Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA)

Bu deneysel stratejinin genel amacı, hastalıkla ilişkili kodlamayan varyantların işlevselliğini araştırmaktır. Bu yöntem, aslında amino asit dizisini değiştirmeyen genetik varyantların hala hastalık fenotipine nasıl katkıda bulunduğu gibi genomikteki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fonksiyon aktivitesi için genetik varyansı değerlendirmek için kolaylaştırılmış bir süreç sağlaması ve düzenleyici proteinler ve etkilenen yollar hakkında fikir vermesidir.

Bu teknik, aday nedensel varyantı olan herhangi bir hastalığın araştırılmasına fayda sağlayabilir. Çünkü bu varyantları analiz etme prosedürü, incelenen fenotipten bağımsız olarak evrenseldir. Bu yöntem insan hastalıkları hakkında bilgi verebilse de, herhangi bir organizmadaki mutasyonlara da uygulanabilir.

Bu deneyde B-lenfoblastoid hücrelerden nükleer lizatlar hazırlanacaktır, ancak bu prosedür çoğu hücre hattına uygulanabilir. Bir hemositometre kullanarak hücreleri saydıktan sonra, parçalanmak için istenen hücre sayısını aşağı doğru döndürün. Ortamı aspire edin, 10 mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve hücreleri tekrar döndürün.

Hücreleri PBS ile ikinci kez yıkayın ve sıkma işleminden sonra PBS'yi çıkarın. 10 ila yedinci hücreler için bir mililitre PBS kullanarak buz gibi soğuk PBS'de hücre damağını yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun bir mililitresini 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine bağlayın, böylece her tüp PBS'de 10 ila yedinci hücre içerir.

İki dakika santrifüjleyin ve PBS'yi aspire edin. Çalışan bir CE tamponu, bir milimolar dithiothreitol veya DTT, 1X fosfataz inhibitörü ve 0.5 milimolar Fenilmetansülfonil florür veya PMSF stoğuna ekleyin. Her hücre paletini bu tamponun 400 mikrolitresi ile yeniden süspanse edin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Her bir mikrosantrifüj tüpüne 25 mikrolitre %10 Nonidet P-40 ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Dört santigrat derecede ve üç dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve atın.

Daha sonra, çalışan bir NE-tampon stoğuna, bir milimolar DTT, 1X fosfoaz inhibitörü ve bir milimolar PMSF ekleyin. Her hücre damağını bu tamponun 30 mikrolitresi ile yeniden süspanse edin ve girdaplama ile karıştırın. 4 santigrat derecede, bir tüp döndürücüde 10 dakika inkübe edin.

İki dakika santrifüjleyin. Nükleer lizat olan berrak süpernatanı toplayın. Proteini bozabilecek çoklu donma çözülme döngülerini önlemek için eksi 80 santigrat derecede saklamadan önce nükleer lizatı alikotlayın.

Bu prosedüre, protokol metninde açıklandığı gibi oligonükleotidin 50 nanomolar çalışma stoğunu hazırlayarak başlayın. Oligoları beş dakika boyunca 90 santigrat derecede bir ısı bloğuna yerleştirin. Beş dakika sonra, ısı bloğunu kapatın ve kullanmadan önce en az bir saat boyunca oligoların yavaşça oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.

Daha sonra elektroforetik hareketlilik kayma testini veya EMSA jelini hazırlayın. Slaytı önceden dökülmüş, yüzde altı tris-borat-EDTA veya TBE jelden çıkarın ve kuyucuklardaki herhangi bir tamponu çıkarmak için birkaç kez deiyonize su altında durulayın. Jel elektroforez aparatını monte edin ve iç hazneyi 0.5X TBE tamponu ile doldurarak sızıntı olup olmadığını kontrol edin.

Dış hazneye tampon sızmazsa, dış hazneyi kabaca üçte ikisini doldurun. Jeli 60 dakika boyunca 100 voltta önceden çalıştırın. Ön çalışma tamamlandığında, her bir kuyuyu 200 mikrolitre 0.5X TBE tamponu ile yıkayın.

Bir bağlayıcı arabellek ana karışımı hazırlayın. Bir mikrosantrifüj tüpünde, tüm reaksiyonlar için ortak olan bu reaktifleri karıştırın. 10X bağlayıcı tampon, DTT polisorbat, Poli (dI-dC) ve somon sperm DNA'sı.

EMSA reaksiyonlarını ayarlamak için, her bir mikrosantrifüj tüpüne nükleaz içermeyen su ekleyin, böylece tüm reaktiflerin eklenmesini takiben nihai hacim 20 mikrolitre olacaktır. Her bir mikrosantrifüj tüpüne uygun miktarda ana karışım ekleyin. Uygun mikrosantrifüj tüplerine sekiz mikrogram nükleer lizat ekleyin.

Negatif kontroller olarak, nükleer ekstrakt içermeyen oligo içeren tüpleri dahil edin. Uygun mikrosantrifüj tüplerine 50 femtomol oligo ekleyin ve karıştırmak için hafifçe vurun. İçeriği kısaca tüpün dibine döndürün.

Tüm tüpleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Ardından, her bir mikrosantrifüj tüpüne iki mikrolitre 10X turuncu yükleme boyası ekleyin. Karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.

Numuneleri, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek ve ardından her bir numuneyi ayrı bir kuyuya atarak çalışma öncesi yüzde altı TBE jele yükleyin. Jeli 80 voltta yaklaşık 60 ila 75 dakika boyunca, turuncu boya jelin üçte ikisi ila dörtte üçü boyunca göç edene kadar çalıştırın. Çalışma tamamlandığında, plastik kaseti açmak için bir jel bıçak kullanın.

Jeli kasetten çıkarın ve kurumasını önlemek için yüzde 0,5 TBE tamponlu bir kaba koyun. Jeli kızılötesi ve kemilüminesans görüntüleme sisteminin yüzeyine yerleştirin. Görüntüyü bozacak baloncukları veya kirleticileri ortadan kaldırın.

Protokol metninde açıklandığı gibi tarama sistemi yazılımını kullanarak jeli tarayın. Bu prosedüre başlamak için, protokol metninde açıklandığı gibi beş mikromolar oligo çalışma stoğu hazırlayın. Oligoları beş dakika boyunca 95 santigrat derecede bir ısı bloğuna yerleştirin.

Beş dakika sonra, ısı bloğunu kapatın ve kullanmadan önce oligoların yavaşça oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Aşağıdaki tamponları oda sıcaklığına ısıtın: bağlama tamponu, düşük sıkılıklı yıkama tamponu, yüksek sıkılıkta yıkama tamponu ve elüsyon tamponu. Her varyant için bağlayıcı karışımları hazırlayın.

Bir hacim nükleer lizatı iki hacim bağlayıcı tampon ile karıştırın. 1X fosfataz inhibitörü, 0.5 milimolar PMSF ve 1X bağlanma arttırıcı ekleyin. Her bağlanma karışımına 10 mikrolitre beş mikromolar biyotinile yakalama DNA'sı ekleyin.

Tüpü birkaç kez hafifçe vurarak karıştırın. Bağlayıcı karışımları oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, her bir bağlama karışımına 100 mikrolitre streptavidin MicroBeads ekleyin.

Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Test edilen her oligo probu için, manyetik ayırıcıya bir bağlama sütunu yerleştirin. Sütunların bağlama karışımında kullanılan varyant oligo ile etiketlendiğinden emin olun.

Her bir bağlama kolonunun altına doğrudan bir mikrosantrifüj tüpü yerleştirin ve kolonu durulamak için 100 mikrolitre bağlama tamponu uygulayın. Her bir bağlayıcı karışımın içeriğini ayrı sütunlara pipetleyin. Sıvının kolondan tamamen mikrosantrifüj tüpüne akmasına izin verin.

Kolona 100 mikrolitre düşük sertlikte yıkama tamponu uygulayın ve kolon haznesi boşalana kadar bekleyin. Kolona tekrar 100 mikrolitre düşük sertlikte yıkama tamponu uygulayın. Kolona 100 mikrolitre yüksek sıkılıkta yıkama tamponu uygulayın ve kolon haznesi boşalana kadar bekleyin.

Kolona tekrar 100 mikrolitre yüksek sıkılıkta yıkama tamponu uygulayın. Kolona 30 mikrolitre doğal elüsyon tamponu ekleyin ve beş dakika bekletin. Son olarak, bağlı transkripsiyon faktörlerini elüte etmek için ek bir 50 mikrolitre doğal elüsyon tamponu ekleyin.

EMSA sonuçlarının tekrarlanabilirliğini ve donma çözülme döngülerinin sonuçlarını araştırmak için, birden fazla dondurma ve çözülme döngüsünden sonra aynı B-lenfosit nükleer ekstraktının preparatını araştırmak için genetik bir varyantın referans veya referans olmayan alelini içeren oligolar kullanıldı. Mavi ok, serbest probu gösterir. Transkripsiyon faktörlerinin oligoya bağlanması, jelin üst yarısında kırmızı okla gösterilen bir bant olarak görülür.

Bu sonuçlar, bu özel nükleer ekstraktın beş defaya kadar dondurulmasının ve çözülmesinin, proteinlerin bütünlüğü üzerinde görünüşte hiçbir etkisi olmadığını göstermektedir. EMSA için sinyal-gürültü oranını optimize etmek de önemlidir. Tek bir nükleer lizat preparatını araştırmak için çeşitli oligo konsantrasyonları kullanıldı.

Bandın yoğunluğunda bir artış, 100 femtomollere kadar oligo gözlendi. Lupus ile ilişkili bir risk aleli çalışmasından elde edilen temsili sonuçlar burada gösterilmektedir. Transkripsiyon faktörü, STAT 1, ilk olarak DAPA ile tanımlandı ve ardından proteomik analiz yapıldı.

Bir DAPA western lekesi daha sonra STAT 1'in kimliğini ve fosforile STAT 1 formunun lupus risk oligosuna daha yüksek bağlanmasını doğruladı. Bu işlemi takiben kütle spektrometresi ve western blot gibi diğer teknikler de uygulanabilir. Bu, alele bağımlı bağlanmayı gösteren düzenleyici proteini tanımlamamıza yardımcı olacaktır.

Lusiferaz gibi raportör tahlilleri, alelin bir fonksiyonu olarak gen ekspresyonundaki değişiklikleri araştırmak için de kullanılabilir.