UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi

Bu prosedürün genel amacı, iki boyutlu jel analizi kullanarak replikasyon DNA lezyonlarıyla karşılaştığında ortaya çıkan DNA yapısal ara ürünlerini görselleştirmektir. Bu, ilk olarak DNA'nın, replikasyonu bloke eden lezyonların indüklendiği aktif olarak bölünen hücrelerden izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, geri kazanılan DNA'yı boyuta göre ayırmak için jel elektroforezi kullanılır.

Daha sonra, şeritler kesilir ve DNA'yı hem boyut hem de şekle göre daha da ayıran ikinci bir jelde yatay olarak yeniden şekillendirilir. Son olarak, güney analizi, UV kaynaklı hasarın ortaya çıkmasından önce ve sonra çeşitli zamanlarda DNA fragmanlarının kopyalanmasıyla ilişkili DNA yapılarını görselleştirmek için kullanılır. Sonuç olarak, bu prosedür, bazı mutantlarda DNA lezyonlarının işlenememesinin DNA onarım ara maddelerinin birikmesine neden olduğunu göstermek için kullanılabilir.

Merhaba, benim adım Arthur Ian. Portland Eyalet Üniversitesi'ndeki Corella Laboratuvarı'ndanım. Merhaba, benim adım Brand o, ben de Corella Lab'denim.

Bugün size iki boyutlu jel elektroforezi için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda DNA replikasyonunu incelemek ve ara ürünleri onarmak için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Bu prosedüre başlamak için, 37 santigrat derecede ampisilin ile DGC uyluk ortamında plazmid PBR 3 22 içeren 200 mikrolitrelik bir gece boyunca e coli kültürü büyütün. DGC uyluk ortamının kullanılması UV korumasını en aza indirir. Gece boyunca inkübasyonun ardından, hücreleri 30 saniye boyunca 14.000 RRP M'de peletleyin.

Daha sonra hücre peletini 200 mikrolitre DG C inci ortamda ampisilin içermeyen yeniden süspanse edin ve aşılayın. Ampisilin seçimi olmadan 20 mililitre DG C uyluk ortamı yetiştirme kültürleri. 37 santigrat derecede çalkalama inkübatöründe 0.5'lik bir OD 600'e, bu da yaklaşık beş kez 10 ila sekizinci hücrelere karşılık gelir Ampisilin olmadan mililitre başına büyüme, bazı mutantlarda ortaya çıkabilecek anormal veya verimsiz replikasyon ara maddelerine karşı seçimi önler.

Ek olarak, hasarı indüklemek için UV ışığı kullanılıyorsa, ampisilinin ortamdan çıkarılması gereklidir, çünkü bu dalga boylarında ve kalkanlarda güçlü bir şekilde emer. Hücreler büyürken etkili UV dozunu azaltır. Saniyede metre kare başına yaklaşık bir JUUL maruz kalma oranı üreten 15 watt'lık bir antiseptik lambaya olan mesafeyi belirlemek için bir UVC fotometre kullanın.

Sonraki adımlar sarı ışık altında gerçekleştirilmelidir, çünkü bu, UV ışınlamasından sonra foto liaz ile siklo bütan perin dimerlerinin foto reaktivasyonunu tersine çevirmesini önleyecektir. İstenen hücre yoğunluğuna ulaşıldığında, tüm hücre popülasyonunun eşit şekilde ışınlanmasını sağlamak için kültürü dönen bir platform üzerinde 15 santimetre çapında bir Petri kabına aktarmak için bir pipet kullanın. Daha sonra, kültürleri metre kare başına 50 jul ile ışınlayın ve hemen steril bir ön ısıtma şişesine aktarın ve tekrar çalkalanan 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.

Deney süresince, bu doz, incelenecek her zaman noktası için her 4.5 kilobaz tek sarmallı DNA olmak üzere ortalama bir siklo bütan perin dimer üretir. Kültürün 0.75 mililitrelik bir alikotunu 0.75 mililitre buz gibi soğuk ağa 30 pipetleyin. Buffer net 30, replikasyon ve nükleotid eksizyon onarımının ilerlemesini önleyen bir durdurma tamponu görevi görür.

Durdurma tamponu eklendikten sonra, numune zaman seyrinin sonuna kadar buz üzerinde tutulabilir. Zaman seyrinden sonra, her numuneyi peletleyin ve peletleri yeniden süspanse edin. 150 mikrolitre lizis tamponunda, hücreleri 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca çalkalama olmadan parçalar.

Tek iplik bölgelerine veya dallanma noktalarına sahip yapıları çoğaltmak kesmeye daha duyarlı olduğundan, ağzı daha geniş hale getirmek ve kesme kuvvetlerini en aza indirmek için pipet uçlarını bir tıraş bıçağıyla kesin. Genel olarak, pipetleme ve çalkalama minimumda tutulmalı, DNA restriksiyon enzimleri ile sindirilene kadar, lizizi takiben proteinaz K ve sarcas hücresi eklenmeli ve inkübasyonun bir saat devam etmesine izin verilmelidir. Bu, protein ile ilişkili DNA parçalarının serbest bırakılmasına hizmet eder.

Aktif olarak kopyalanan DNA genellikle protein veya zar komplekslerine bağlı olduğundan, bu, replikasyon parçalarının verimini artırmaya yardımcı olur. Bir saat sonra, her numuneye iki hacim fenol ekleyerek ve tüpleri beş dakika boyunca hafifçe ters çevirerek numuneleri çıkarın. Daha sonra iki hacim kloroform, izoamil, alkol ekleyin ve tüpleri beş dakika daha yavaşça ters çevirin.

Daha sonra, numuneleri 14.000 RPM'de bir mikro santrifüjde beş dakika santrifüjleyin ve her numunenin üst sulu fazını taze bir tüpe aktarın. Daha sonra dört hacim kloroform ISO alkol ekleyin ve tekrar tüpleri beş dakika boyunca yavaşça ters çevirin. Numuneleri beş dakika boyunca 14.000 RPM'de tekrar santrifüjleyin.

Bir beherde 250 mililitre 0.1 xte'nin üzerine bir diyaliz membranı yerleştirin ve her numuneden 100 mikrolitreyi membranın üzerine yerleştirin. Numunelerin diyalizden sonra bir saat diyalize girmesine izin verin. Her numuneden 80 mikrolitreyi, 20 mikrolitre enzim karışımı içeren 1,5 mililitrelik taze bir tüpe yerleştirin.

Numuneleri gece boyunca 37 santigrat derecede sindirin. PV iki, plazmiti replikasyon kaynağından hemen aşağı akışta doğrusallaştırır. Agros jeli yüklemeden önce, 100 mikrolitre kloroform ve 20 mikrolitre bromo içeren altı x yükleme boyası ekleyin.

Her numuneye fenol mavisi ve ksilen camgöbeği ve karışım kloroformu, DNA uçlarına bağlı kalan PV'yi iki kez sıyırır. Kısıtlı DNA örneklerini birinci boyuttan geçirerek iki boyutlu aros jel analizine başlayın. İlk olarak, bir XTBE'de önceden hazırlanmış %0.4 agros jelin ilk şeridine bir Lambda arka üç boy işaretleyici yükleyin.

Ardından, jel dilimlemeyi kolaylaştırmak için şeritleri atlayarak her numune için yükleme boyasını içeren 40 mikrolitre sulu faz yükleyin. Elektroforezin ardından, ilk boyutu yaklaşık 12 ila 15 saat boyunca santimetre başına bir voltta çalıştırın. Düşük voltajlı ve düşük yüzdeli AGROS jeli, DNA parçalarını öncelikle boyuta göre ayırmaya yarar.

İlk boyut çalıştırıldıktan sonra, Lambda arka üç işaretleyicisini içeren ilk şeridi kesmek için büyük bir kasap bıçağı kullanın ve atherium bromür ile boyayın. İkinci boyut için, Lambda Hind üç işaretleyiciyi kılavuz ürün olarak kullanarak büyük kasap bıçağını kullanarak jel şeritlerini kesin ve doğrusallaştırılmış plazmidin her şeritte çalışmasının beklendiği aşağıdaki bölgeyi atın. İkinci boyutu dökmek için, her dilimi boş bir jel tekerin üstüne yatay olarak yerleştirin.

Bir XTBE'de% 1'lik bir AROS çözeltisi hazırlayın ve 55 santigrat dereceye kadar soğutun. Soğuduktan sonra, jel dilimlerini tamamen kapladığınızdan emin olarak ikinci boyutu dökmek için jel solüsyonunu dökün. Jeli dökmeden önce dilimlerin eşit şekilde yönlendirildiğinden ve tekerin seviyesinde olduğundan emin olmak önemlidir.

Jel sertleştikten sonra, ikinci boyutu, tamponun yüksek voltajı yeniden dolaştırmasına izin veren bir elektroforez ünitesinde santimetre başına 6.5 hacimde beş buçuk ila yedi saat çalıştırın ve yüksek yüzde Agros jeli, DNA parçalarını şekillerine ve boyutlarına göre etkili bir şekilde ayırır. Doğrusal olmayan şekiller, elektroforezi takiben ikinci boyutta daha yavaş ilerler. Jeli bir kez suyla durulayın ve ardından 400 mililitre 0.25 molar hidroklorik asit içinde 15 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak iki kez yıkayın.

Asit yıkamaları, DNA moleküllerini, güney analizi sırasında daha verimli bir şekilde transfer edilen ve DNA replikasyon ara ürünlerinin büyük boyutu ve olağandışı şekli nedeniyle gerekli olan daha küçük parçalara kısmen çentiklemeye hizmet eder. Jeli alkali transferine hazırlamak için jeli tekrar suyla durulayın, ardından 400 mililitre 0.4 molar sodyum hidroksit içinde 30 dakika boyunca iki kez yıkayın. Jellerdeki DNA daha sonra, bu prosedürün yazılı kısmında tarif edildiği gibi 0.4 molar sodyum hidroksit ile aşağı doğru bir alkali transfer sistemi kullanılarak yüksek bağlı bir n artı naylon membrana aktarılır, DNA transferini takiben altı ila 12 saat boyunca DNA transferine izin verin yazılı protokolde belirtildiği gibi prob hibridizasyonuna devam edin.

Membran incelendikten ve yıkandıktan sonra, sıvı gözle görülür şekilde kaybolana kadar membranı bir kağıt havlu üzerine yerleştirin. Ardından membranı polivinil klorür plastik sargıya sarın ve bir fosfo görüntüleyici ekranına maruz bırakın. Son olarak, radyoaktivite, bir fırtına sekiz 40 ve bununla ilişkili görüntü niceliği kullanılarak görselleştirilebilir ve ölçülebilir.

2D aros jel analizi ile gözlemlenen PV iki sindirilmiş PBR 3 22 plazmidinin migrasyon paterni diyagramize edilmiştir. Replike olmayan doğrusal plazmitler, daha büyük boyutları ve doğrusal olmayan şekilleri nedeniyle replike olmayan fragmanlardan daha yavaş göç eden doğrusal 4.4 KB fragman replikasyon plazmidi form Y şekilli yapılar olarak çalışır. Bu göç modeli, UV ışınlamasını takiben doğrusal bölgeden kuyuya doğru uzanan bir yay oluşturur.

Çift Y veya X şeklindeki moleküller koni bölgesinde gözlenir ve Y şeklindeki moleküllerin yayından daha yavaş göç eder. P 32 etiketli PBR 3 22 ile problanan 2D jelin güney analizinin bir örneği, UV ışınlamasından hemen sonra ve UV ışınlamasından hemen sonra UV ışınlamasından 15 dakika sonra hücreler için gösterilmiştir. Toplam plazma DNA'sının yaklaşık% 1'i, hücreler bir radyasyonu takiben üstel fazda hızla büyüdüğünde Y arkında bulunabilir.

Hasarlı bölgelerde bloke replikasyon çatalları biriktikçe YS şeklindeki moleküllerde geçici bir artış gözlenir. L şeklindeki replikasyon ara ürünleri de geçici olarak, birikir ve lezyonların onarıldığı zaman ile ilişkili bir zamana kadar devam eder. Size iki boyutlu jel elektroforezi kullanarak DNA onarım ara ürünlerini nasıl görselleştireceğinizi gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, verimi azaltabilecek kesme kuvvetlerinin farkında olmak ve tüm numunelere ve jellere karşı nazik olmak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.