Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bireysel metabolik yol, genetik değişiklikler ve/veya farmakolojik tedavilerin neden olduğu glikoliz, piruvat metabolizması ve trikarboksilik asit döngüsü içinde tüm hayvan düzeyinde gerçek zamanlı metabolik değişiklikleri invaziv olmayan bir şekilde izlemektir. Bu, ara metabolik yollardaki genetik ve/veya farmakolojik değişikliklerin kantitasyonuna izin vermek için daha fazla metabolitte yeterli izotopik zenginleştirme sağlamak için canlı nematodlara kararlı izotopların beslenmesiyle elde edilir. İkinci bir adım olarak, atmosferik ve çözünmüş karbondioksite izotopik katılım, kısa süreler boyunca ara metabolik akının daha doğrudan değerlendirilmesini sağlayan gaz oranı kütle spektrometresi ile ölçülür.

Daha sonraki numuneler, nematodlardaki metabolik akı değişikliğini ölçmek için GCMS ile amino asitlerde ve organik asitlerde izotopik zenginleştirme yoluyla HPLC kullanılarak tam solucan içermeyen amino asit analizi için işlenir. Kararlı izotop maruziyetini takiben, ara metabolitlerdeki izotopik bolluğu sorgulamak için yabani tip solucanlarda değişken süreli izotop maruziyeti, bakteri temizleme ve alternatif solucan bozulmasının etkilerini gösteren sonuçlar elde edilir. Yöntemle savaş, aracı metabolizmaya karşı yelken açma konusunda fikir verebilir.

Memeli hücre hatları ve dokuları gibi sistemlerimize de uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak, HPLC ile serbest solucan amino asit analizinde, birincil solunum değişiklikleri Fonksiyonunda bozulmuş ara metabolik akıyı düşündüren tutarlı anormallikler gözlemlediğimizde aklımıza geldi. Bu Prosedüre başlamak için.

Gelişim sırasında veya yetişkinlik döneminde metabolik öncü olarak işaretlenmiş kararlı bir izotopa maruz kalan solucanlar, 1.5 mililitrelik bir plastik santrifüj tüpünde toplanır. Solucanları genellikle bir mililitre başına 1000 solucan konsantrasyonuna seyreltiriz. Solucanlara iç standart olarak epsilon aminokaproik asit içeren klorik asit başına% 60 ekleyin, klorik asit başına% 4 ve 20 nanomolar iç standart nihai konsantrasyona ekleyin.

Solucanın beş dakika boyunca yerçekimi ile yerleşmesine izin verin, ardından süpernatanı çıkarın ve başka bir tüpte saklayın. Aşağıdaki adım, bu prosedürün en kritik yönlerinden biridir. Solucanlar, serbest metabolit analizinden önce tarama ile tamamen parçalanmalıdır Plastik bir homojenizatör ve motorlu matkap kullanarak, solucan örneklerini 15 saniye boyunca öğütün.

Işık mikroskobu ile solucan bozulmasını görsel olarak onaylayın ve gerekirse öğütme işlemini tekrarlayın. Bu görüntüde, A ve B panelleri öğütme işleminden önceki solucanları göstermektedir. Öğütme işleminden sonra solucanları gösteren panel C ve D'nin aksine, daha önce kaydedilmiş süpernatanı solucan Homojenat santrifüj ile 1,5 mililitrelik plastik santrifüj tüplerine aktarın.

Numuneler beş dakika boyunca 2, 250 RPM 1300 Gs'de. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı yedi mililitrelik taze bir cam tüpe aktarın. Peletleri daha sonra bir protein konsantrasyonu tahlilinde kullanmak üzere saklayın.

Şimdi, numunelerin pH aralığı yedi ila sekiz santrifüj olana kadar SUPERNAT'a dört normal potasyum hidroksit ekleyin. Yedi mililitrelik cam tüplerde 2, 250 RPM 1300 Gs'de beş dakika boyunca nötralize edilmiş numuneler Tuzları çıkarmak için, süpernatanı her numuneden taze yedi mililitrelik bir cam tüpe aktarın. Nötralize edilmiş numuneler artık yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC ve gaz kromatografisi, kütle spektrometresi veya HPLC için GCMS ile metabolit kantitasyonu için hazırlanabilir.

HPLC'ye doğrudan enjeksiyon için nötralize edilmiş her numuneden 50 mikrolitre ayırın. Serbest amino asit kantitasyonu, al aldehit ve floresan tespiti ile prekal türevleştirme kullanılarak gerçekleştirilir. Daha önce açıklandığı gibi, kalan nötralize edilmiş numuneler, bir sonraki Bölümde gösterildiği gibi amino asitlerde ve organik asitlerde izotopik zenginleşmeyi belirlemek için GCMS için bir iyon değişim reçinesi kullanılarak ekstraksiyona tabi tutulacaktır.

Boncukları hazırlamak için, bir G boncuğuna ve bir G 50 boncuğuna ayrı ayrı bir normal hidroklorik asit ekleyin. Bir litrelik beherlerde, her bir şişeyi manyetik bir karıştırma ile 30 dakika karıştırın. Bundan sonra, yıkamaların pH'ı suyun pH'ına eşit olana kadar boncukları 10 kez deiyonize su ile yıkayın.

Daha sonra, cam pipetler kullanarak özel yapım düşük maliyetli kolonlar hazırlama yöntemimizi göstereceğiz. Önceden hazırlanmış sütunlar da ticari olarak temin edilebilir. Bir sütun hazırlamak için, bir mera pipet ucunun en dar kısmının hemen üzerine pamuklu bir tıkaç yerleştirmek için forseps kullanın, organik asit ekstraksiyonu için bir G bir boncuk ve bir G 50 boncuk kullanın.

Amino asit ekstraksiyonu için, her sütunu sütun yüksekliğinin yaklaşık üçte birine kadar doldurun. Bir numune zaten nötr pH'ta ise, AG bir sütununa uygulanmadan önce numuneye hiçbir şey eklenmez. Amino asitleri çıkarmak üzere organik asitleri ekstrakte etmek için, AG 50 kolonuna uygulamadan önce numuneye bir mililitre 0.1 normal hidroklorik asit ekleyin.

Şimdi önceden hazırlanmış nötralize edilmiş numuneleri her sütuna uygulayın. Yıkamalar nötr olana kadar her sütunu 10 kez suyla yıkayın. Yıkama tamamlandıktan sonra, her bir sütunu taze etiketli dört mililitrelik cam numune şişelerine elüte edin Organik asit ekstraksiyonu için, AG bir sütuna üç mililitre üç normal hidroklorik asit ekleyin.

Bu, üç karbon türü, dört karbon türü, beş karbon türü ve altı karbon türü arasındaki toplam etiketli karbon sayısındaki izotop zenginleştirmesinin analizine izin verir. Amino asit ekstraksiyonu için, a G 50 sütununa üç mililitre dört normal amonyum hidroksit ekleyin. Bu, üç karbon türü ve beş karbon türü arasında toplam etiketli karbon sayısındaki izotop zenginleştirmesinin analizine izin verir.

Hem organik asit hem de amino asit ekstraksiyonlarının tamamlanmasının ardından, numune şişelerini kuruyana kadar gece boyunca reaktif bir uygulama üç buharlaştırıcıya yerleştirin. Örnekler daha sonra Protokol metninde detaylandırıldığı gibi GCMS tarafından dert edilir ve analiz edilir. Bu prosedüre, bin genç yetişkin solucanı, evrensel olarak etiketlenmiş karbon 13 glikoz ve e coli içeren deneysel bir 35 milimetre NGM agri plakasına aktararak başlayın.

Ardından, deneysel NGM plakasını kapağı olmadan yerleştirin. Hassas atmosfer örneklemesi ve değişimine izin vermek için iyi kapatılmış üç yollu bir durdurma musluğu ile donatılmış özel bir cam odada. Optik olarak saydam cam diskin plakaya oturduğu contayı yüksek vakumlu gres ile kapatın.

Hazneyi cam diskle kapatın. Zamanı kaydedin. Sıfır zamanı olarak, 30 dakika sonra, üç yollu durdurma musluğu ile cam hazneden 10 mililitre atmosferi örneklemek için 20 mililitrelik bir şırınga kullanın.

Durdurma musluğunu hazneye kapatın Numune alımından sonra, numuneyi 0.1 molar sodyum hidroksit içinde bir mililitre sodyum bikarbonat içeren kırmızı küvet vakumlu bir cam tüpe aktarın. Daha sonra, üç yollu durdurma musluğundan cam hazneye 10 mililitre hava enjekte edin. 20 mililitrelik bir şırınga kullanarak, durdurma musluğunu hazneye kapatın Atmosferi yeniden enjekte ettikten sonra ve inkübasyona devam etmeden önce, atmosferin cam hazneden örneklemesini 60, 90 ve 120 dakikada tekrarlayın.

Protokol metninde açıklandığı gibi bir gaz oranı kütle spektrometresi kullanarak etiketli karbon zenginleştirme için bu atmosferik karbondioksit örneklerini analiz edin, kararlı İzotoplar, burada atmosferik karbondioksitte ölçülen etiketli karbon ve canlı veya UV ışınlanmış öldürülmüş OP 50 e coli ile beslenen solucanlarda çözünmüş solucan karbon dioksit ile kanıtlandığı gibi iki saat sonra genç yetişkin solucanlara iyi bir şekilde dahil edilir. Karbon 13 karbondioksitin karbon 12 karbon dioksite oranı, çözünmüş solucan karbondioksit fraksiyonunda salınan atmosferik karbondioksite göre daha yüksekti. Larva döneminden itibaren stabil bir izotopa uzun süre maruz kalmanın ve ardından NGM Aate üzerindeki solucanların bakteri olmadan temizlenmesinin, genç yetişkin solucanlarda serbest glutamatın izotopik zenginleşmesini arttırdığı gözlenmiştir.

Bu grafikte L bir, L bir larva aşamasından 959 hücreli genç yetişkin aşamasına kadar evrensel olarak etiketlenmiş karbon 13 glikoz ve OP 50 bakteri ile beslenen solucanları temsil eder, YA, karbon 13 glikoz ve OP 50 bakteri ile beslenen solucanları temsil eder 48 saat boyunca yumurtlayan genç yetişkin aşamasına ulaştıklarında başlar. X ekseni, her bir glutamat türündeki etiketli karbon atomlarının toplam sayısını gösterir ve Y ekseni, zenginleştirme yüzdesini gösterir. Tüm hayvanlar, aşağı akış numunesi hazırlanmadan önce fazla izotopik etiketten arındırıldı.

GCMS analizleri için yeşil çubuklar, PCA ekstraksiyonundan iki saat önce NGM plakaları üzerinde OP 50 E coli ile beslenerek izotopik maruziyetin ardından temizlenen solucanları gösterir. Mavi ve gri çubuklar, izotopik maruz kalma süresi seyrinden bağımsız olarak, PCA ekstraksiyonundan önce sırasıyla iki veya altı saat boyunca bakteri içermeyen NGM plakalarında izotopik maruziyetin ardından temizlenen solucanları gösterir. Hayvanlar iki veya altı saat boyunca plakalar üzerinde temizlendiğinde ara metabolitlerde izotopik zenginleştirmede önemli bir fark gözlenmemiştir.

Her iki izotopik maruz kalma kursunda da, hayvanlar iki saat boyunca etiketlenmemiş bakterilerle beslenerek temizlendiğinde ara metabolitlerde daha az izotopik zenginleşme gözlendi. Bu nedenle, izotop ile bakteri yayılımlı N GM plakaları üzerinde yetiştirilen solucanlar için optimal temizleme protokolünün, ara metabolitlerde yüzde zenginleşmeyi optimize etmek için yayılmamış NGM plakaları üzerinde iki saat boyunca temizleme olduğu belirlenmiştir. Bakteri içermeyen bir altı karbon 13 glikoz ile sıvı kültürde 24 saat tedavi edildikten sonra.

Bu şekilde gösterildiği gibi, tek başına sonikasyon veya sonikasyon artı öğütme ile bozulan solucan örneklerinin bir karşılaştırması yapıldı. Sonikasyon artı öğütme ile bozulan solucanlar, yalnızca Sonikasyon tarafından bozulan örneklerden daha fazla izotopik zenginleştirmeye sahipti, nihayet canlı solucanları ya L'den plakalar üzerinde bir aşamadan itibaren ya da yumurtanın ilk gününden başlayarak kararlı bir izotopik öncü ile besledi, sıvı kültürde 24 saat boyunca genç yetişkinler olarak yumurtladı. Glikoliz yoluyla akıyı gösteren metabolitler arasındaki izotopik zenginleşmenin, geliştirilmesinden sonra trikarboksilik asit döngüsündeki piruvat metabolizmasının hassas analizine izin verin.

Bu teknik, mitokondriyal hastalığın yolunu açtı, deniz zarafetindeki ara metabolik akışı keşfetmek için yapılan araştırmalar. Bu videoyu izledikten sonra, nematodlarda kararlı izotopik, ara metabolizma ve metabolik akının profilinin nasıl çıkarılacağı, zarafet hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.