Bir Siteye Özel çoğaltma Blokaj içinde uyaran

Bu deneyin genel amacı, bir replikasyon çatalını nükleoprotein bloğunda durdurmak ve DNA onarım yolaklarını incelemek amacıyla blok bölgesindeki DNA yapılarını gözlemlemektir. Bu yöntem, hücrenin replikasyon düzeneği bir protein engelini karşılaştığında DNA'nın nasıl işlendiği gibi, DNA replikasyonu ve onarımıyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerden oluşan tüm bir popülasyonda, kromozom üzerindeki belirli bir konumda replikasyon çatalını tersinir bir şekilde durdurabilmemizdir.

Bu prosedürü laboratuvarımın üyelerinden Dr. Karla Mettrick, lisansüstü öğrenciler Georgia Weaver ve Tayla-Ann Corocher uygulamalı olarak göstereceklerdir. Bu prosedür için pKM1 plazmidinde bir tetrasiklin operatör dizisi taşıyan bir E.coli suşu kullanılmaktadır. pKM1, indüklenebilir sarı floresan protein etiketli bir tetrasiklin baskılayıcı protein olan TetR-YFP'yi kodlamaktadır.

Bu E.coli suşunun taze gece boyu kültürü, seçilim için gerekli antibiyotikleri içeren seyreltik kompleks bir ortamda 600 nanometrede 0,01 optik yoğunluğa seyreltin. Kültürü, 600 nanometrede 0,05 ila 0,1 optik yoğunluğa ulaşana kadar 30 degrees celsius sıcaklıkta çalkalamalı olarak büyütün. İndüklenmemiş kontrol olarak kullanılmak üzere 10 milliliter örneği ayırın.

pKM1'den TetR-YFP üretimini indüklemek için geri kalan kültüre %0,01 arabinose ekleyin. Hem indüklenmemiş hem de indüklenmiş kültürleri 30 degrees celsius sıcaklıkta çalkalamaya devam ederek büyütün. Bir saat sonra, floresan mikroskobu kullanarak indüklenmiş kültürdeki her bir hücrenin içinde tek bir odak noktasının mevcut olup olmadığını kontrol edin.

İndüklenmiş hücrelerin bloklandığı, hücrelerin %70'inden fazlasının tek bir odak göstermesiyle onaylanırsa, optik yoğunluk kaydedilir ve iki boyutlu jel elektroforezi ile analiz edilmek üzere örnekten 7,5 milliliters alınır. İndüklenmemiş kontrol kültüründen eşdeğer bir örnek alınır. Floresan mikroskopi öncesinde, görüntüleme sırasında hücrelerin hareketini önlemek için agaroz pedler hazırlanır.

Her bir agaroz ped için, 500 µL erimiş agarozu bir mikroskop lamı üzerine pipetleyin ve agaroz katılaşmadan hemen önce üzerini kapatma camı ile örtün. Lamları, ihtiyaç duyulana kadar nemli dokular arasında 4 °C'de saklayın. Hücrelerin kontrol edilme zamanı geldiğinde, kapatma camını agaroz pedden kaldırın ve 10 µL bakteri kültürünü pedin merkezine pipetleyin.

Agaroz ped kuruduğunda, yaklaşık beş dakika sonra, lamelle kapatın. Lamelin üzerine bir damla immersiyon yağı damlatın ve lamı optiğin altına yerleştirin. Hücreleri 100x büyütmede faz kontrast mikroskopisi kullanarak görüntüleyin.

Görüntüleme yazılımındaki Acquire iletişim kutusunda, Exposure Time değerini 100 milliseconds olarak ayarlayın. Görüntüyü yakalamak için Acquire seçeneğini belirleyin. Tablayı hareket ettirmeyin.

Acquired iletişim kutusunda, kameraya bağlı olan harici shutter için aydınlatma olarak YFP'yi seçin. Pozlama Süresini (Exposure Time) 1,000 milisaniye olarak ayarlayın. Sahne ışığını kapatın ve floresan görüntüsünü yakalamak için Acquire'ı seçin.

Bu prosedüre başlamak için, önceden toplanmış kültür örneklerine son konsantrasyonu 0.1% olacak şekilde sodyum azid ekleyin ve en az beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Hücreleri 5,000 ×g hızda on dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın.

Her bir hücre peletini 200 µL PIV tamponu içerisinde yeniden süspande edin ve hücreleri bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri peletlemek için mikrosantrifüjden geçirin ve süpernatantı atın. Bir mikroskop lamını 40 µL uygun bir cam su itici veya silikon çözeltisi ile işleyin.

Lam, bir mendille kurulanana kadar silin. En düşük hücre yoğunluğuna sahip hücreleri 50 µL PIV ile yeniden süspande edin ve bir ısıtıcı blokta 50 °C'ye yerleştirin. Diğer tüm örnekler için, her tüpteki nihai hücre yoğunluğu aynı olacak şekilde PIV hacimlerini ayarlayın.

Numunelere, PIV içerisinde taze hazırlanmış 0.8% Agaroz çözeltisinden eşit hacimde ekleyin. Katılaşmayı önlemek için numunelerin 50 °C üzerinde kalmasını sağlamak amacıyla bunları ısıtma bloğunda tutun. Yarı küresel plug'lar oluşturmak için hücre-agaroz süspansiyonundan 20 µL damlaları işlem görmüş lama yerleştirin.

Tıkaçlar katılaştığında, bir örneğe ait tüm tıkaçları nazikçe tek bir mikrofüj tüpüne aktarın ve bir mililitre hücre liziz tamponu ekleyin. 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. İki saatin ardından hücre liziz tamponunu uzaklaştırın ve 1 mililitre EDTA-Sarkozil-Proteinaz K veya ESP çözeltisi ekleyin.

50 °C'de gece boyunca veya tıkaçlar şeffaflaşana kadar inkübe edin. Tıkaçlar şeffaflaştığında, ESP tamponunu uzaklaştırın ve tıkaçları 15 ml'lik bir tüpe aktarın. 12 ml TE tamponu ekleyin ve 30 dakika bekletin.

Tıkaçları toplam beş kez TE tamponu ile yıkayın. Tıkaçları 1 mL TE tamponu içinde 4 °C'de saklayın. Replikasyon ara ürünlerini analiz etmek için, agaroz tıkaçlardaki DNA, ilgilenilen bölge için uygun bir restriksiyon enzimi ile sindirilir.

Bu örnekte EcoRV; ilgi alanındaki bölgede 5.5 kb ve 6.7 kb'lık fragmanlar elde etmek için DNA'yı dizinin hemen öncesinden, dizinin içinden ve dizinin sonrasından keser. Bu prosedüre başlamak için, bir agaroz plug'ı taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 150 µL restriksiyon enzimi tamponu ekleyin. 25 ila 100 ünite restriksiyon enzimi ekleyin ve 37 °C'de altı ila sekiz saat boyunca digesyon yapın.

Dört santigrat derecede %0,4'lük bir agaroz jel hazırlayın. 300 mililitre ergimiş agarozu yaklaşık 25'e 25 santimetre boyutlarındaki bir jel tepsisine dökün. Kuyucukları yaklaşık olarak plug çapıyla aynı genişlikte oluşturmak için bir tarak yerleştirin.

Jel donduğunda, tarağı çıkarın ve jeli oda sıcaklığına getirin. Bir ekim özesi kullanarak, sindirilmiş agaroz tıkaçlardan birini bir kuyuya kaydırın ve tıkacın düz tarafını, DNA'nın jele gireceği kuyu kenarına yaslayın. Her iki kuyudan birine aynı yöntemle tek bir tıkaç yerleştirin.

Tıkaçları konumunda sabitlemek için kuyucuklara erimiş %0.4 agaroz pipetleyin. Merdiven ile örnekler arasında boşluk bırakarak, boş bir kuyucuğa 1 kb DNA merdiveni yükleyin. Jeli oda sıcaklığında, 1xTBE içerisinde gece boyunca çalıştırın.

Ertesi gün, jeli 0,3 µg/mL etidyum bromür içeren bir su banyosunda 20 dakika boyunca boyayın. DNA'yı uzun dalga boylu bir UV transilüminatör ile görüntüleyin ve her bir şerit parçasını, şeridin her iki yanındaki fazla agaroz miktarını en aza indirecek şekilde düz ve eşit bir kesimle kesin. Kesilen jel şeridini, DNA migrasyon yönüne 90 derece olacak şekilde bir jel tepsisine yerleştirin.

Bir sonraki adım, ikinci boyut jeli için 300 mililitre agaroz hazırlamaktır. Agaroz 50 °C'ye soğuduğunda, jel dilimlerinin konumlarını sabitlemek için erimiş agarozu dilimlerin çevresine pipetleyin. Kalan agarozu, en az jel dilimleriyle aynı seviyeye gelecek bir derinlikte tepsiye dökün.

Jel katılaştıktan sonra, DNA yaklaşık 10 cm göç edene kadar, mililitre başına 0.3 µg etidyum bromür içeren 1xTBE içerisinde, 4 °C'de elektroforez yapın. Görünmeyen DNA'yı da kapsayacak şekilde, genomik DNA'nın bulunduğu blokları üzerindeki jel kısmıyla birlikte kesin. Jel içindeki DNA, daha sonra metin protokolünde açıklandığı üzere Southern hibridizasyonu ile görüntülenir.

Bu sistemde, replikasyon bloğu, hücrelerin çoğunun hücre içinde dizinin tek bir kopyasına karşılık gelen tek bir fokus içermesiyle doğrulanmıştır. Anhydrotetracycline eklenmesi bloğu geri çevirmiş ve dizinin ardından gelen duplikasyonu, çoklu fokuslara sahip hücrelerin birikimi olarak gözlemlenmiştir. Replikasyonu bloke edilmiş hücreler, anhydrotetracycline varlığındaki sonraki büyüme ile ortadan kalkan bir büyüme inhibisyonu da göstermiştir.

Replikasyon ara ürünlerini analiz etmek için DNA, birinci boyutta elektroforezlenmiştir. Ardından ilgilenilen DNA kesilmiş ve ikinci boyut elektroforezi sonucunda doğrusal DNA'dan oluşan bir diyagonal elde edilmiştir. Dizi DNA'sının Southern hibridizasyonu, bloklanmamış örnekte dizinin beklenen 5,5kb ve 6,7kb fragmanlarına karşılık gelen iki nokta ortaya çıkarmıştır.

Bloke edilmiş örnekte 5.5kb lekesinde bir azalma ve Y-şekilli DNA birikimine işaret eden eliptik bir sinyal eklenmesi görülmüştür. Anhydrotetracycline eklenmesi, Y-şekilli DNA sinyalini ortadan kaldırmıştır. Bir diğer yaygın ara ürün olan Holliday eklemi ise Y-arkının üst kısmında koni şeklinde bir sinyal ve Y-arkının sonunda lineer DNA'dan gelen bir sivrilik olarak görselleştirilmiştir.

Bu teknikte uzmanlaşıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde sekiz gün içinde tamamlanabilir. 2D bir prosedür olsa da, DNA yapılarının optimal şekilde görselleştirilebilmesi için DNA plug'larının kalitesinin kritik olduğunu unutmamak önemlidir.