakika ile 90 dakikalık bir zaman ders çalıştırmak. EDTA ve soğuk etkili çoğaltma ve nükleotid eksizyon onarımı durdurmak için hizmet vermektedir. </li><li> Her bir örnek, 1.5 mg / ml lizozim ve TE 0.2 mg / ml RNaseA (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA) 150 ul yeniden süspanse ve 20 dakika 37 ° C parçalanmış, sonra pelet. Şu anda, 20% sarkosyl proteinaz K (10mg/ml) ve 10μl 10μl eklenir ve inkübasyon 1 saat süreyle devam etmesine izin. Proteinaz K ve sarkosyl fenol ekstraksiyonu oluşmadan önce veya membran proteinleri ile ilişkili olabilir DNA parçalarının serbest bırakmak için yardımcı olur. Aktif kopyalayan DNA genellikle protein veya membran komplekslere bağlı olduğundan, bu kurtarıldı çoğaltma parçaları verimi artırmaya yardımcı olur. </li><li> Örnekler daha sonra her bir örnek için fenol 2 hacim ekleme ve tüpler 5 dakika hafifçe ters tarafından ayıklanır. Sonra 2 hacim kloroform / izoamil alkol (24 / 1) eklenir ve tüpler 5 dakika boyunca yavaşça tekrar ters. </li><li> Örnekleri, 5 dakika ve her numunenin üst sulu faz için bir mikrosantrifüj 14.000 rpm'de santrifüj kaldırılır ve yeni bir tüp yerleştirilir. Sonra kloroform / izoamil alkol (24 / 1) 4 cilt, eklenir tüpler 5 dakika hafifçe ters ve yine 5 dakika 14.000 rpm'de santrifüj. </li><li> Her numune üst, sulu faz sonra 1 saat süreyle bir beher 0.1x TE 250 ml üzerinde yüzen bir 47mm whatman 0.025 mikron gözenek diske her numunenin 100μl lekelenme diyalize. Tek iplikli bölgeler veya şube noktaları ile kopyalayan yapılar kesme daha duyarlı olduğundan, biz genellikle ağız geniş ve kesme güçleri en aza indirmek için bir jilet ile pipet uçları kesilir. Genel olarak, pipetleme DNA restriksiyon enzimleri ile sindirilir edildikten sonra kadar minimumda tutulması olmalıdır. </li><li> Her bir örnek daha sonra çoğaltma kökeni sadece mansap plazmid linearizes PvuII (New England Biolabs) ile sindirilir. </li><li> Agaroz jel, 100μl kloroform ve Bromophenol Mavi ve Ksilen Cyanol içeren 6X yükleme boya 20μl yüklemeden önce her bir örnek eklenir ve karıştırılır. Daha sonra, yükleme boya içeren sulu faz 40μl jel içine yüklenir. Yapısal önyargıları, yapısal eserler, ve DNA kesme en aza indirmek için, bu izolasyon prosedürü hücre parçalama tek iplikli bölgelerde, çökelti, ya da DNA örnekleri konsantre zenginleştirmek için herhangi bir adım içermez. </li></ol> 3. 2D Jel ve Güney Analizi. <ol><li> 2-boyutlu agaroz-jel analizi 3 ila güncellenmiştir. 1. boyut için kısıtlı DNA örnekleri 1V/cm 1X TBE% 0.4 agaroz jel ile çalıştırılır. 10X TBE stok solüsyonu Bir Litre içerir: <ul><li> 108 g Tris Base </li><li> 55 gr Borik Asit </li><li> 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8.0) </li></ul></li><li> Lambda Hind III boyut işareti ilk şeritte yüklenir, daha sonra örnekleri diğer her kulvarda yüklenir. Biz genellikle ilk d çalıştırmakimension ~ 12-15 saat. Şeritleri Atlama, daha kolay şerit ikinci boyutta döküm dilim hale getirir. Düşük voltaj ve düşük yüzde agaroz jel öncelikle boyutu dayalı DNA parçalarının ayrı hizmet vermektedir. </li><li> Ikinci boyut için büyük bir kasap bıçağı ile ilk boyut jel, jel şeritleri dışında dilimlenmiş. Lambda Hind III işaretleyici içeren ilk şeritli ethidium bromid ile boyandı. Bir kılavuz, ürün olarak lambda Hind III kalem kullanarak ve Lineerleştirilmiş plazmid sürmesi bekleniyor nerede aşağıda jel bölgedeki atın. Bu koşullar altında, biz bu lineerleştirilmiş pBR322 biraz ksilen cyanol leke yukarıdaki çalışır. </li><li> Ikinci boyut döküm için, her şeritli boş bir jel tekerin üstüne yatay olarak yerleştirilir. 1X TBE% 1.0 agaroz çözeltisi 55 ° C'ye kadar hazırlanır ve soğutulur Şu anda, jel solüsyon, jel dilim tamamen karşılamak için emin olun, ikinci boyut döküm dökülür. Sonra jel seti, tampon sirküle sağlayan bir elektroforez biriminde 6.5V/cm çalıştırmak. Biz genellikle ikinci boyut ~ 5,5-7 saat çalıştırın. Yüksek gerilim ve yüksek yüzde agaroz jel şekline göre DNA parçalarının yanı sıra, boyutu etkin bir şekilde ayırır. Doğrusal olmayan şekiller ikinci boyut daha yavaş çalışır. </li><li> Ardından elektroforez, jel sonra H 2 O durulanır, H 2 O ile durulanır 15 dakika, 0.25m hidroklorik asit 400ml iki kere yıkanır, ve sonra iki kez 30 dakika süreyle 400 ml 0.4M NaOH yıkanır . Asit DNA molekülleri hizmet daha verimli bir şekilde aktarma küçük parçalara kısmen nick yıkar. Bu adım, büyüklüğü ve DNA replikasyonu ara alışılmadık şekillere nedeniyle gereklidir. </li><li> Jeller DNA sonra bir Hybond N + naylon membran 4. Biz 0.4M NaOH ile alkali aşağı yönlü bir transfer sistemi kullanır. Kısaca, iki sayfa 0.4M NaOH batırılmış kağıt blot büyük bir yığın kağıt havlu üzerine yerleştirilir. Naylon membran 0.4M NaOH batırılmış ve blot kağıt üstüne yerleştirilir. Sonra jel dikkatle NaOH çözeltisi ıslatılmış başka bir parça kurutma kağıdı takip Bunun üstüne katmanlı. Son olarak, uzun bir parça ıslak blot kağıt üst kısmında katmanlı ve iki ucu, 1 L bir fitil olarak hizmet 0.4M NaOH çözeltisi içeren bir yemekleri yerleştirilir. Biz genellikle 6-12 saat için DNA transferi sağlar. </li><li> Naylon zarı kaldırılır, 5X SSC Tampon 20-30 sn yıkanmış ve 10.5ml Prehybridization Çözüm içeren bir melezleşme silindir şişede yerleştirilir. Sonra, membran 42 ° C rotasyon ile fazla 6 saat inkübe edilir. Prehybridization çözüm: <ul><li> 5.0 ml formamid </li><li> 0.5 ml% 20 SDS </li><li> 2.5 ml 20X SSC * </li><li> 2.0 ml 50X Denhardt * </li><li> 0.5 ml Somon Sperm DNA (10mg/ml) * SSC ve Denhardt için yemek tarifleri 5 bulunabilir </li></ul></li><li> Plazmid pBR322 prehybridization dönemde, 1 mg [32-P]-dCTP etiketli kullanarak alfa Roche tarafından verilen protokole göre nick çeviri 32P ile etiketlenir. Radyoaktif prob (100μl), 98 inkübe tarafından denatüre ° C, daha sonra bir vidalı kapak mikrosantrifüj tüp içinde 10 dakika boyunca ve buz üzerinde hemen önüne yerleştirilmelidir. </li><li> Denatüre prob içeren 5.9 ml hibridizasyon çözüm eklenir: <ul><li> 3.0 ml formamid </li><li> 1.5 ml SSC </li><li> 1.0 ml H 2 O </li><li> 0.15 ml 50X Denhardt </li><li> 0.10 ml% 20 SDS </li><li> 0.15 ml 10mg/ml Somon Sperm DNA </li></ul></li><li> Prehybridization çözüm silindir şişe dışarı dökülür ve hibridizasyon çözümü silindir şişe sonra 12hrs daha fazla 42 ° C inkübatör ve döndürülmüş iade edilir dökülür. </li><li> Hibridizasyon çözüm silindir şişe dışarı dökülür. Sonra, leke silindir rotasyon ile 0.5x SSC,% 0.1 SDS 42 ° C yıkama solüsyonu içeren bir ~ 150 ml şişe içinde 20 dakika 4 kez yıkanır. </li><li> Kadar sıvı gözle görülür bir şekilde ortadan kayboldu son yıkama sonrasında, membran bir kağıt havlu üzerine yerleştirilir. Membran sonra polivinil klorür plastik şal sarılmış ve bir phosphorimager ekrana maruz kalmaktadır. Fırtına 840 ve ilişkili ImageQuant Yazılım kullanarak radyoaktivite görselleştirmek ve kantitatif. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2220/2220fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Plazmid çoğaltma ara UV ışınlarına bağlı DNA hasarı varlığı ve yokluğu gözlenen PvuII göç desen 2D-agaroz-jel analizi ile gözlenen plazmid pBR322 sindirilir diyagramı. Sigara kopyalayan doğrusal plazmid 4.4-kb doğrusal bir parçası olarak çalıştırın. Çoğaltılıyor plazmid, onların daha büyük boyutuna bağlı olmayan kopyalayan parçaları daha yavaş ve göç Y-şekilli yapılar formunlinear şekli. Bu göç desen doğrusal bölgede iyi doğru uzanan bir yay oluşturur. UV ışınlama, çift-Y ya da X-biçimli molekülleri, yay Y-şekilli moleküllerin daha yavaş göç koni bölgede görülmektedir. 2D jel Güney analizi bir örnek 32P-etiketli pBR322 probed UV ışını ve 15 dakika UV ışını (Yayıncının izni ile çoğaltılabilir) sonra hemen sonra hücreler için gösterilmiştir.

<ol><li>Davis, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolation+of+Biochemically+Deficient+Mutants+of+Bacteria+by+Means+of+Penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).</li>
<li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage-Induced+Replication+Fork+Regression+and+Processing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli.</a> Science. 299, 1064-1067 (2003).</li>
<li>Friedman, K. L., Brewer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+replication+intermediates+by+two-dimensional+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis.</a> Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).</li>
<li>Spivak, G., Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+damage+and+repair+in+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22METHODS%3A+A+Companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determination of damage and repair in specific DNA sequences.</a> METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning+-+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning - A laboratory manual</a>. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvABC+is+required+to+resolve+holliday+junctions+that+accumulate+following+replication+on+damaged+templates+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvAB+and+RecG+Are+Not+Essential+for+the+Recovery+of+DNA+Synthesis+Following+UV-Induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> Genetics. 166, 1631-1640 (2004).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecO+Acts+with+RecF+and+RecR+to+Protect+and+Maintain+Replication+Forks+Blocked+by+UV-induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).</li>
<li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork%3A+a+comparison+to+UV-induced+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecBCD+and+RecJ%2FRecQ+initiate+DNA+degradation+on+distinct+substrates+in+UV-irradiated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Radiat Res. 168, 499-506 (2007).</li>
<li>Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA433+cells+are+defective+in+recF-mediated+processing+of+disrupted+replication+forks+but+retain+recBCD-mediated+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions.</a> Mutat Res. 645, 19-26 (2008).</li>
</ol>

UV hasarına varlığı ve yokluğu vahşi tip hücreler elde edilen tipik sonuçlar Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Hasar yokluğunda, hücreler üstel fazda hızla büyüyor ~% 1, toplam plazmid DNA Y ark. Bloke çoğaltma çatal hasarlı siteleri biriktikçe ışınlama takiben, Y şekilli moleküllerin geçici bir artış görülmektedir. X-şeklinde çoğaltma ara lezyonlar tamir ile ilişkilendiren bir saatine kadar geçici olarak birikir ve devam. Güney analizi yerine, çoğaltma ara, saflaştırılmış bir plastik içme sama...

<table><tbody><tr><td>Prob ile analiz edilen 2D jelin Southern analizine bir örnek</td><td>GE Healthcare</td><td>G15T8</td><td>Sarı Aydınlatma</td></tr><tr><td>15 &amp;mu;watt germisid lamba</td><td>Sylvania</td><td>F20T12/GO</td><td>UV Lamba</td></tr><tr><td>Blak-Ray UV Yoğunluk Ölçer 254nm</td><td>Daigger</td><td>EF28195T</td><td>UVC fotometre</td></tr><tr><td>0.025 &amp;mu;m gözenekli diskler</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>VSWP04700</td><td>Yüzer diyaliz diskleri</td></tr><tr><td>PvuII</td><td>Fermentas</td><td>ER0632</td><td>Restriksiyon Endonükleaz</td></tr><tr><td>Nick-translation kiti</td><td>Roche Group</td><td>976776</td><td>32P işaretli prob hazırlamak için</td></tr><tr><td>Blotting Kağıdı</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-704</td><td>Southern transferi için</td></tr><tr><td>Naylon membran</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203S</td><td>Southern transferi için</td></tr></tbody></table>

uv ile indüklenen Çoğaltma ara görselleştirme e. coli İki boyutlu agaroz-jel analizi

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

DNA hasarı varlığı Yanlış çoğaltma ve yaygın olarak insanlarda kanser gelişimi ile doğrudan ilişkili olduğuna inanılan tüm hücre tiplerinde gözlenen hücresel düzenlenmeleri ve mutagenez çoğunluk için sorumludur. DNA hasarı, UV ışını ile indüklenen gibi ciddi doğru genomik şablonu çoğaltmak çoğaltma yeteneğini bozar. Bir dizi gen ürünleri çoğaltma şablon DNA lezyonlar karşılaştığında gerekli olduğu tespit edilmiştir. Ancak, kalan meydan çoğaltma sırasında bu proteinlerin nasıl süreci lezyonları belirlemek olmuştur<em&gt; In vivo</em&gt;. Escherichia coli bir model sistem olarak kullanarak, iki boyutlu agaroz-jel analizi kopyalayan plazmid ortaya çıkan yapısal ara tanımlamak için kullanılabilecek bir prosedür tarif<em&gt; In vivo</em&gt; UV ışınlarına bağlı DNA hasarını. Bu prosedür, UV hasarına tarafından bloke çoğaltma çatal, reca ve RecF yolağı ile ilişkili çeşitli gen ürünleri tarafından stabilize geçici bir ters tabi olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Bu teknik, bu çoğaltma ara nükleotid eksizyon onarımı ve çoğaltma devam eder lezyonların kaldırılması ile ilişkilendiren bir saatine kadar korunur olduğunu gösteriyor.

Biz, iki boyutlu agaroz-jel analizi, UV ışını meydana çoğaltma ara yapısını tanımlamak için kullanılır olabilir bir prosedür sunuyoruz.

UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi

DNA hasarı varlığındaki hatalı replikasyon, tüm hücre tiplerinde gözlemlenen hücresel yeniden düzenlemelerin ve mutajenezin çoğunluğundan sorumludur...

Bu prosedürün genel amacı, replikasyonun DNA lezyonlarıyla karşılaştığı durumlarda ortaya çıkan DNA yapısal ara ürünlerini iki boyutlu jel analizi kullanarak görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle replikasyon bloklayıcı lezyonların indüklendiği aktif olarak bölünen hücrelerden DNA'nın izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, geri kazanılan DNA'yı boyutuna göre ayırmak için jel elektroforezi kullanılır.Ardından, şeritler kesilir ve DNA'yı hem boyutuna hem de şekline göre daha fazla ayıran ikinci bir jele yatay olarak yeniden dökülür. Son olarak, UV kaynaklı hasarın oluşturulmasından önceki zamanlarda ve sonraki çeşitli zamanlarda, replike olan DNA fragmanlarıyla ilişkili olan DNA yapılarını görselleştirmek için Southern analizi kullanılır. Nihayetinde, bu prosedür, belirli mutantlarda DNA lezyonlarını işleyememenin DNA onarım ara ürünlerinin birikimiyle sonuçlandığını göstermek için kullanılabilir.Merhaba, benim adım Arthur Ian. Portland Eyalet Üniversitesi'ndeki Corella Laboratuvarı'ndayım. Merhaba, benim adım Brand she, ben de Corella Laboratuvarı'ndayım.Bugün sizlere iki boyutlu jel elektroforez prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü DNA replikasyon ve onarım ara ürünlerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Bu prosedüre başlamak için, ampicillin içeren DGC thigh ortamında 37 °C'de PBR 3 22 plazmidini taşıyan e coli'den 200 µL'lik gece boyu kültür geliştirin. DGC thigh ortamının kullanımı UV korumasını minimize eder. Gece boyu inkübasyonun ardından hücreleri 14.000 RPM'de 30 saniye boyunca pelletleyin.Ardından, hücre peletini ampisilin içermeyen 200 µL DG C th ortamında yeniden süspanse edin ve inoküle edin. 20 mL DG C thigh ortamında, ampisilin seçimi olmadan, 37 °C'deki çalkalamalı inkübatörde OD 600 değeri 0,5'e (bu değer yaklaşık 5 × 10⁸ hücre/mL'ye karşılık gelir) ulaşana kadar kültürleri büyütün. Ampisilin olmadan büyütme işlemi, bazı mutantlarda ortaya çıkabilecek anormal veya üretken olmayan replikasyon ara ürünlerine karşı seçilimi önler.Ek olarak, hasarı indüklemek için UV ışığı kullanılıyorsa, ampisilinin ortamdan uzaklaştırılması gereklidir; çünkü ampisilin bu dalga boylarında güçlü bir absorbsiyon göstererek koruyucu etki yapar ve hücreler büyürken etkili UV dozunu azaltır. Metrekare başına saniyede yaklaşık bir J/m²/s'lik bir maruziyet hızı üreten 15 watt'lık bir germisidal lambaya olan mesafeyi belirlemek için bir UVC fotometresi kullanın.UV ışınlamasından sonra fotoliyaz tarafından siklobütan pirimidin dimerlerinin foto-reaktivasyon tersinmesini önlemek için sonraki adımlar sarı ışık altında gerçekleştirilmelidir. İstenen hücre yoğunluğuna ulaşıldığında, tüm hücre popülasyonunun eşit şekilde ışınlanmasını sağlamak için kültürü bir pipet yardımıyla döner bir platform üzerindeki 15 santimetre çapındaki Petri kabına aktarın. Ardından, kültürleri 50 joules per meter squared ile ışınlayın ve hemen steril, önceden ısıtılmış bir flaska aktararak 37 degrees Celsius'lik çalkalamalı inkübatöre geri yerleştirin.Deney süresi boyunca bu doz, incelenecek her bir zaman noktası için tek zincirli DNA'nın her 4.5 kilobazında ortalama bir siklobütan pirimidin dimeri oluşturur. Kültürden 0.75 mililitrelik bir alikotu, 0.75 mililitre buz soğukluğundaki net 30 tamponuna pipetleyin. Net 30 tamponu, replikasyonun ve nükleotid eksizyon onarımının ilerlemesini engelleyen bir durdurma tamponu görevi görür.Durdurma tamponu eklendikten sonra, örnekler zaman serisi tamamlanana kadar buz üzerinde bekletilebilir. Zaman serisinin ardından her bir örneği pelletleyin ve pelletleri yeniden süspande edin. Hücreleri 150 µL lizis tamponu içerisinde, karıştırmadan 37 °C'de 20 dakika boyunca lize edin.Tek zincirli bölgeler veya dallanma noktaları içeren yapıların replikasyonu kesme kuvvetlerine karşı daha hassas olduğundan, ağız kısmını genişletmek ve kesme kuvvetlerini en aza indirmek için pipet uçlarını bir jiletle kesin. Genel olarak, DNA restriksiyon enzimleri ile sindirilene kadar pipetleme ve ajitasyon minimum düzeyde tutulmalıdır; lizisten sonra proteinaz K ve sarkosyl ekleyin ve inkübasyonun bir saat daha devam etmesini sağlayın. Bu işlem, proteinle ilişkili DNA fragmanlarının serbest kalmasını sağlar.Aktif olarak replike olan DNA genellikle protein veya membran komplekslerine bağlı olduğundan, bu işlem replikasyon fragmanlarının veriminin artmasına yardımcı olur. Bir saat sonra, her örneğe iki hacim fenol ekleyip tüpleri beş dakika boyunca hafifçe ters yüz ederek örnekleri ekstrakte edin. Ardından iki hacim kloroform, izoamil alkol ekleyin ve tüpleri beş dakika daha hafifçe ters yüz edin.Ardından, örnekleri bir mikrosantrifüjde 14, 000 RPM hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin ve her örneğin üstteki sulu fazını yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra dört hacim kloroform ISO alkol ekleyin ve tüpleri tekrar beş dakika boyunca nazikçe altüst ederek karıştırın. Örnekleri yeniden 14, 000 RPM hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin.Bir behere 250 milliliters 0.1 xte koyun, üzerine bir diyaliz membranı yerleştirin ve membranın üzerine her bir örnekten 100 microliters damlatın. Örneklerin bir saat boyunca diyaliz olmasını bekleyin. Her bir örnekten 80 microliters alarak, içerisinde 20 microliters enzim karışımı bulunan yeni bir 1.5 milliliter tüpe aktarın.Numuneleri 37 °C'de gece boyunca sindirin. PV two, plazmidi replikasyon orijininin hemen aşağısından lineerize eder. Agaroz jeli yüklemeden önce, 100 µL kloroform ve bromo içeren 6x yükleme boyasının 20 µL'sini ekleyin.Her örneğe fenol mavisi ve ksilen siyanı ekleyin ve karıştırın; kloroform, DNA uçlarına bağlı kalan tüm PV two'ları uzaklaştıracaktır. Kısıtlanmış DNA örneklerini birinci boyuttan geçirerek iki boyutlu agaroz jel analizine başlayın. İlk olarak, önceden hazırlanmış 1X TBE içerisindeki %0,4'lük agaroz jelin ilk kuyucuğuna Lambda hind three boyut markörü yükleyin.Ardından, jel dilimlemeyi kolaylaştırmak için şeritler atlayarak, her bir örnek için yükleme boyası içeren sulu fazdan 40 µL yükleyin. Elektroforezi takiben, birinci boyutu santimetre başına bir volt gerilimle yaklaşık 12 ila 15 saat boyunca çalıştırın. Düşük voltaj ve düşük yüzdeli AGROS jeli, DNA fragmanlarını öncelikle boyutlarına göre ayırmaya hizmet eder.Birinci boyut çalışması tamamlandıktan sonra, Lambda Hind III markörünü içeren birinci şeridi kesip çıkarmak için büyük bir kasap bıçağı kullanın ve etidyum bromür ile boyayın. İkinci boyut için, Lambda Hind III markörünü kılavuz olarak kullanarak jel şeritlerini büyük kasap bıçağı ile dilimleyin; her şeritte lineerize plazmidin ilerlemesinin beklendiği bölgenin altındaki kısmı kesin ve atın. İkinci boyutu dökmek için, her bir dilimi boş bir jel döküm kalıbının üst kısmına yatay olarak yerleştirin.Bir XTBE içerisinde %1 AROS çözeltisi hazırlayın ve 55 °C'ye kadar soğutun. Soğuduktan sonra, jel dilimlerini tamamen kapladığından emin olarak, ikinci boyutu dökmek için jel çözeltisini dökün. Jeli dökmeden önce dilimlerin eşit şekilde yönlendirildiğinden ve döküm düzeneğinin teraziyle dengelendiğinden emin olmak önemlidir.Jel donduktan sonra, tamponun yeniden dolaşımına izin veren bir elektroforez ünitesinde, santimetre başına 6,5 volt ile beş buçuk ila yedi saat boyunca ikinci boyutu çalıştırın; yüksek voltaj ve yüksek yüzdeli Agros jeli, DNA fragmanlarını boyutlarının yanı sıra şekillerine göre de etkili bir şekilde ayırır. Doğrusal olmayan şekiller, elektroforezi takiben ikinci boyutta daha yavaş ilerler. Jeli bir kez suyla durulayın ve ardından 400 mililitre 0,25 molar hidroklorik asit içerisinde, hafif ajitasyonla 15 dakika boyunca iki kez yıkayın.Asit yıkamaları, DNA moleküllerini Southern analizinde daha verimli transfer edilen daha küçük fragmanlara kısmen bölmeye yarar; bu işlem, DNA replikasyon ara ürünlerinin büyük boyutu ve olağan dışı şekli nedeniyle gereklidir. Jeli alkali transfere hazırlamak için, jeli tekrar su ile durulayın, ardından 30 dakika boyunca 400 mililitre 0,4 molar sodyum hidroksitte iki kez yıkayın. Jellerdeki DNA, bu prosedürün yazılı kısmında açıklandığı üzere, 0,4 molar sodyum hidroksit içeren aşağı yönlü bir alkali transfer sistemi kullanılarak yüksek bağlayıcı n artı naylon membrana transfer edilir; DNA transferinin 6 ila 12 saat sürmesine izin verin ve DNA transferinin ardından yazılı protokolde belirtildiği şekilde prob hibridizasyonu ile devam edin.Membran problandıktan ve yıkandıktan sonra, sıvı görünür şekilde kaybolana kadar membranı bir kağıt havlu üzerine yerleştirin. Ardından membranı polivinil klorür plastik film ile sarın ve bir fosfor imajlama ekranına maruz bırakın. Son olarak, radyoaktivite bir storm eight 40 ve onunla ilişkili image quant kullanılarak görselleştirilebilir ve nicelendirilebilir.2D agaroz jel analizi ile gözlemlenen, iki adet kısıtlanmış PBR 3 22 plazmidinin göç paterni şematize edilmiştir. Replike olmayan lineer plazmidler, 4.4 KB'lık lineer fragmanlar olarak ilerler; replike olan plazmid formları ise daha büyük boyutları ve lineer olmayan şekilleri nedeniyle replike olmayan fragmanlardan daha yavaş göç eden Y şeklinde yapılar oluşturur. Bu göç paterni, UV ışınlamasının ardından lineer bölgeden kuyuya doğru uzanan bir ark oluşturur.Koni bölgesinde çift Y veya X şeklinde moleküller gözlemlenir ve bunlar Y şeklindeki molekül arkından daha yavaş göç ederler. P 32 etiketli PBR 3 22 ile problanan 2D jelin güney analizine bir örnek, UV ışınlamasından hemen sonraki hücreler ve UV ışınlamasından 15 dakika sonraki hücreler için gösterilmiştir. Radyasyon sonrası hücreler eksponansiyel fazda hızla büyüdüğünde, toplam plazma DNA'sının yaklaşık %1'i Y arkında bulunabilir.Hasarlı bölgelerde bloke olmuş replikasyon çatallarının birikmesiyle birlikte, Y şeklinde moleküllerde geçici bir artış gözlemlenir. L şeklindeki replikasyon ara ürünleri de geçici olarak birikir ve lezyonların onarıldığı zamanla ilişkili bir süreye kadar kalmaya devam eder. Size, iki boyutlu jel elektroforezi kullanarak DNA onarım ara ürünlerinin nasıl görselleştirileceğini göstermiş olduk.Bu prosedürü uygularken, verimi düşürebilecek makaslama kuvvetlerinin farkında olmak ve tüm numunelere ve jellere nazik davranmak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

visualization-uv-induced-replication-intermediates-e-coli-using-two

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, gerçek zamanlı olarak bireysel replisomes DNA replikasyonu görselleştirmek için basit bir tek-molekül floresan mikroskopi tekniği gösterir.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

DT40 bir model omurgalı genetik sistemi, protein fonksiyonu analiz etmek için güçlü bir araç sağlar. Burada tek bir molekül düzeyinde DT40 hücrelerinde S-fazında DNA sentezi etkileyen parametreler nitel analiz sağlayan basit bir yöntem açıklanmaktadır.

DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Kaynak: Cayron, J. ve Lesterlin, C. Stres Tedavileri Altında Bakteri Büyümesinin Çok Ölçekli Analizi. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, canlılığı ölçmek için kaplama ve hücre boyutunu ve DNA içeriğini analiz etmek için akış sitometrisi kullanarak hücre bölünmesini inhibe eden antibiyotik tedavisi altında E. coli filamentasyonunu ve DNA replikasyonunu değerlendirme prosedürünü göstermektedir.

E. coli'de Antibiyotiğe Bağlı Filamentasyonun Kaplama Testi ve Akış Sitometrisi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Kaynak: Mettrick, K. A., Lawrence ve diğerleri, Floresan Repressör Operatör Sistemi Kullanarak E. coli'de Site-Specific Replikasyon Tıkanıklığının İndüksiyonu. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, kromozom tetO dizilerine bağlanan sarı floresan protein etiketli TetR'nin arabinoz kaynaklı ekspresyonu kullanarak Escherichia coli'de siteye özgü replikasyon çatal tıkanıklığını göstermektedir.

Escherichia coli'de floresan etiketli repressör protein aracılı replikasyon blokajı

Kaynak: Bratton, B. P. ve ark., Doğru hücresel temsiller ve hassas protein lokalizasyonu için bakteriyel hücrelerin üç boyutlu görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, tek hücre düzeyinde protein organizasyonunu incelemek için bakteriyel hücrelerin üç boyutlu floresan görüntülerini edinme ve analiz etme yöntemini göstermektedir.

Floresans görüntüleme ile bakteriyel protein dağılımının üç boyutlu görselleştirilmesi

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Isolation and Visualization of Rotavirus Genome via Gel Electrophoresis

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Transkripsiyon faktörü (TF) DNA bağlanmasını etkileyen kodlamayan genetik varyantları tanımlamak için stratejik bir plan ve protokol sunuyoruz. Genotipe bağlı TF DNA bağlanmasının elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) ve DNA afinite çökeltme testi (DAPA) analizi için ayrıntılı bir deneysel protokol sağlanmıştır.

Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA)

Burada, Escherichia coli'deki replikasyon çatallarını durdurmak ve çökertmek için bölgeye özgü, geri dönüşümlü in vivo protein bloğu kullanan bir sistemi tarif ediyoruz. Replikasyon bloğunun kurulması floresan mikroskobu ile değerlendirilir ve replikasyon ara ürünlerini görselleştirmek için nötr-nötr 2 boyutlu agaroz jel elektroforezi kullanılır.

Bir Siteye Özel çoğaltma Blokaj içinde uyaran<i&gt; E. E. coli</i&gt; Bir Floresan Baskılayıcı Operatör Sisteminin Kullanılması

Burada, 2 boyutlu jel elektroforezi kullanarak patojenik, yapıya eğilimli tekrarlar yoluyla replikasyon ilerlemesini analiz etme prosedürünü özetliyoruz.

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

Öğrenin, UV hasarı sonrası DNA çoğaltma ara yapılarını iki boyutlu agaroz-jel analizi ile görselleştirme yöntemini. Bu teknik, E. coli hücrelerinde DNA onarım mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi

Daha fazla video keşfet