Bir Siteye Özel çoğaltma Blokaj içinde uyaran E. E. coli Bir Floresan Baskılayıcı Operatör Sisteminin Kullanılması

Bu deneyin genel amacı, bir nükleoprotein bloğunda bir replikasyon çatalını durdurmak ve DNA onarım yollarını incelemek amacıyla bloğun bulunduğu yerdeki DNA yapılarını gözlemlemektir. Bu yöntem, hücrenin replikasyon aparatı bir protein barikatıyla karşılaştığında DNA'nın nasıl işlendiği gibi, DNA replikasyonu ve onarımı ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, tüm canlı hücre popülasyonu boyunca kromozom üzerinde belirli bir yerde bir replikasyon çatalını geri dönüşümlü olarak durdurabilmemizdir.

Bu prosedürü göstermek için laboratuvarımın aşağıdaki üyeleri Dr.Karla Mettrick ve yüksek lisans öğrencisi Georgia Weaver ve Tayla-Ann Corocher olacaktır. Bu prosedür için pKM1 plazmidinde bir tetrasiklin operatör dizisi taşıyan bir E.coli suşu kullanılır. pKM1, indüklenebilir sarı floresan proteini etiketli tetrasiklin baskılayıcı protein olan TetR-YFP'yi kodlar.

Bu E.coli suşunun taze bir gece kültürünü, seçim için gerektiği gibi antibiyotiklerle seyreltik kompleks bir ortamda 600 nanometre 0.01'lik bir optik yoğunluğa seyreltin. Kültürü, 600 nanometrede 0,05 ila 0,1 arasında bir optik yoğunluğa çalkalayarak 30 santigrat derecede büyütün. İndüklenmemiş kontrol olarak hizmet etmek için 10 mililitrelik bir numuneyi çıkarın.

pKM1'den TetR-YFP üretimini indüklemek için kalan kültüre% 0.01 arabinoz ekleyin. Hem indüklenmemiş hem de indüklenmiş kültürleri çalkalama ile 30 santigrat derecede büyütmeye devam edin. Bir saat sonra, floresan mikroskobu kullanarak indüklenen kültürün her hücresinde tek bir odak noktasının varlığını kontrol edin.

İndüklenen hücrelerin bloke olduğu doğrulanırsa, tek bir odağa sahip hücrelerin %70'inden fazlası ile gösterilirse, optik yoğunluğu kaydedin ve iki boyutlu jel elektroforezi ile analiz için numunenin 7,5 mililitresini çıkarın. İndüklenmemiş kontrol kültüründen eşdeğer bir numune çıkarın. Floresan mikroskobundan önce, görselleştirme sırasında hücrelerin hareketini önlemek için agaroz pedlerini hazırlayın.

Her agaroz pedi için, 500 mikrolitre erimiş agarozu bir mikroskop lamına pipetleyin ve agaroz katılaşmadan hemen önce lamel üzerine yerleştirin. Slaytları ıslak dokular arasında ihtiyaç duyulana kadar dört santigrat derecede saklayın. Hücreleri kontrol etme zamanı geldiğinde, lameli agaroz pedinden çıkarın ve pedin ortasına 10 mikrolitre bakteri kültürü pipetleyin.

Yaklaşık beş dakika sonra, agaroz pedi kuruduğunda, lamel yerine koyun. Lamel üzerine bir damla daldırma yağı koyun ve sürgüyü optiğin altına yerleştirin. 100x büyütmede faz mikroskobu kullanarak hücreleri görselleştirin.

Görüntüleme yazılımı içindeki Acquire (Edin) iletişim kutusunda, Exposure Time (Pozlama Süresi) değerini 100 milisaniye olarak ayarlayın. Görüntüyü yakalamak için Al'ı seçin. Sahneyi hareket ettirmeyin.

Alındı iletişim kutusunda, kameraya bağlı harici deklanşör için aydınlatma olarak YFP'yi seçin. Pozlama Süresini 1.000 milisaniye olarak ayarlayın. Sahne ışığını kapatın ve floresan görüntüyü yakalamak için Al'ı seçin.

Bu prosedüre başlamak için, önceden toplanan kültür örneklerine% 0.1'lik bir nihai konsantrasyona kadar sodyum azid ekleyin ve en az beş dakika buz üzerinde inkübe edin. Hücreleri on dakika boyunca 5.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın.

Her hücre peletini 200 mikrolitre PIV tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri bir mikrofüj tüpüne aktarın. Hücreleri peletlemek ve süpernatanı atmak için mikrosantrifüj. Bir mikroskop lamını 40 mikrolitre uygun bir cam su itici veya silikon solüsyonla tedavi edin.

Slaytı kuruyana kadar bir mendille ovalayın. En düşük hücre yoğunluğuna sahip hücreleri 50 mikrolitre PIV'de yeniden süspanse edin ve 50 santigrat derecede bir ısı bloğuna yerleştirin. Diğer tüm numuneler için, PIV hacimlerini, nihai hücre yoğunluğu her tüpte aynı olacak şekilde ayarlayın.

Numunelere eşit hacimde PIV içinde taze hazırlanmış %0.8 Agaroz çözeltisi ekleyin. Katılaşmayı önlemek için 50 santigrat derecenin üzerinde olduklarından emin olmak için numuneleri ısı bloğunda tutun. Yarım küre şeklinde tapalar üretmek için işlenmiş lam üzerine 20 mikrolitrelik hücre-agaroz süspansiyonu damlatın.

Tıkaçlar katılaştığında, tüm tapaları bir numuneden tek bir mikrofüj tüpüne yavaşça kaydırın ve bir mililitre hücre lizis tamponu ekleyin. İki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İki saat sonra, hücre lizis tamponunu çıkarın ve 1 mililitre EDTA-Sarkosyl-Proteinaz K veya ESP çözeltisi ekleyin.

Gece boyunca veya tapalar şeffaf olana kadar 50 santigrat derecede inkübe edin. Fişler şeffaf hale geldiğinde, ESP tamponunu çıkarın ve fişleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. 12 mililitre TE tamponu ekleyin ve 30 dakika bekletin.

Tapaları TE tamponu ile toplam beş kez yıkayın. Fişleri bir mililitre TE tamponunda dört santigrat derecede saklayın. Replikasyon ara ürünlerini analiz etmek için, agaroz tıkaçlarındaki DNA, ilgilenilen bölge için uygun bir kısıtlama enzimi ile sindirilir.

Bu örnekte EcoRV, ilgilenilen bölgede 5.5 kb ve 6.7 kb parçaları vermek için diziden hemen önce, dizi içinde ve diziden sonra DNA'yı keser. Bu işleme başlamak için, bir agaroz tapasını yeni bir mikrofüj tüpüne aktarın ve 150 mikrolitre kısıtlama enzimi tamponu ekleyin. 25 ila 100 birim kısıtlama enzimi ekleyin ve altı ila sekiz saat boyunca 37 santigrat derecede sindirin.

Dört santigrat derecede% 0.4'lük bir agaroz jeli hazırlayın. 300 mililitre erimiş agarozu yaklaşık 25 x 25 santimetrelik bir jel tepsisine dökün. Kuyuları tapanın çapı ile yaklaşık olarak aynı genişlikte yapmak için bir tarak yerleştirin.

Jel ayarlandığında tarağı çıkarın ve jeli oda sıcaklığına getirin. Bir aşılama halkası kullanarak, sindirilmiş agaroz tıkaçlarından birini bir kuyuya kaydırın ve tapanın düz tarafını DNA'nın jele gireceği kuyu tarafına doğru konumlandırın. Her ikinci kuyuya aynı şekilde tek bir fiş takın.

Tapaları yerinde kapatmak için oyuklara erimiş %0.4 agaroz pipetleyin. Boş bir kuyuya bir kb'lık bir DNA merdiveni yükleyin ve merdiven ile numuneler arasında bir boşluk bırakın. Jeli gece boyunca oda sıcaklığında 1xTBE'de çalıştırın.

Ertesi gün, jeli 20 dakika boyunca mililitre etidyum bromür başına 0.3 mikrogram içeren bir su banyosunda boyayın. DNA'yı uzun dalgalı bir UV transilluminatör ile görselleştirin ve her bir şerit parçasını düz, eşit bir kesimle kesin, şeridin her iki tarafında fazla agarozun dahil edilmesini en aza indirin. Eksize edilen jel şeridini, DNA göç yönüne 90 derece açıyla bir jel tepsisine yerleştirin.

Bir sonraki adım, ikinci boyut jeli için 300 mililitre agaroz hazırlamaktır. Agaroz 50 santigrat dereceye kadar soğutulduğunda, konumlarını sağlamlaştırmak için erimiş agarozu jel dilimlerinin etrafına pipetleyin. Kalan agarozu tepsiye en az jel dilimleri ile aynı derinlikte olacak şekilde dökün.

Jel katılaştıktan sonra, DNA yaklaşık 10 santimetre göç edene kadar dört santigrat derecede mililitre başına 0.3 mikrogram etidyum bromür içeren 1xTBE içinde elektroforez. Görünür olmayan DNA'yı dahil etmek için, üzerindeki jel de dahil olmak üzere genomik DNA'nın bulunduğu blokları kesin. Jel içindeki DNA daha sonra metin protokolünde tarif edildiği gibi Güney hibridizasyonuyla görselleştirilir.

Bu sistemde, bir çoğaltma bloğu, hücre içindeki dizinin bir kopyasına karşılık gelen bir odak içeren hücrelerin çoğunluğu tarafından onaylandı. Anhidrotetrasiklin ilavesi bloğu tersine çevirdi ve dizinin müteakip kopyalanması, çoklu odaklara sahip hücrelerin birikimi olarak görselleştirildi. Bloke edilmiş replikasyonu olan hücreler ayrıca, anhidrotetrasiklin varlığında müteakip büyüme ile tersine çevrilen büyüme inhibisyonu gösterdi.

Replikasyon ara ürünlerini analiz etmek için, DNA birinci boyutta elektroforez edildi. İlgilenilen DNA daha sonra eksize edildi ve ikinci bir boyut elektroforezi, doğrusal DNA'nın bir köşegeni ile sonuçlandı. Dizi DNA'sının güney hibridizasyonu, dizinin beklenen 5.5kb ve 6.7kb parçalarına karşılık gelen bloke edilmemiş örnekte iki nokta ortaya çıkardı.

Engellenen örnek, 5.5kb noktasında bir azalma ve Y şeklinde DNA birikimini gösteren eliptik bir sinyalin eklenmesini gösterdi. Anhidrotetrasiklin ilavesi, Y-şekilli DNA sinyalini ortadan kaldırdı. Diğer bir yaygın ara ürün, Y-yayının tepesinde bir koni sinyali ve Y-yayının sonunda doğrusal DNA'dan bir sivri uç olarak görselleştirilen Holliday bağlantısıdır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde hazırlanırsa sekiz gün içinde yapılabilir. 2D bir prosedür olsa da, DNA tıkaçlarının kalitesinin, DNA yapılarının en iyi şekilde görselleştirilmesi için kritik olduğunu hatırlamak önemlidir.