Name: Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Keşfedin kodlanmayan genetik varyantların işlevselliğini EMSA ve DAPA yöntemleriyle. Bu teknik, transkripsiyon faktörü DNA bağlanmasını analiz ederek hastalık mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Protokol geliştirmedeki katkıları ve yönlendirmeleri için Erin Zoller, Jessica Bene ve Lindsey Hays'e teşekkür ederiz. MTW, kısmen NIH R21 HG008186 ve Cincinnati Çocuk Hastanesi Araştırma Vakfı'ndan bir Mütevelli Ödülü hibesi ile desteklendi. ZHP kısmen T32 GM063483-13 tarafından desteklendi.

Çözümler ve Reaktiflerin hazırlanması 1. <ol><li> EMSA ve DAPA kullanılmak üzere özel DNA oligonükleotid probları sipariş edin. <ol><li> Kısa oligos tasarım spesifik olmayan bağlanma proteini azaltmak için 30, ve 17 bp&#39;lik endojen genomik sekans ile çevrili merkezi doğrudan özel bir varyantı yer (35-45 baz uzunluğunda çifti (bp) arasında). EMSA oligo için, bir 5 &#39;fluorofor ekleyin. DAPA oligos için, 5 &#39;biotin etiketini ekleyin. </li><li> duyu ipliği ve ters tamamlayıcı iplikçik hem sipariş edin. Alternatif olarak, sipariş dubleks (pre-tavlı) oligos. oligos adlandırırken, yerleşmiş bir referans genom üzerinde isimlendirme temel. Not: &quot;Risk&quot; ve hastalık ve projeye özel olabilir &quot;non-riski&quot; atama &quot;referans&quot; ve &quot;referans olmayan&quot; daha evrensel alakalı ise. </li><li> oligo Girişte, kısa bir süre için 100 u arasında nihai bir konsantrasyona kadar nükleaz içermeyen su içeriği ve tekrar süspansiyon aşağı spinM. -20 ° C&#39;de stoklarını yeniden süspanse edildi. alüminyum folyo ile sararak ışıktan bir fluorofor ile etiketlenmiş oligos koruyun. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> isim </td><td> Sıra </td></tr><tr><td> rs76562819_REF_FOR </td><td> GTAATGCCTTAATGAGAGAG bir GTTAGTCATCTTCTCACTTC </td></tr><tr><td> rs76562819_REF_REV </td><td> GAAGTGAGAAGATGACTAAC T CTCTCTCATTAAGGCATTAC </td></tr><tr><td> rs76562819_NONREF_FOR </td><td> GTAATGCCTTAATGAGAGAG G GTTAGTCATCTTCTCACTTC </td></tr><tr><td> rs76562819_NONREF_REV </td><td> GAAGTGAGAAGATGACTAAC Cı CTCTCTCATTAAGGCATTAC </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Örnek EMSA / DAPA oligonükleotid tasarımı diferansiyel bin bir SNP test etmek&quot;NONREF&quot; referans dışı alel açılımı ise ding. &quot;REF&quot;, referans alel anlamına gelir. &quot;İÇİN&quot; &quot;REV&quot; onun tamamlayıcısı gösterir iken, ileri iplikçik anlamına gelir. SNP kırmızı görülmektedir. <ol start="2"><li> bir son 10 mM HEPES (pH 7.9) &#39;ın konsantrasyonunun, 10 mM KCI ve deiyonize su içinde 0.1 mM EDTA ile sitoplazmik ekstraksiyon (CE) tamponu hazırlayın. </li><li> Nükleer ekstraksiyon (NE) bir son 20 mM HEPES (pH 7.9) &#39;ın konsantrasyonunun, 0.4 M NaCI ve deiyonize su içinde 1 mM EDTA tampon hazırlayın. </li><li> bir son 10 mM Tris (pH 7,5-8,0) konsantrasyonu, 50 mM NaCI ve deiyonize su içinde 1 mM EDTA ile tavlama tamponu hazırlayın. </li></ol> Kültürlenmiş hücrelerin çekirdekleri, lizat 2. Hazırlık Not: Bu deneysel protokol B limfoblastoid hücre çizgileri kullanılarak optimize edilmiştir, ancak birkaç diğer ilgisiz yapışkan / süspansiyon hücre hatları test edilmiş ve evrensel olarak çalışır. <ol><li> Cultu2 mM L-glutamin,% 10 fetal sığır serumu ve penisilin, 100 ünite / ml streptomisin, 100 ug / ml ihtiva eden 1x antibiyotik antimikotik ve 250 ng Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 B-lenfoblastoid hücreleri, yeniden amfoterisin B / ml <ol><li> 200,000-500,000 canlı hücre / ml &#39;lik bir mesafeden tohum ve delikli veya gevşek kapaklı dik olarak% 5 karbon dioksit ile 37 ° C&#39;de şişeler inkübe edin. Not: 1.000.000 hücre / ml ulaştığında B-lenfoblastoid hücrelerin büyümesi yavaşlar. yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı hücre patlamalar break up ve hızlı bir büyüme oranını korumak için 200,000-500,000 hücre / ml hücreleri dönün. </li></ol></li><li> 5 dakika boyunca, 4 ° C&#39;de, 300 xg durması ve aspirasyonla PBS kaldırmak, iki kez 10 ml buz soğukluğundaki fosfat tamponlu salin (PBS) ile kültürlenen hücreler yıkanır. </li><li> 10 7 hücre başına soğuk PBS 1 ml buz gibi bir hemositometre ve tekrar süspansiyon pelet kullanarak hücreleri saymak. Not: Örneğin, 2 x 10 7 lize halinde &lt;/ Sup&gt; hücreler, 2 ml PBS içinde tekrar süspansiyon. </li><li> Kısım 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine 1 mi, her boru PBS içinde 10 7 hücre içerecek şekilde. PBS kapalı 2 dakika 4 ° C ve aspirat için 3300 xg&#39;de santrifüj. </li><li> Kullanmak CE tampon çalışma stok 1 mM ditiyotreitol (DTT), 1 x fosfataz inhibitörü ve 1 x proteaz inhibitörü ilave önce. Tekrar süspansiyon hücre CE tampon 400 ul pelet ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> % 10 Nonidet P-40 25 ul ekleyin ve pipetleme karıştırın. 4 ° C, 3 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj. Durusu ve supernatant atın. </li><li> Kullanmak NE tampon çalışma stok 1 mM DTT, 1 x fosfataz inhibitörü ve 1 x proteaz inhibitörü ilave önce. Tekrar süspansiyon hücre NE tamponu 30 ul pelet ve vorteks karıştırın. </li><li> tüp rotator veya 10 dakika buz üzerinde 4 ° C&#39;de inkübe edin. Santrifüj 2 dakika 4 ° C 3300 xg. </li><li> En saklamadan önce berrak süpernatant (nükleer lizat) ve kısım toplayın -806 C proteini düşebilir birden donma-çözülme döngüleri önlemek için. Bichoninic asit deneyi (BCA) 31 kullanarak protein konsantrasyonunu ölçmek için bir 10 ul tablet bırakın. </li></ol> 3. Elektroforetik Devingenlik Değişimi Analizi (EMSA) <ol><li> Oligo Çalışma Stok ve EMSA Jel hazırlayın. <ol><li> oligos dubleks sipariş olsaydı, 100 mcM stok çözülme ve 1 sulandırmak: 2.000 tavlama tamponunda 50 nM çalışma stok elde etmek. </li><li> oligo tek şeritli sipariş edilen ise, 100 uM stokları çözünmesi ve 100 nM çalışma stokları elde etmek için tavlama tamponu içinde 1:10 oranında seyreltin. mikrosantrifüj tüpü içinde birbirleri ile 100 nM tamamlayıcı zinciri çözeltisi 100 ul birleştirin. <ol><li> 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;de bir ısı bloğunda yerleştirin. Isı bloğu kapatın ve oligo yavaş yavaş kullanımdan önce en az bir saat boyunca oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li></ol></li><li> EMSA Gel Öncesi çalıştırın. <ol><li> bir ön döküm% 6 T slaytı kaldırmakjel BE ve kuyulardan herhangi bir tampon kaldırmak için deiyonize suyun altında birkaç kez durulayın. iyonu giderilmiş su, 950 ml 10x TBE, 50 ml ekleyerek 0.5x TBE tamponu 1 L hazırlayın. </li><li> jel elektroforezi cihazı monte edin ve 0.5x TBE tamponu ile iç odasını doldurarak sızıntı olup olmadığını kontrol edin. tampon, dış odasına sızar ise, dış bölmesini şekilde kabaca üçte ikisi doldurun. </li><li> 60 dakika boyunca 100 V&#39;ta jel ön çalıştırın. </li><li> 0.5x TBE tamponu 200 ul her iyi yıkayın. </li></ol></li></ol></li><li> Tampon Master Mix Cilt hazırlayın. <ol><li> 100 mM Tris, 500 mM KCI, 10 mM DTT nihai bir konsantrasyona sahip bağlayıcı tampon 10x hazırlanması; iyonu giderilmiş su içinde, pH 7.5 olarak değiştirilmişti. </li><li> Mikrosantrifüj tüpü içinde, bütün reaksiyonlar (Tablo 2 ise 10 ul 10x bağlanma tamponu, 10 ul DTT / polisorbat, 5 ul Poli D (IC) ve 2.5 ul somon sperm DNA) ortak olan maddeler arasında meydana gelen bir ana karışımı oluşturur. ek bir% 10 hazırlayınpipetleme nedeniyle hacim kaybı hesaba. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reaktif </td><td> Final Kons. </td><td> 1. rxn </td><td> 2. rxn </td><td> 3. rxn </td><td> 4. rxn </td></tr><tr><td> Ultra Saf Su </td><td> 20 ul hacme. </td><td> 13.5 ul </td><td> 11.98 ul </td><td> 13.5μl </td><td> 11.98 ul </td></tr><tr><td> 10x Bağlama Tamponu </td><td> 1x </td><td> 2 ul </td><td> 2 ul </td><td> 2 ul </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> DTT / TW-20 </td><td> 1x </td><td> 2 ul </td><td> 2 ul </td><td> 2 ul </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Salmon sperm DNA&#39;sı </td><td> 500 ng / | il </td&gt; <td> 0.5 ul </td><td> 0.5 ul </td><td> 0.5 ul </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> 1 ug / ul Poli d (IC) </td><td> 1 ug </td><td> 1 ul </td><td> 1 ul </td><td> 1 ul </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Nükleer Ekstrakt (5.26 ug / ul), </td><td> 8 ug </td><td> - </td><td> 1.52 ul </td><td> - </td><td> 1.52 ul </td></tr><tr><td> NE Tampon </td><td></td><td> 1.52 ul </td><td> - </td><td> 1.52 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> Referans alel oligo </td><td> 50 fmol </td><td> 1 ul </td><td> 1 ul </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Sigara Referans alel oligo </td><td> 50 fmol </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 ul </td><td> 1 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Örnek EMSA reaksiyon setus. tablo genotip-bağımlı belirli bir SNP için TFs bağlanmasının olduğunu hipotezini test etmek için bir örnek EMSA göstermektedir. <ol start="3"><li> gibi tüm reaktifler ilave edildikten sonra nihai hacim 20 ul olacak her mikrosantrifüj tüpüne nükleaz içermeyen su ilave edilir. </li><li> Her mikrosantrifüj tüp ana karışımı uygun miktarda (5.5 ul) ekleyin. </li><li> Uygun mikrosantrifüj tüpler nükleer lizat 8 mikrogram ekleyin. Nükleer negatif kontroller olarak ekstraktı (Tablo 2, Rxn 1. ve Rxn # 3) olmadan oligo içeren tüpler ekleyin. Not: reaksiyon başına lizat optimal miktarı titrasyonu ile deneysel olarak tespit edilmelidir. Genel olarak, lizat 2-10 ug bir dizi titre yeterlidir. </li><li> Uygun mikrosantrifüj tüplerine oligo 50 fmol ekleyin. Flick karıştırın ve kısaca tüpün dibine içeriğini döndürmek için. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. Not: Eğer attemptive bir süper ng oligo ilavesinden önce oda sıcaklığında 20 dakika boyunca antikor ile lizat karışımı inkübe edin. En iyi sonuç için bir ChIP dereceli antikor 1 mikrogram kullanılması tavsiye edilir. </li><li> Her mikrosantrifüj tüpüne 10x Turuncu Yükleme Dye 2 ul ekleyin. yukarı pipet ve aşağı karıştırın. </li><li> Ayrı bir kuyuya her örnek kovma sonra yukarı ve aşağı pipetleme karıştırmak ve öncesi işletilen% 6 TBE jel içine örnekleri yükleyin. turuncu boya jel yol aşağı 3/4 2/3 göç kadar 80 V jel çalıştırın. Bu, yaklaşık 60-75 dakika sürer. </li><li> Bir jel bıçakla açık meraklı plastik kaset jel çıkarın ve kurumasını tutmak için% 0.5 TBE tamponu ile bir kapta jel yerleştirin. </li><li> Görüntüyü bozacak herhangi bir kabarcıkları veya kirletici ortadan kaldırmak için emin olmak, kızılötesi ve chemilüminesan görüntüleme sistemi yüzeyinde jel yerleştirin. </li><li> tarama sistemi yazılımı kullanarak, &quot;Acquire&quot; sekmesini tıklayınve daha sonra jel tarayıcının yüzeyinde bulunduğu karşılık gelen alanı çevresinde bir kutu çizmek için &quot;Yeni Çiz&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;Edinme&quot; sekmesinin &quot;Kanallar&quot; bölümünde, oligo üzerinde florofor etiketinin dalga boyuna karşılık gelen kanalı seçin. &quot;Tarayıcı&quot; bölümünde, bir düşük kaliteli önizleme taraması almak için &quot;önizleme&quot; butonuna tıklayınız. jel kısmına aşağı edinilen Önizleme görüntüsünü çevreleyen mavi kutu sürükleyerek tarama alanını ayarlayın yansıması. Not: Örneğin, 700 nm florofor ile işaretlenmiş oligos kullanıyorsanız, &quot;700 nm&quot; kanal taramadan önce seçili olduğundan emin olun. </li><li> &quot;Tarama Kontroller&quot; bölümünde, &quot;84 uM&quot; çözünürlük seçeneği ve &quot;Orta&quot; kalite seçeneği seçin. jel kalınlığının yarısına ofset odağı ayarlayın. Not: Örneğin, 1 mm&#39;lik bir jel ofset 0.5 mm&#39;lik bir odak kullanmak. </li><li> &quot;Tarayıcı&quot; bölümünde, b &quot;Başlat&quot; a tıklayınTarama Egin. Not: Tarama sırasında, parlaklık, kontrast ve renk düzeni genellikle tarama sisteminin üreticisine bağlı olarak manuel olarak ayarlanabilir. </li><li> Tarama bittikten sonra, &quot;Resim&quot; sekmesini seçin ve yönünü düzeltmek için &quot;oluşturma&quot; bölümünde &quot;Döndür veya çevirin&quot; tıklayın. Ana menüde &quot;Export&quot; tıklayarak görüntü dosyasını kaydedin ve ardından &quot;Tek Resim Görünümü.&quot; </li></ol> 4. DNA çekimi saflaştırma deneyi (DAPA) <ol><li> 5 uM Oligo Çalışma Stokta hazırlanması. <ol><li> oligos dubleks sipariş olsaydı, 100 uM stok çözülme ve 5 uM çalışma stok elde etmek için tavlama tamponunda 1:20 sulandırmak. </li><li> oligo tek iplikli sipariş olsaydı, 100 uM stokları çözülme ve stokları çalışan 10 mcM ulaşmak için tavlama tamponunda 1:10 sulandırmak. birbirleriyle 10 uM tamamlayıcı zincirlerinde 10 ul birleştirin. 95 ° C de bir ısı bloğunda yerleştirin5 dakika. Isı bloğu kapatın ve oligo yavaş yavaş kullanımdan önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li></ol></li><li> başlamadan önce, oda sıcaklığında bağlanma tamponu, düşük sıkılık yıkama tamponu, yüksek sertlikte yıkama tamponu ve elüsyon tamponu ısıtın. Not: 50 ng nihai bir konsantrasyon / ml poli D (IC) &#39;oligo proteinlerin potansiyel spesifik olmayan bağlanmaların azaltmak için bağlama tamponu düşük sıkılık yıkama tamponu ve yüksek sertlikte yıkama tamponu ilave edilebilir. </li><li> Her varyant için bağlayıcı karışımlar hazırlayın. <ol><li> bağlama tamponu 2 hacim nükleer lizat 1 hacim karıştırın. Not: lizat gerekli miktar bağlı TF&#39;lerin bolluğu değişen deneysel olarak tespit edilmelidir. Sütun başına nükleer lizat ug 100-250 arasında kullanılması çoğu durumda yeterlidir. </li><li> 1x fosfataz inhibitörü, 1x proteaz inhibitörü ve 1x bağlayıcı arttırıcı (isteğe bağlı) ekleyin ve tüpü birkaç kez hafifçe vurarak karıştırın. Not: 100x bağlayıcıgüçlendirici, 750 mM MgCl2 ve 300 mM ZnCI2 oluşur. DNA TF bağlayıcı kofaktör veya indirgeyici ajanlar bağlıdır eğer bağlayıcı geliştirici ekleyin. Bu bilgi bilinmiyorsa, bağlanma arttırıcı ekleyin. </li><li> her bir ilgili bağlama karışımına 5 uM biyotinlenmiş yakalama DNA (50 mmol) 10 ul ekle. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. Not: İnkübasyon süresi ve sıcaklık, TF bağlı olarak değişebilir. uygun değerler deneysel olarak tespit edilmesi gerekmektedir. </li></ol></li><li> streptavidin mikro boncuklar 100 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Her oligo probu test edilen, manyetik ayırıcı bir bağlayıcı sütun yerleştirin. Her bağlayıcı sütununun altında doğrudan ependorf tüp yerleştirin ve sütun durulama bağlayıcı tampon 100 ul geçerlidir. </li><li> ayrı sütunlar halinde her bağlayıcı karışımın içeriğini pipet ve sıvı mikrosantrifüj içine sütun aracılığıyla tamamen akmasına izinDevam etmeden önce tüp. bağlayıcı karışımında kullanılan varyant oligo sütunları etiket emin olun. akış örnekleri etiket ve düşük sertlikteki yıkar toplamak için yeni mikrosantrifüj tüpler ile değiştirin. </li><li> sütununa düşük sertlikteki yıkama tamponu 100 ul uygulayın; Kolon rezervuar boşalana kadar bekleyin. yıkama 4x tekrarlayın. Düşük sıkılık yıkama örnekleri etiket ve yüksek sertlikte yıkar toplamak için yeni mikrosantrifüj tüpler ile değiştirin. </li><li> sütununa yüksek sertlikteki yıkama tamponu 100 ul uygulayın; Kolon rezervuar boşalana kadar bekleyin. yıkama 4x tekrarlayın. yüksek sertlikteki yıkama örnekleri etiket ve ön elüsyon toplamak için yeni mikrosantrifüj tüpler ile değiştirin. </li><li> sütun özgü elüsyon tamponu 30 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca bekletin. Ön yıkama örnekleri Etiket ve elüsyon toplamak için yeni mikrosantrifüj tüpler ile değiştirin. Not: Bu ilişkili protein elüt etmez; geri kalan, yüksek sertlikteki yıkamalarsütunun üzerinden tamponu ve elüsyon verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için yıkama tamponu ile değiştirir. </li><li> bağlı TFs Zehir için ek 50 ul yerli elüsyon tamponu ekleyin. daha yüksek bir verim daha az konsantre edilmiş, ayrılmış malzeme için, ana elüsyon tamponu ek bir 50 ul ve akış-through toplar. Not: bağlı TFs 32 kimliğini belirlemek için kütle spektrometresi ile elüsyon örnekleri analiz edin. Daha sonra, bir Western Blot 33 tarafından takip sodyum dodesil sülfit poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile proteomik sonuçları doğrulamak. kütle spektrometrisi mevcut değilse, genotip bağımlı bağlanma gösteren protein (ler) boyutunu belirlemek için yerine Western blot standart teknik kullanılarak gümüş leke çalıştırın. Girişte detaylı hesaplama yaklaşımları tahmin TFs listesini daraltmak için bu bilgileri kullanabilirsiniz. </li></ol>

<ol><li>Hindorff, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+etiologic+and+functional+implications+of+genome-wide+association+loci+for+human+diseases+and+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
<li>Ward, L. D., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+noncoding+genetic+variation+in+complex+traits+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Interpreting noncoding genetic variation in complex traits and human disease.</a> Nat Biotechnol. 30 (11), 1095-1106 (2012).</li>
<li>Paul, D. S., Soranzo, N., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interpretation+of+non-coding+sequence+variation%3A+concepts+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Functional interpretation of non-coding sequence variation: concepts and challenges.</a> Bioessays. 36 (2), 191-199 (2014).</li>
<li>Zhang, F., Lupski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+genetic+variants+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Non-coding genetic variants in human disease.</a> Hum Mol Genet. , (2015).</li>
<li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+and+its+misregulation+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation and its misregulation in disease.</a> Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).</li>
<li>Slatkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+disequilibrium--understanding+the+evolutionary+past+and+mapping+the+medical+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Linkage disequilibrium--understanding the evolutionary past and mapping the medical future.</a> Nat Rev Genet. 9 (6), 477-485 (2008).</li>
<li>Bush, W. S., Moore, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+11%3A+Genome-wide+association+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 11: Genome-wide association studies.</a> PLoS Comput Biol. 8 (12), e1002822(2012).</li>
<li>1000 Genomes Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+map+of+genetic+variation+from+1%2C092+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes.</a> Nature. 491 (7422), 56-65 (2012).</li>
<li>Chang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-generation+PLINK%3A+rising+to+the+challenge+of+larger+and+richer+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Gigascience%22%5BJournal%5D)">Second-generation PLINK: rising to the challenge of larger and richer datasets.</a> Gigascience. 4, 7(2015).</li>
<li>Purcell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLINK%3A+a+tool+set+for+whole-genome+association+and+population-based+linkage+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses.</a> Am J Hum Genet. 81 (3), 559-575 (2007).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Crawford, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+DNase+hypersensitive+sites+using+massively+parallel+signature+sequencing+%28MPSS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of DNase hypersensitive sites using massively parallel signature sequencing (MPSS).</a> Genome Res. 16 (1), 123-131 (2006).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAIRE+Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements%29+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">FAIRE Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).</li>
<li>Kent, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+genome+browser+at+UCSC%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The human genome browser at UCSC.</a> Genome Res. 12 (6), 996-1006 (2002).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Martens, J. H., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLUEPRINT%3A+mapping+human+blood+cell+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">BLUEPRINT: mapping human blood cell epigenomes.</a> Haematologica. 98 (10), 1487-1489 (2013).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cistrome%3A+an+integrative+platform+for+transcriptional+regulation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Cistrome: an integrative platform for transcriptional regulation studies.</a> Genome Biol. 12 (8), R83(2011).</li>
<li>Griffon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+public+ChIP-seq+experiments+reveals+a+complex+multi-cell+regulatory+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of public ChIP-seq experiments reveals a complex multi-cell regulatory landscape.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e27(2015).</li>
<li>Staudt, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lymphoid-specific+protein+binding+to+the+octamer+motif+of+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A lymphoid-specific protein binding to the octamer motif of immunoglobulin genes.</a> Nature. 323 (6089), 640-643 (1986).</li>
<li>Singh, H., Sen, R., Baltimore, D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+factor+that+binds+to+a+conserved+sequence+motif+in+transcriptional+control+elements+of+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A nuclear factor that binds to a conserved sequence motif in transcriptional control elements of immunoglobulin genes.</a> Nature. 319 (6049), 154-158 (1986).</li>
<li>Weirauch, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+inference+of+eukaryotic+transcription+factor+sequence+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Determination and inference of eukaryotic transcription factor sequence specificity.</a> Cell. 158 (6), 1431-1443 (2014).</li>
<li>Ward, L. D., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaploReg%3A+a+resource+for+exploring+chromatin+states%2C+conservation%2C+and+regulatory+motif+alterations+within+sets+of+genetically+linked+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HaploReg: a resource for exploring chromatin states, conservation, and regulatory motif alterations within sets of genetically linked variants.</a> Nucleic Acids Res. 40 (Database issue), D930-D934 (2012).</li>
<li>Boyle, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotation+of+functional+variation+in+personal+genomes+using+RegulomeDB%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Annotation of functional variation in personal genomes using RegulomeDB.</a> Genome Res. 22 (9), 1790-1797 (2012).</li>
<li>Hume, M. A., Barrera, L. A., Gisselbrecht, S. S., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniPROBE%2C+update+2015%3A+new+tools+and+content+for+the+online+database+of+protein-binding+microarray+data+on+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">UniPROBE, update 2015: new tools and content for the online database of protein-binding microarray data on protein-DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D117-D122 (2015).</li>
<li>Mathelier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JASPAR+2014%3A+an+extensively+expanded+and+updated+open-access+database+of+transcription+factor+binding+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">JASPAR 2014: an extensively expanded and updated open-access database of transcription factor binding profiles.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), 142-147 (2014).</li>
<li>Smith, M. F. Jr, Delbary-Gossart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+%28EMSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Methods Mol Med. 50, 249-257 (2001).</li>
<li>Franza, B. R., Josephs, S. F., Gilman, M. Z., Ryan, W., Clarkson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cellular+proteins+recognizing+the+HIV+enhancer+using+a+microscale+DNA-affinity+precipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Characterization of cellular proteins recognizing the HIV enhancer using a microscale DNA-affinity precipitation assay.</a> Nature. 330 (6146), 391-395 (1987).</li>
<li>LI-COR. Odyssey Infrared EMSA Kit: Instruction Manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.licor.com/bio/pack_inserts/?pi=829-07910">http://www.licor.com/bio/pack_inserts/?pi=829-07910</a> (2014).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific, Inc. BCA Protein Assay Kit: User Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf</a> (2014).</li>
<li>Wijeratne, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+separation+using+radially+aligned+titania+nanotubes+on+titanium+wire%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide separation using radially aligned titania nanotubes on titanium wire.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 7 (21), 11155-11164 (2015).</li>
<li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fastest+Western+in+Town%3A+A+Contemporary+Twist+on+the+Classic+Western+Blot+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis.</a> J. Vis. Exp. (84), (2014).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lupus+Risk+Variant+Increases+pSTAT1+Binding+and+Decreases+ETS1+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Lupus Risk Variant Increases pSTAT1 Binding and Decreases ETS1 Expression.</a> Am J Hum Genet. 96 (5), 731-739 (2015).</li>
<li>Ramana, C. V., Chatterjee-Kishore, M., Nguyen, H., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+roles+of+Stat1+in+regulating+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Complex roles of Stat1 in regulating gene expression.</a> Oncogene. 19 (21), 2619-2627 (2000).</li>
<li>Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+%28EMSA%29+for+the+Study+of+RNA-Protein+Interactions%3A+The+IRE%2FIRP+Example%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example.</a> J. Vis. Exp. (94), e52230(2014).</li>
<li>Heng, T. S., Painter, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+Genome+Project%2C+C.+The+Immunological+Genome+Project%3A+networks+of+gene+expression+in+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological Genome Project, C. The Immunological Genome Project: networks of gene expression in immune cells.</a> Nat Immunol. 9 (10), 1091-1094 (2008).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioGPS%3A+an+extensible+and+customizable+portal+for+querying+and+organizing+gene+annotation+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">BioGPS: an extensible and customizable portal for querying and organizing gene annotation resources.</a> Genome Biol. 10 (11), R130(2009).</li>
<li>Wu, C., Macleod, I., Su, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioGPS+and+MyGene.info%3A+organizing+online%2C+gene-centric+information%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioGPS and MyGene.info: organizing online, gene-centric information.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D561-D565 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+features+and+chromatin+structure+around+the+genomic+regions+bound+by+119+human+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Sequence features and chromatin structure around the genomic regions bound by 119 human transcription factors.</a> Genome Res. 22 (9), 1798-1812 (2012).</li>
<li>Holden, N. S., Tacon, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+problems+of+the+electrophoretic+mobility+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 63 (1), 7-14 (2011).</li>
<li>Miltenyi Biotec, Inc. µMACS FactorFinder Kit: Data sheet. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macsmolecular/protein-research/biotinylated-molecule-isolation/macs-factorfinder-kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macsmolecular/protein-research/biotinylated-molecule-isolation/macs-factorfinder-kit.aspx</a> (2014).</li>
<li>Xu, J., Liu, H., Park, J. S., Lan, Y., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osr1+acts+downstream+of+and+interacts+synergistically+with+Six2+to+maintain+nephron+progenitor+cells+during+kidney+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Osr1 acts downstream of and interacts synergistically with Six2 to maintain nephron progenitor cells during kidney organogenesis.</a> Development. 141 (7), 1442-1452 (2014).</li>
<li>Yang, T. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genevar%3A+a+database+and+Java+application+for+the+analysis+and+visualization+of+SNP-gene+associations+in+eQTL+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Genevar: a database and Java application for the analysis and visualization of SNP-gene associations in eQTL studies.</a> Bioinformatics. 26 (19), 2474-2476 (2010).</li>
<li>Fort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liver+enhancer+in+the+fibrinogen+gene+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A liver enhancer in the fibrinogen gene cluster.</a> Blood. 117 (1), 276-282 (2011).</li>
<li>Solberg, N., Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luciferase+assay+to+study+the+activity+of+a+cloned+promoter+DNA+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Luciferase assay to study the activity of a cloned promoter DNA fragment.</a> Methods Mol Biol. 977, 65-78 (2013).</li>
<li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+repressor+element+in+the+5%27-untranslated+region+of+human+Pax5+exon+1A%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A repressor element in the 5'-untranslated region of human Pax5 exon 1A.</a> Gene. 263 (1-2), 59-66 (2001).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Guided+Human+Genome+Engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

<html> sıralama ve genotiplendirme teknolojilerindeki gelişmeler büyük ölçüde hastalıkla ilgili genetik varyantları tanımlamak için kapasitemizi gelişmiş olmasına rağmen, bu varyantlar etkilenen fonksiyonel mekanizmaları anlamak için yeteneğimizi kalıyor. Sorunun ana kaynağı olasılıkla gen ekspresyonunu kontrol zor-arası tahmin mekanizmaları etkileyen ilgili kodlama genomunun bölgeler birçok hastalıkla ilişkili varyantları n yer olmasıdır. Burada, biz büyük olasılıkla çok kodlayıcı olmayan varyantları işlevine katkıda ol...

Sıralama ve genom çapında ilişkilendirme çalışmaları (GWAS), aday odağı çalışmaları da dahil olmak üzere genotiplendirme dayalı çalışmalar, ve derin sıralama çalışmaları, istatistiksel bir hastalık, özellik veya fenotip ile ilişkili birçok genetik varyantlar belirledik. Erken tahminler aksine, bu varyantlar (85-93%) en kodlayıcı olmayan bölgelerinde bulunur ve protein 1,2 amino asit dizisini değiştirmezler. Bu kodlayıcı olmayan varyantları işlevini yorumlama ve ilişkili hastalık onları bağlayan biyolojik mekanizmaları belirleyen özellik veya fenotip 3-6 zorlu kanıtlanmıştır. gen ifadesinin - Biz önemli bir ara fenotip için varyantları bağlantı moleküler mekanizmaları tanımlamak için genel bir strateji geliştirdik. Bu boru hattı, özellikle genetik varyantlar bağlama TF modülasyonu belirlemek için tasarlanmıştır. Bu strateji tahmin etmek amaçlanmıştır hesaplama yaklaşımları ve moleküler biyoloji teknikleri birleştirenBiyolojik siliko aday varyantları etkileri ve doğrulamak için şu tahminler ampirik (Şekil 1). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54093/54093fig1.jpg" /> Şekil 1:.. Gri gölgeli bu yazının ilişkili detaylı protokolde yer almayan kodlayıcı olmayan genetik varyantları Adımlar analizi için stratejik yaklaşım <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54093/54093fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Bir çok durumda, her bir istatistiksel bağlantılı varyantı ile, yüksek bir bağlantı-dengesizliği (LD) tüm bu dahil varyantların listesini genişleterek başlaması önemlidir. LD R2 istatistik 7 ile ölçülebilir iki farklı kromozom konumlarda allel rastgele olmayan federasyonu, bir ölçüsüdür. R2 lin bir ölçüsüdüriki modeli arasında bir r 2 = 1 belirten mükemmel bağlantı ile iki modeli arasındaki kage dengesizlik. yüksek LD alleller atalarının popülasyonlar arasında kromozom üzerindeki ortak ayırmak bulunmuştur. Güncel genotiplendirme dizileri insan genomu bilinen tüm varyasyonları dahil değildir. Bunun yerine, onlar insan genomunun içinde LD istismar ve LD 8 belirli bir bölgedeki diğer varyantları için temsilci olarak vekaleten oy bilinen çeşitleri bir alt kümesini içerir. anlamlı bir biyolojik etki ile nedensel varyantı-varyantı ile LD çünkü Böylece herhangi bir biyolojik sonucu olmayan bir varyant, belirli bir hastalık ile ilişkili olabilir. Prosedürel, 1,000 genomları son sürümü plink 10,11, tüm genom dernek analizi için bir açık kaynak aracı ile uyumlu ikili dosyaları içine 9 varyant çağrı dosyalarını (vcf) proje dönüştürmek için tavsiye edilir. Daha sonra, her giriş genetik va ile LD r 2&gt; 0.8 ile diğer tüm genetik varyantlarRiant adayları olarak tespit edilebilir. Bir varyant Avrupa kökenli kişilerde, benzer kökenli konularda veri LD genişlemesi için kullanılması gerektiğini tespit edilmiştir eğer, bu üvey örneğin için uygun referans nüfusu kullanmak önemlidir. LD genişletme genellikle aday türevleri onlarca neden olur ve sadece küçük bir fraksiyonu bir hastalık mekanizmasına katkıda bulunması olasıdır. Genellikle, deneysel bireysel bu varyantların her incelemek için olanaksız olduğunu. Varyantlar öncelik filtre olarak kamuya açık fonksiyonel genomik veri setleri binlerce kaldıraç nedenle faydalıdır. Örneğin, şifreleme konsorsiyum 12, örneğin, DNase seq 13 ATAC olarak teknolojilerden kromatin erişilebilirlik verileri ile birlikte, bağlamlarda çeşitli yonga-DİZ TFs bağlanmasını tarif eden deneyler ve ko-faktörler, ve histon işaretleri binlerce yürüttü -DİZ 14 ve FAIRE seq 15. databBöyle UCSC Genom Tarayıcı 16, Yol Haritası Epigenomics 17, Blueprint epigenom 18 Cistrome 19 ve eşleştirmek 20 olarak ases ve web sunucuları hücre tipleri ve koşullar geniş bir yelpazede bu ve diğer deneysel tekniklerle üretilen verilere ücretsiz erişim sağlar. Deneysel olarak incelemek için pek çok çeşidi vardır, bu veri, ilgili hücre ve doku tiplerinde olası düzenleyici bölgeler içinde yer alan bu öncelik için kullanılabilir. Bundan başka, bir varyantı belirli bir protein için bir çip DİZİ zirve içinde olduğu durumlarda, bu veriler, belirli bir TF (ler) olan ya da etki olabilir bağlama ko-faktör olarak potansiyel neden sağlayabilir. Sonraki, öncelik ortaya çıkan varyantları EMSA 21,22 kullanarak bağlama tahmin genotip-bağımlı protein doğrulamak için deneysel taranmaktadır. EMSA bir indirgeyici olmayan TBE jeli üzerinde oligo geçiş değişimi ölçer. Floresan etiketli oligo kuluçkalanırNükleer lizat ve nükleer faktörlerin bağlayıcı jel üzerinde oligo hareketini geciktirir. Bu şekilde, tarama sırasında daha güçlü bir floresan sinyal olarak sunacak daha fazla nükleer faktörler bağlı olan oligo içinde. Özellikle, EMSA bağlayıcı etkilenir spesifik protein ilgili tahminlerde gerektirmez. varyantlar tahmin düzenleyici bölgeler içinde yer alan ve farklı şekilde bağlayıcı nükleer faktörlerin yeteneğine sahip olduğu tespit edildikten sonra, hesaplama yöntemleri olan onlar etkileyebilecek bağlayıcı belirli TF (ler) tahmin etmek istihdam edilmektedir. Biz BDT-BP 23,24, RegulomeDB 25, UniProbe 26 ve Jaspar 27 kullanmayı tercih eder. Aday TF&#39;ler belirlendikten sonra, bu öngörüler özellikle bu TFs (EMSA-Süper kaymalar ve DAPA-Batılıların) karşı antikorlar kullanılarak test edilebilir. Bir EMSA-süperkayma nükleer lizat ve oligo bir TF-özgü antikorun eklenmesini kapsamaktadır. Bir EMSA-süperkayma bir pozitif sonuç repr olduğunuEMSA bandında bir kayma ya da grubun bir kayıp olarak esented (referans 28&#39;de incelenmiştir). Tamamlayıcı DAPA, varyant ve yan nükleotidlerini 20 baz çifti ihtiva eden bir 5&#39;-biyotinlenmiş oligo dupleks spesifik oligolar bağlama nükleer faktörü yakalamak için uygun bir hücre tipinde (ler) den, nükleer lizatı ile inkübe edilir. Oligo dubleks nükleer faktör kompleksi manyetik sütunda mikroboncuklarm streptavidin tesbit edilir. Bağlı nükleer faktörler elüsyon 29,48 doğrudan tahsil edilir. Bağlanma tahminler daha sonra proteine ​​özel antikorlar kullanılarak bir Western blot ile tespit edilebilir. sonradan kullanılarak valide edilebilir hiçbir belirgin tahminler, ya da çok fazla tahminler, kütle-spektrometresi kullanılarak aday TFs belirlemek için bir proteomik çekirdeğe gönderilebilir DAPA deneyleri varyant aşağı açılır menüden elüsyon olduğu durumlarda, bu daha önce açıklanan yöntemleri. articl kalanındae, genetik varyantları EMSA ve DAPA analizi için detaylı bir protokol sağlanır.

<table><tbody><tr><td>Özel DNA Oligonükleotidler</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>KCl, CE tamponu için</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td> <td>CE ve NE tamponu için</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15630-080</td></tr><tr><td>EDTA (0.5M), pH 8.0</td> CE, NE ve tavlama tamponu için <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>NaCl, NE tamponu</td></tr><tr><td>Tris-HCl (1M) için, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>BP1756-100</td><td>Tavlama tamponu için</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21040CM</td><td>PBS, hücre yıkama için</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol çözeltisi (1 M)</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td>İndirgeyici ajan</td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Thermo Scientific</td><td>87786</td><td>TF'lerin Katabolizmasını</td></tr><tr><td>Önler Fosfataz İnhibitörü Kokteyli&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78420</td><td>TF'lerin fosforilasyonunu önler</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Yedek</td><td>IBI Scientific</td><td>IB01140</td><td>NP-40, nükleer ekstraksiyon için</td></tr><tr><td>BCA Protein Test Kiti Thermo</td><td>Scientific</td><td>23225</td><td>Protein konsantrasyonunu ölçmek için</td></tr><tr><td>Odyssey EMSA Tampon Kiti Licor</td><td></td><td>829-07910</td><td>Gerekli tüm EMSA tamponlarını içerir</td></tr><tr><td>TBE Jeller, %6, 12 Kuyu</td><td>EMSA</td>TBE Tamponu için <td>Invitrogen</td><td>EC6265BOX</td></tr><tr><td>(10x)</td><td>EMSA</td>FactorFinder Başlangıç Kiti için <td>Thermo Scientific</td><td>B52</td></tr><tr><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-318</td><td>Gerekli tüm DAPA tamponlarını içerir</td><td></td></tr><tr><td>Licor Odyssey CLx</td><td>Licor</td><td></td><td>DAPA / EMSA</td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td> <td>için önerilen tarayıcı10.000 birim / ml penisilin, 10.000 & mikro içerir; g / ml streptomisin ve 25 & mikro; g / ml Fungizone&reg; Antimikotik</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td>FBS, kültür ortamı için</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta</td><td>Gibco</td><td>22400-071</td><td>L-glutamin ve 25 mM HEPES içerir</td></tr></tbody></table>

elektroforetik hareketlilik assay (emsa) ve shift kullanarak fonksiyonel olmayan kodlama genetik türevleri için tarama dna afinite yağış deneyi (dapa)

Screening for Functional Non-coding Genetic Variants Using Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) and DNA-affinity Precipitation Assay (DAPA)

Popülasyon ve aile temelli genetik çalışmalar tipik olarak bir klinik hastalık veya fenotiple istatistiksel olarak ilişkili genetik varyantların tanımlanmasıyla sonuçlanır. Birçok hastalık ve özellik için, çoğu varyant kodlamasızdır ve bu nedenle, gen ekspresyonunu kontrol eden ince, tahmin edilmesi nispeten zor mekanizmaları etkileyerek hareket etmesi muhtemeldir. Burada, kodlama yapmayan varyantları önceliklendirmek ve bunları işlevleri açısından taramak için genel bir stratejik yaklaşım açıklıyoruz. Bu yaklaşım, fonksiyonel genomik veri tabanları kullanılarak hesaplamalı önceliklendirmeyi ve ardından transkripsiyon faktörlerinin (TF'ler) riskli ve risksiz alellere diferansiyel bağlanmasının deneysel analizini içerir. Genetik varyantların hem elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) hem de DNA afinite çökeltme testi (DAPA) analizi için, hastalığın veya fenotiple ilgili hücrelerin nükleer lizatındaki faktörleri tanımlamak için sentetik bir DNA oligonükleotidi (oligo) kullanılır. EMSA için, bağlı nükleer faktörleri olan veya olmayan oligonükleotidler (genellikle TF'ler), bir tris-borat-EDTA (TBE) poliakrilamid jel üzerinde denatüre olmayan elektroforez ile analiz edilir. DAPA için, oligonükleotidler manyetik bir kolona bağlanır ve DNA dizisini spesifik olarak bağlayan nükleer faktörler, kütle spektrometresi veya indirgeyici sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve ardından Western blot analizi yoluyla ayrıştırılır ve analiz edilir. Bu genel yaklaşım, herhangi bir hastalık, özellik veya fenotiple ilişkili kodlamayan genetik varyantların işlevini incelemek için yaygın olarak kullanılabilir.

lizat kalitesi özelliği açısından bir EMSA veya DAPA ve değişkenliği yaparken Bu bölümde, ne temsilcisi sonuçları verilmektedir. Örneğin, birden çok kez dondurma ve çözme, protein örnekleri denatürasyon neden olabilir öne sürülmüştür. Bu &quot;dondurma-çözme&quot; döngü bağlamında EMSA analizi tekrarlanabilirliğini incelemek için, bir gen varyant farklı iki adet 35 bp&#39;lik oligo belirtilen miktarda çözülmüş ve yeniden dondurulmuştur nükleer lizat tek bir toplu ile inkübe edildi . zama...

Transkripsiyon faktörü (TF) DNA bağlanmasını etkileyen kodlamayan genetik varyantları tanımlamak için stratejik bir plan ve protokol sunuyoruz. Genotipe bağlı TF DNA bağlanmasının elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) ve DNA afinite çökeltme testi (DAPA) analizi için ayrıntılı bir deneysel protokol sağlanmıştır.

Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA)

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical ...

Bu deneysel stratejinin genel amacı, hastalıkla ilişkili kodlamayan varyantların işlevselliğini araştırmaktır. Bu yöntem, aslında amino asit dizisini değiştirmeyen genetik varyantların hala hastalık fenotipine nasıl katkıda bulunduğu gibi genomikteki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fonksiyon aktivitesi için genetik varyansı değerlendirmek için kolaylaştırılmış bir süreç sağlaması ve düzenleyici proteinler ve etkilenen yollar hakkında fikir vermesidir.Bu teknik, aday nedensel varyantı olan herhangi bir hastalığın araştırılmasına fayda sağlayabilir. Çünkü bu varyantları analiz etme prosedürü, incelenen fenotipten bağımsız olarak evrenseldir. Bu yöntem insan hastalıkları hakkında bilgi verebilse de, herhangi bir organizmadaki mutasyonlara da uygulanabilir.Bu deneyde B-lenfoblastoid hücrelerden nükleer lizatlar hazırlanacaktır, ancak bu prosedür çoğu hücre hattına uygulanabilir. Bir hemositometre kullanarak hücreleri saydıktan sonra, parçalanmak için istenen hücre sayısını aşağı doğru döndürün. Ortamı aspire edin, 10 mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve hücreleri tekrar döndürün.Hücreleri PBS ile ikinci kez yıkayın ve sıkma işleminden sonra PBS'yi çıkarın. 10 ila yedinci hücreler için bir mililitre PBS kullanarak buz gibi soğuk PBS'de hücre damağını yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun bir mililitresini 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine bağlayın, böylece her tüp PBS'de 10 ila yedinci hücre içerir.İki dakika santrifüjleyin ve PBS'yi aspire edin. Çalışan bir CE tamponu, bir milimolar dithiothreitol veya DTT, 1X fosfataz inhibitörü ve 0.5 milimolar Fenilmetansülfonil florür veya PMSF stoğuna ekleyin. Her hücre paletini bu tamponun 400 mikrolitresi ile yeniden süspanse edin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.Her bir mikrosantrifüj tüpüne 25 mikrolitre %10 Nonidet P-40 ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Dört santigrat derecede ve üç dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve atın.Daha sonra, çalışan bir NE-tampon stoğuna, bir milimolar DTT, 1X fosfoaz inhibitörü ve bir milimolar PMSF ekleyin. Her hücre damağını bu tamponun 30 mikrolitresi ile yeniden süspanse edin ve girdaplama ile karıştırın. 4 santigrat derecede, bir tüp döndürücüde 10 dakika inkübe edin.İki dakika santrifüjleyin. Nükleer lizat olan berrak süpernatanı toplayın. Proteini bozabilecek çoklu donma çözülme döngülerini önlemek için eksi 80 santigrat derecede saklamadan önce nükleer lizatı alikotlayın.Bu prosedüre, protokol metninde açıklandığı gibi oligonükleotidin 50 nanomolar çalışma stoğunu hazırlayarak başlayın. Oligoları beş dakika boyunca 90 santigrat derecede bir ısı bloğuna yerleştirin. Beş dakika sonra, ısı bloğunu kapatın ve kullanmadan önce en az bir saat boyunca oligoların yavaşça oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.Daha sonra elektroforetik hareketlilik kayma testini veya EMSA jelini hazırlayın. Slaytı önceden dökülmüş, yüzde altı tris-borat-EDTA veya TBE jelden çıkarın ve kuyucuklardaki herhangi bir tamponu çıkarmak için birkaç kez deiyonize su altında durulayın. Jel elektroforez aparatını monte edin ve iç hazneyi 0.5X TBE tamponu ile doldurarak sızıntı olup olmadığını kontrol edin.Dış hazneye tampon sızmazsa, dış hazneyi kabaca üçte ikisini doldurun. Jeli 60 dakika boyunca 100 voltta önceden çalıştırın. Ön çalışma tamamlandığında, her bir kuyuyu 200 mikrolitre 0.5X TBE tamponu ile yıkayın.Bir bağlayıcı arabellek ana karışımı hazırlayın. Bir mikrosantrifüj tüpünde, tüm reaksiyonlar için ortak olan bu reaktifleri karıştırın. 10X bağlayıcı tampon, DTT polisorbat, Poli (dI-dC) ve somon sperm DNA'sı.EMSA reaksiyonlarını ayarlamak için, her bir mikrosantrifüj tüpüne nükleaz içermeyen su ekleyin, böylece tüm reaktiflerin eklenmesini takiben nihai hacim 20 mikrolitre olacaktır. Her bir mikrosantrifüj tüpüne uygun miktarda ana karışım ekleyin. Uygun mikrosantrifüj tüplerine sekiz mikrogram nükleer lizat ekleyin.Negatif kontroller olarak, nükleer ekstrakt içermeyen oligo içeren tüpleri dahil edin. Uygun mikrosantrifüj tüplerine 50 femtomol oligo ekleyin ve karıştırmak için hafifçe vurun. İçeriği kısaca tüpün dibine döndürün.Tüm tüpleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Ardından, her bir mikrosantrifüj tüpüne iki mikrolitre 10X turuncu yükleme boyası ekleyin. Karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.Numuneleri, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek ve ardından her bir numuneyi ayrı bir kuyuya atarak çalışma öncesi yüzde altı TBE jele yükleyin. Jeli 80 voltta yaklaşık 60 ila 75 dakika boyunca, turuncu boya jelin üçte ikisi ila dörtte üçü boyunca göç edene kadar çalıştırın. Çalışma tamamlandığında, plastik kaseti açmak için bir jel bıçak kullanın.Jeli kasetten çıkarın ve kurumasını önlemek için yüzde 0,5 TBE tamponlu bir kaba koyun. Jeli kızılötesi ve kemilüminesans görüntüleme sisteminin yüzeyine yerleştirin. Görüntüyü bozacak baloncukları veya kirleticileri ortadan kaldırın.Protokol metninde açıklandığı gibi tarama sistemi yazılımını kullanarak jeli tarayın. Bu prosedüre başlamak için, protokol metninde açıklandığı gibi beş mikromolar oligo çalışma stoğu hazırlayın. Oligoları beş dakika boyunca 95 santigrat derecede bir ısı bloğuna yerleştirin.Beş dakika sonra, ısı bloğunu kapatın ve kullanmadan önce oligoların yavaşça oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Aşağıdaki tamponları oda sıcaklığına ısıtın: bağlama tamponu, düşük sıkılıklı yıkama tamponu, yüksek sıkılıkta yıkama tamponu ve elüsyon tamponu. Her varyant için bağlayıcı karışımları hazırlayın.Bir hacim nükleer lizatı iki hacim bağlayıcı tampon ile karıştırın. 1X fosfataz inhibitörü, 0.5 milimolar PMSF ve 1X bağlanma arttırıcı ekleyin. Her bağlanma karışımına 10 mikrolitre beş mikromolar biyotinile yakalama DNA'sı ekleyin.Tüpü birkaç kez hafifçe vurarak karıştırın. Bağlayıcı karışımları oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, her bir bağlama karışımına 100 mikrolitre streptavidin MicroBeads ekleyin.Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Test edilen her oligo probu için, manyetik ayırıcıya bir bağlama sütunu yerleştirin. Sütunların bağlama karışımında kullanılan varyant oligo ile etiketlendiğinden emin olun.Her bir bağlama kolonunun altına doğrudan bir mikrosantrifüj tüpü yerleştirin ve kolonu durulamak için 100 mikrolitre bağlama tamponu uygulayın. Her bir bağlayıcı karışımın içeriğini ayrı sütunlara pipetleyin. Sıvının kolondan tamamen mikrosantrifüj tüpüne akmasına izin verin.Kolona 100 mikrolitre düşük sertlikte yıkama tamponu uygulayın ve kolon haznesi boşalana kadar bekleyin. Kolona tekrar 100 mikrolitre düşük sertlikte yıkama tamponu uygulayın. Kolona 100 mikrolitre yüksek sıkılıkta yıkama tamponu uygulayın ve kolon haznesi boşalana kadar bekleyin.Kolona tekrar 100 mikrolitre yüksek sıkılıkta yıkama tamponu uygulayın. Kolona 30 mikrolitre doğal elüsyon tamponu ekleyin ve beş dakika bekletin. Son olarak, bağlı transkripsiyon faktörlerini elüte etmek için ek bir 50 mikrolitre doğal elüsyon tamponu ekleyin.EMSA sonuçlarının tekrarlanabilirliğini ve donma çözülme döngülerinin sonuçlarını araştırmak için, birden fazla dondurma ve çözülme döngüsünden sonra aynı B-lenfosit nükleer ekstraktının preparatını araştırmak için genetik bir varyantın referans veya referans olmayan alelini içeren oligolar kullanıldı. Mavi ok, serbest probu gösterir. Transkripsiyon faktörlerinin oligoya bağlanması, jelin üst yarısında kırmızı okla gösterilen bir bant olarak görülür.Bu sonuçlar, bu özel nükleer ekstraktın beş defaya kadar dondurulmasının ve çözülmesinin, proteinlerin bütünlüğü üzerinde görünüşte hiçbir etkisi olmadığını göstermektedir. EMSA için sinyal-gürültü oranını optimize etmek de önemlidir. Tek bir nükleer lizat preparatını araştırmak için çeşitli oligo konsantrasyonları kullanıldı.Bandın yoğunluğunda bir artış, 100 femtomollere kadar oligo gözlendi. Lupus ile ilişkili bir risk aleli çalışmasından elde edilen temsili sonuçlar burada gösterilmektedir. Transkripsiyon faktörü, STAT 1, ilk olarak DAPA ile tanımlandı ve ardından proteomik analiz yapıldı.Bir DAPA western lekesi daha sonra STAT 1'in kimliğini ve fosforile STAT 1 formunun lupus risk oligosuna daha yüksek bağlanmasını doğruladı. Bu işlemi takiben kütle spektrometresi ve western blot gibi diğer teknikler de uygulanabilir. Bu, alele bağımlı bağlanmayı gösteren düzenleyici proteini tanımlamamıza yardımcı olacaktır.Lusiferaz gibi raportör tahlilleri, alelin bir fonksiyonu olarak gen ekspresyonundaki değişiklikleri araştırmak için de kullanılabilir.

screening-for-functional-non-coding-genetic-variants-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Otizm ve şizofreni gibi ortak bir bozukluğa yol novo mutasyonlar bulmak için moleküler genetik strateji.

Ortak Bozuklukları de Novo Mutasyonlar, otizm ve şizofreni gibi tanımlayın Bir Strateji

Bu videoda, kızılötesi floresan etiketli DNA probları kullanarak protein-DNA etkileşimlerini tespit etmek için elektroforetik hareketlilik kaydırma testini gösteriyoruz. Protein DNA probuna bağlandığında, yavaşça hareket eden ve jel üzerinde kaymış bir bant olarak görünen büyük bir kompleks oluşturur.

Transkripsiyon Faktörü-DNA Komplekslerinin Tespiti için Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi

Bu video makalede, iki bileşenli bir sistem yanıt düzenleyici gen hedef ve birleştirme bölgelerini belirlemek için bir in vitro mikro-dizi göre bir yöntem açıklanır.

Bakteriyel için iki bileşenli Düzenleme Sistemleri Gen Hedefler belirlemek için DNA afinite-saflaştırılmış Chip (DAP-chip) Yöntem

Burada RNA / protein etkileşimleri analiz etmek için bir protokol mevcut. elektroforetik hareketlilik kayma deneyi (EMSA), yerli jel elektroforez sırasında RNA / protein kompleksleri ve serbest RNA ayırıcı geçiş dayanmaktadır. Bir radyo-etiketli bir RNA probu kullanarak, RNA / protein kompleksleri otoradyografi ile görselleştirilebilir.

IRE / IRP Örnek: RNA-protein Etkileşimleri Çalışmaları elektroforetik hareketlilik Shift Testi (EMSA)

Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Burada, doğru bir şekilde birden fazla genetik değişiklikler hedef bölge teslim ddPCR ve hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak tek bir tepki olarak ölçmek için bir protokol mevcut.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Dijital polimeraz zincir tepkimesi (PCR) Tek nükleotid türevleri ve DNA kopyalama numara türevleri yüksek-duyarlı tespiti için yararlı bir araçtır. Burada, biz insan genomu digital PCR ile tüp içinde çip biçimini kullanarak nadir versiyonlarında ölçmek için kritik noktalar göstermek.

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Bu makale, anjiyoimmünoblastik lenfomada Sanger dizilemesine dayalı düşük frekanslı bir tespit yönteminin uygulamasını tanıtmaktadır. Bu yöntemi diğer hastalıklara uygulamak için bir temel sağlayın.

Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonun Tespiti için Sanger Dizilimi ile Birleştirilmiş Vahşi Tip Bloke Edici PCR

Açık / koyu geçiş testi farelerde davranış gibi anksiyete ölçmek için en yaygın kullanılan testler biridir. Burada, test yapmak konusunda ayrıntılı yordamlar gösteren bir film sunuyoruz.

Fareler için açık / koyu Geçiş Testi

Keşfedin kodlanmayan genetik varyantların işlevselliğini EMSA ve DAPA yöntemleriyle. Bu teknik, transkripsiyon faktörü DNA bağlanmasını analiz ederek hastalık mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA) (Video) | JoVE Journal

Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA)

Daha fazla video keşfet