Name: Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta stabil izotopik profilleme ve metabolik akı analizi yöntemini. Bu teknik, genetik ve farmakolojik değişiklikleri nicelendirmek için canlı nematodlarda izotop zenginleştirmesini ölçer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (K08-DK073545 ve NICHD-sponsorluğunda Fikri ve Gelişimsel Engelliler Araştırma Merkezi Yeni Araştırmacı Ödülü), Philadelphia Vakfı, Pennsylvania McCabe ödülü Üniversitesi (MJF) yanı sıra, Tristan tarafından finanse edildi Mullen Fonu (MJF ve MY). Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

<ol><li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22C.+elegans%3A+A+practical+approach%22">C. elegans: A practical approach</a>. , University Press. Oxford. (1999).</li>
<li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li>
<li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chromatography%22%5BJournal%5D)">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li>
<li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+profiling+of+mitochondrial+respiratory+chain+mutants+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans.</a> Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).</li>
<li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, Suppl 1. 37-41 (2010).</li>
<li>Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+deficiency+in+Caenorhabditis+elegans+results+in+developmental+arrest+and+increased+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span.</a> J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).</li>
</ol>

Izotopik bolluk aracı metabolitleri ölçmek için kütle spektrometresi uygulanması kritik biyokimyasal değişiklikler 5 harika detaylı bir resmini tanıyor. Burada, genetik olarak çok yönlü bir model hayvan, C. aracılık metabolik akı değerlendirmek için bu son derece duyarlı ve özgül bir metodoloji istismar için ayrıntılı protokolleri sağladı elegans. Gerçekten de, stabil izotop ile yaşayan hayvanların beslenmesi aşağı metabolitleri izotopik zenginleştirme ölçerken metabolik öncüleri (örneğin, C-13 glukoz gibi) aracı metabolik yolu akı içine roman fikir izin etiketli. Glikoliz, pirüvat metabolizma ve trikarboksilik asit döngüsü ile akı sağlam analiz elde etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdi. Bu erken larval gelişim evreleri stabil izotop beslenen hayvanlarda ya da post-mitotik yetişkin dönemde başlayan hem de elde edilebilir. Ücretsiz solucan alanin, aspartat, glutamat ve glutamin farklı türlerin mutlak izotopik zenginleştirme önceden belirlemek için, 4 açıklandığı gibi farklı metabolit türlerin izotopik zenginleştirme, yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile tüm solucan serbest amino asit profili ile birlikte okudu. Gerçekten de, 1.000 ila 2.000 genç erişkin senkron solucanları hacimde, amino asit ve organik asit analitlerin ölçerken izotopik zenginleştirme tutarlı desenler elde edilir. Böyle bir metodoloji, hassas, yabani tip solucanlar göre nükleer gen tabanlı mitokondriyal mutant anormal aracı akı ayrımcılık. Bu teknik uygunluğu belirli biyokimyasal yollar sık ​​görülen doğumsal metabolizma akı değişiklikleri araştırmak için değeri tutar. Özellikle, stabil izotop ile işaretlenmiş glikoz kullanımını mitokondrial hastalığı ile ilgili merkezi metabolik yollar aracılığıyla karbon akı bilgilendirir. Gerçekten de, bizim böyle bir metodolojinin uygulama hassas yabani tip solucanlar göreceli bir nükleer gen tabanlı mitokondriyal karmaşık III altbirim mutant suş (isp-1 (qm150)) anormal aracı akı ayrımcılık öneririz. Izotopik maruz kalma birkaç gün bir süre içinde tamamlanmış olduğundan, hücre tabanlı modeller belirlenecek gibi sayısal izotopik zenginleştirme zaman belirli bir süre boyunca &quot;kararlı durum&quot; zenginleştirme değeri yerine ölçülebilir akı temsil ettiğini kabul etmek önemlidir. saat dakika bir süre için izotop maruz. Yolağı akı nematod gelişimi boyunca sorguya başka potansiyel sınırlama özellikle mutant suşların ortaya çıkan larva gelişimini uzunlukları farklı ilgilidir. Örneğin, birçok ciddi mitokondriyal mutasyonlar üçüncü (L3) larva dönemi 6 tutuklama neden olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, sadece yetişkinliğe hayatta hayvanlar izotop esas analizi tüm mutant nüfusunun temsilcisi olmayabilir. Ancak, bu yöntem belirli bir larva dönemi (L2) ziyade hayvanlar yetişkin aşamaya ulaşmak için bekleyen aracı metabolitleri izotopik dahil değerlendirmek için adapte edilebilir. Benzer şekilde, büyük olasılıkla Dauer olarak bilinen alternatif larva dönemi girin hayvanların önemli ölçüde doğrudan dört larval aşamalardan geçerek devam hayvanlara göre (büyük olasılıkla daha düşük) metabolik akı değiştirmiştir. Gelecek çalışma aynı zamanda doğrudan Dauer sahne hayvanlarda farklı genetik geçmişleri izotopik birleştirmek değerlendirmek için yapılabilir. Hayvanlar genç yetişkin aşamasına ulaştıktan sonra başlayan sabit bir süre için (burada, 24 ila 48 saat) stabil izotop hayvanların maruz kalması (Protokol B ayrıntılı olarak) değişken gelişim dönemlerinin etkisi ortadan kaldırır. 13 C-glikoz glikoliz, pirüvat metabolizma ve trikarboksilik asit döngüsü akı sorguluyor, diğer izotop izleyiciler nematod ilgi diğer yollar aracılığıyla biyokimyasal yol akı sorgulamak için potansiyel değerlendirilecektir olabilir. Örneğin, 15 N-glisin amino asit cirosu nematod olarak değerlendirmek için kullanılabilir olabilir. Bu yaklaşımın bir başka potansiyel sınırlama metaboliti algılama hassasiyet seviyesi. Deneyimlerimiz, en az 500 genç erişkin nematod burada istihdam edilen HPLC ve GC / MS yöntemleri başarıyla izotopik birleştirmek ölçmek için gerekli göstermektedir. Ultra performanslı sıvı kromatografi (UPLC) gibi yüksek hassasiyette, enstrümanların kullanımı, biz bu tek solucanlar metaboliti olan türler içine metabolitleri ve izotopik dahil güvenilir kantitatif izin olası tahmin rağmen, çalışılan hayvan sayısının daha da azalmasına izin verebilir. Biz, biz her bir suş düşük bolluk metabolitleri güvenilir bir şekilde tespit etmek için deney başına 1.000 hayvanların solucan popülasyonları okudu. Ancak, böyle bir GABA gibi bazı metabolitleri, sadece güvenilir, sipariş üzerine, nematod nüfusları çok daha büyük sayısal olabilir1x10 6 hayvanların 4. Özet olarak, stabil izotop profili doğuştan metabolizma uzun çalışma için kullanılan bir non-invaziv ve güvenli (radyoaktif olmayan) bir yaklaşım sağlar. Bu metodoloji C. Uygulama elegans bireysel genetik bozukluklar ve / veya farmakolojik ajan maruz kalma sonucu in vivo, gerçek zamanlı, tüm hayvan seviyesinde meydana gelen metabolik değişiklikler, araştırmak için roman kapasiteli sağlar .

<table><tbody><tr><td>S. basal</td><td></td><td>&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; - sayfa 59</td><td>Protokoller A ve B</td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8503</td><td>Protokol B</td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Protokoller A ve C</td></tr><tr><td>K12 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Protokol B</td></tr><tr><td>NGM agarı</td><td>Research Products International Corp.</td><td>N81800-1000.0</td><td>Protokoller A, B ve C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C glikoz (evrensel olarak işaretlenmiş)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-1396</td><td>Protokol A ve C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C glikoz (1,6 işaretlenmiş)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-2717</td><td>Protokol B</td></tr><tr><td>%60 Perklorik asit (PCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MK2766500</td><td>Protokoller A ve B</td></tr><tr><td>&amp;#949;-aminokaproik asit (İç Standart)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2504</td><td>Protokoller A ve B</td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>Regis</td><td>270243</td><td>Protokol E</td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Regis</td><td>270010</td><td>Protokol E</td></tr><tr><td>AG 1-X8, 100-200, Klorür formlu reçine</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1441</td><td>Protokoller A ve B (organik asit ekstraksiyonu)</td></tr><tr><td>AG 50W-X8, 100-200, Hidrojen formlu reçine</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1441</td><td>Protokoller A ve B (amino asit ekstraksiyonu)</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8875</td><td>Protokol C</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Protokol C</td></tr><tr><td>3N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protokol D</td></tr><tr><td>1N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protokol A</td></tr><tr><td>0,1 N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protokol D</td></tr><tr><td>4N NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501</td><td>Protokol D</td></tr><tr><td>4N KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>Protokoller A ve B</td></tr><tr><td>Deiyonize su</td><td>Milli Q Biocel</td><td>ZMQA60F01</td><td>Protokol D</td></tr><tr><td>Helyum</td><td>Airgas</td><td>24001364</td><td>Protokol C2</td></tr><tr><td>SMZ-800 Zoom Stereo-Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>NI MNA41000</td><td>Protokoller A, B ve C</td></tr><tr><td>pH metre</td><td>Fisher Scientific</td><td>S68167</td><td>Protokoller A ve B</td></tr><tr><td>Masaüstü santrifüj - 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-93</td><td>Protokoller A ve B</td></tr><tr><td>İnkübatörlü platform çalkalayıcı</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1324-0004</td><td>Protokol B</td></tr><tr><td>Mini LabRoller Rotatör</td><td>Labnet International</td><td>H-5500</td><td>Protokoller A ve B</td></tr><tr><td>Havanlar</td><td>Kontes Corp</td><td>K749520-0090</td><td>Protokoller A ve B</td></tr><tr><td>Matkap</td><td>Kontes Corp</td><td>K749540-0000</td><td>Protokoller A ve B</td></tr><tr><td>1 L cam beher</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-539P</td><td></td></tr><tr><td>1 L Erlenmeyer Flasklar</td><td>VWR international</td><td>89000-368</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Erlenmeyer Flasklar</td><td>VWR international</td><td>89000-356</td><td>Protokol B</td></tr><tr><td>7 ml yuvarlak tabanlı cam tüpler + kauçuk tıpa</td><td>VWR international</td><td>VT6431</td><td>Protokoller A, B ve C1,C2</td></tr><tr><td>10 ml yuvarlak tabanlı cam tüpler + kauçuk tıpa</td><td>VWR international</td><td>VT6430</td><td>Protokol C2</td></tr><tr><td>Mavi kapaklı tüpler</td><td>Labco</td><td>438B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik plastik tüpler</td><td>Falcon BD</td><td>14-959-49A</td><td>Tüm protokoller</td></tr><tr><td>1,5 ml mikrofüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td>Protokoller A ve B</td></tr><tr><td>Şırıngalar (1 mL, 10 mL, 20 mL)</td><td>BD Biosciences</td><td>301025, 301029, 301031</td><td>Protokoller C1 ve C2</td></tr><tr><td>25 gauge iğneler</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-253-131</td><td>Protokoller C1 ve C2</td></tr><tr><td>Poly-Prep Kromatografi Kolonları</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td>Protokol D</td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri</td><td>VWR international</td><td>14673-043</td><td>Protokol D</td></tr><tr><td>60 mm Petri kapları</td><td>VWR international</td><td>25373-085</td><td>Protokol C</td></tr><tr><td>Gres ile sızdırmaz 3 yollu stopkok ile donatılmış cam hazne (1 L flask'ın alt kısmı kesilmiş)</td><td>Özel Yapım</td><td></td><td>Protokol C</td></tr><tr><td>Optik olarak şeffaf cam plaka</td><td>Özel Yapım</td><td></td><td>Protokol C</td></tr><tr><td>Reacti-Vap III Evaporatör</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>18826</td><td>Protokol D</td></tr><tr><td>Pamuk</td><td>VWR international</td><td>14224-516</td><td>Protokol D</td></tr><tr><td>Yüksek Vakumlu Gres</td><td>Dow Corning</td><td>1597418</td><td>Protokol C1</td></tr><tr><td>Alüminyum Folyo</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-18</td><td>Protokol B</td></tr><tr><td>Zamanlayıcı</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-2504-5</td><td>Protokol C</td></tr><tr><td>Gaz Oranlı Kütle Spektrometresi</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td>Protokol D</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Hewlett-Packard</td><td>5980/5971</td><td>Protokol D</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>6980N/5973N</td><td>Protokol D</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>9010</td><td>Protokol D</td></tr></tbody></table>

kararlı İzotopik profil geliştirilmesi ve yetişkin sahne aracı metabolik akı caenorhabditis elegans</em

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Kararlı izotop profil uzun hassas araştırmalar, genetik mutasyonlar ve / veya hücresel ve memeli modellerinde farmakolojik tedaviler metabolik sonuçları izin verdi. Burada, nematod, Caenorhabditis elegans aracı metabolizma ve metabolik akı kararlı izotop profil gerçekleştirmek için detaylı yöntemleri açıklar. Yöntemler çeşitli farmakolojik tedavilere maruz kaldığında, genç yetişkinler olarak nematod büyüme medya agar plaklarına veya başından erken gelişim ya kararlı izotopu maruz hayvanların tüm solucan serbest amino asitler, etiketli karbon dioksit, etiketli organik asitler, amino asitler ve etiketli profil için açıklanan sıvı kültürü. Serbest amino asitler,% 4 perklorik asit çıkarılan tüm solucan alikotları yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ile nicel. Evrensel etiketli 13 C-glukoz veya 1,6 - 13 C 2-glukoz, etiketli karbon, karbon dioksit kütle spektrometresi (hem atmosferik ve çözünmüş) yanı sıra, glikoliz yoluyla akı göstergesidir metabolitleri tarafından takip kararlı izotop habercisi olarak kullanılmaktadır pirüvat metabolizma ve trikarboksilik asit döngüsü. Temsilcisi (isp-1 (qm150) izotopik esas mitokondriyal kompleksi III mutant solucanlar gibi göreceli bir ölçüde, yabani tip nematod izotop pozlama süresi etkileri, çeşitli bakteriyel temizleme protokolleri ve alternatif solucan bozulma yöntemleri göstermek için dahil edilmiştir ) yabani tip solucanlar göre. Yaşayan nematod kararlı izotop profil Uygulama bireysel genetik bozukluklar ve / veya farmakolojik tedaviler neden olan bütün hayvan düzeyinde gerçek-zamanlı metabolik değişiklikler araştırmak için yeni bir kapasite sağlar.

Kararlı izotop profil aracı metabolik akı gaz kromatografisi kütle spektrometrik analizi, nematod açıklanan<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. Yöntem, karbon dioksit, organik asitler, amino asitler ve agar plaklarına gelişimi sırasında ya da sıvı kültür yetişkinlik döneminde ya izotop maruz izotopik zenginleştirme değerlendirilmesi için ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans</em

Stabil izotopik profilleme, ...'daki genetik mutasyonların ve/veya farmakolojik tedavilerin metabolik sonuçlarının hassas bir şekilde araştırılmasına uzun süredir olanak sağlamaktadır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı; bireysel metabolik yollar, genetik değişiklikler ve/veya farmakolojik tedaviler tarafından tetiklenen glikoliz, piruvat metabolizması ve trisiklik asit döngüsü içindeki gerçek zamanlı metabolik değişimleri, tüm hayvan düzeyinde non-invaziv olarak izlemektir. Bu, ara metabolik yollardaki genetik ve/veya farmakolojik değişikliklerin miktar tayinine izin verecek şekilde, daha fazla metabolitte yeterli izotopik zenginleştirme sağlamak amacıyla canlı nematodlara stabil izotoplar verilerek gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, atmosferik ve çözünmüş karbondioksitteki izotopik birikim, kısa süreler boyunca ara metabolik fluksun daha doğrudan değerlendirilmesini sağlayan gaz oranı kütle spektrometrisi ile ölçülür.Ardından, nematodlardaki metabolik akı değişimini nicelleştirmek amacıyla, örnekler HPLC kullanılarak tüm solucan serbest amino asit analizi ile GCMS kullanılarak amino asitler ve organik asitlerdeki izotopik zenginleştirme için işlenir. Stabil izotop maruziyetinin ardından, ara metabolitlerdeki izotopik bolluğu sorgulamak için yabani tip solucanlarda değişken izotop maruziyet sürelerinin, bakteriyel temizlemenin ve alternatif solucan parçalama yöntemlerinin etkilerini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, ara metabolizmaya dair içgörü sağlayabilir.Ayrıca memeli hücre hatları ve dokular gibi sistemlerimize de uygulanabilir. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, primer solunum fonksiyonu değişikliklerinde ara metabolik akışın bozulduğuna işaret eden, HPLC ile yapılan serbest solucan amino asit analizlerinde tutarlı anormallikler gözlemlediğimizde edindik. Bu prosedüre başlamak için.Gelişim sürecinde veya yetişkinlikte stabil izotopla işaretlenmiş metabolik öncüle maruz bırakılan solucanlar, 1,5 mililitrelik plastik bir santrifüj tüpüne toplanır. Genellikle solucanları mililitre başına 1000 solucan konsantrasyonuna seyreltiriz. İç standart olarak epsilon aminokaproik asit içeren %60 perklorik asidi, solucanlara %4 perklorik asit ve 20 nanomolar iç standart son konsantrasyonu olacak şekilde ekleyin.Solucanın yerçekimi ile çökmesi için beş dakika bekleyin, ardından süpernatantı uzaklaştırarak başka bir tüpe kaydedin. Bir sonraki adım, bu prosedürün en kritik yönlerinden biridir. Serbest metabolit analizinden önce solucanların eleme yoluyla tamamen parçalanması gerekir. Plastik bir homojenizatör ve motorlu matkap kullanarak, solucan örneklerini 15 saniye boyunca öğütün.Solucan parçalanmasını ışık mikroskobu ile görsel olarak doğrulayın ve gerekirse öğütme işlemini tekrarlayın. Bu görüntüde, A ve B panelleri öğütme öncesindeki solucanları göstermektedir. Öğütme sonrası solucanları gösteren C ve D panellerinin aksine, daha önce saklanan süpernatantı solucan Homojenat santrifüjü ile 1,5 mililitrelik plastik santrifüj tüplerine aktarın.Örnekleri 2.250 RPM 1300 Gs hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, süpernatanı taze bir yedi mililitrelik cam tüpe aktarın. Peleti, daha sonra bir protein konsantrasyon analizi için kullanmak üzere saklayın.Şimdi, örneklerin pH aralığı yedi ile sekiz olana kadar süpernatana dört normal potasyum hidroksit ekleyin. Tuzları uzaklaştırmak için, yedi mililitrelik cam tüplerdeki nötralize edilmiş örnekleri 2.250 RPM 1300 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve her örneğin süpernatanını yeni bir yedi mililitrelik cam tüpe aktarın. Nötralize edilmiş örnekler artık yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC ve gaz kromatografisi, kütle spektrometrisi veya GCMS ile metabolit kantifikasyonu için hazırlanabilir; HPLC için.Nötralize edilmiş her örneğin 50 µL'sini HPLC'ye doğrudan enjekte etmek üzere ayırın. Serbest amino asit miktar tayini, bir aldehit ile ön kalibrasyon türevlendirmesi ve floresan deteksiyon kullanılarak gerçekleştirilir. Daha önce açıklandığı üzere, geri kalan nötralize edilmiş örnekler, bir sonraki Bölümde gösterildiği gibi amino asitler ve organik asitlerdeki izotopik zenginleşmeyi belirlemek amacıyla GCMS için iyon değişim reçinesi kullanılarak ekstraksiyona tabi tutulacaktır.Boncukları hazırlamak için, G1 ve G50 boncuklarına ayrı ayrı normal hidroklorik asit ekleyin. Bir litrelik beherlerde, her bir flaskı manyetik karıştırıcı ile 30 dakika boyunca karıştırın. Ardından, yıkama sularının pH değeri suyun pH değerine eşitlenene kadar boncukları 10 kez deiyonize su ile yıkayın.Ardından, cam pipetler kullanarak düşük maliyetli özel kolon hazırlama yöntemimizi göstereceğiz. Hazır kolonlar ticari olarak da temin edilebilir. Kolon hazırlamak için, bir penset yardımıyla pastör pipet ucunun en dar kısmının hemen üzerine bir pamuk tıkaç yerleştirin; organik asit ekstraksiyonu için G 1 boncuklar ve G 50 boncuklar kullanın.Amino asit ekstraksiyonu için, her kolonu yaklaşık olarak kolon yüksekliğinin üçte birine kadar doldurun. Örnek halihazırda nötr pH değerindeyse, AG one kolonuna uygulanmadan önce örneğe hiçbir şey eklenmez. Amino asitleri ekstrakte etmek için organik asitleri ekstrakte etmek amacıyla, örneği AG 50 kolonuna uygulamadan önce örneğe bir mililitre 0.1 normal hidroklorik asit ekleyin.Şimdi, önceden hazırlanmış nötralize edilmiş örnekleri her bir kolona uygulayın. Yıkama işlemleri nötr olana kadar her bir kolonu su ile 10 kez yıkayın. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, her bir kolonu etiketlenmiş taze dört mililitrelik cam örnek şişelerine elüye edin. Organik asit ekstraksiyonu için AG 1 kolonuna üç mililitre üç normal hidroklorik asit ekleyin.Bu durum, üç karbonlu türler, dört karbonlu türler, beş karbonlu türler ve altı karbonlu türler arasındaki toplam işaretli karbon sayısındaki izotop zenginleşmesinin analizine olanak tanır. Amino asit ekstraksiyonu için, G 50 kolonuna üç mililitre dört normal amonyum hidroksit ekleyin. Bu durum, üç karbonlu türler ve beş karbonlu türler arasındaki toplam işaretli karbon sayısındaki izotop zenginleşmesinin analizine olanak tanır.Hem organik asit hem de amino asit ekstraksiyonları tamamlandığında, numune tüplerini kuruyana kadar gece boyunca bir reaktif app üç evaporatöre yerleştirin. Numuneler daha sonra Protokol metninde ayrıntıları verildiği üzere türevlendirilmiş ve GCMS ile analiz edilmiştir. Bu prosedüre, bin adet genç yetişkin solucanı, evrensel olarak etiketlenmiş karbon 13 glukoz ve e coli içeren deneysel 35 milimetrelik bir NGM agri plakasına aktararak başlayın.Ardından, kapağı açık olan deneysel NGM plakasını yerleştirin. Hassas atmosfer örneği alımı ve değişimi sağlamak için sızdırmaz bir üç yollu muslukla donatılmış özel bir cam hazne kullanın. Optik olarak şeffaf cam diskin plaka üzerine oturduğu sızdırmazlık bölgesini yüksek vakum gresi ile kaplayın.Hazneyi cam disk ile mühürleyin. Saati kaydedin. Sıfırıncı an olarak, 30 dakika sonra, üç yollu musluk vasıtasıyla cam haznedeki atmosferden 10 mililitre örnek almak için 20 mililitrelik bir şırınga kullanın.Hazerine giden musluğu kapatın. Örnekleme yaptıktan sonra, örneği 0,1 molar sodyum hidroksit içinde bir mililitre sodyum bikarbonat içeren kırmızı kapaklı vakumlu cam tüpe aktarın. Ardından, üç yollu musluk aracılığıyla cam hazneye 10 mililitre hava enjekte edin. 20 mililitrelik bir şırınga kullanarak hazneye giden musluğu kapatın. Atmosferi yeniden enjekte ettikten sonra ve inkübasyona devam etmeden önce; 60, 90 ve 120. dakikalarda cam hazneden atmosfer örneklemesini tekrarlayın.Protokol metninde açıklandığı üzere, bu atmosferik karbondioksit örneklerini bir gaz oran kütle spektrometresi kullanarak işaretli karbon zenginleşmesi açısından analiz edin; burada, canlı veya UV ile ışınlanarak öldürülmüş OP 50 e coli ile beslenen solucanlardaki çözünmüş solucan karbondioksitinde ve atmosferik karbondioksitte ölçülen işaretli karbonla kanıtlandığı üzere, stabil izotoplar iki saat sonra genç yetişkin solucanlara iyice dahil olmuştur. Karbon 13 karbondioksitin karbon 12 karbondioksite oranı, salınan atmosferik karbondioksite kıyasla çözünmüş solucan karbondioksit fraksiyonunda daha yüksekti. Larval dönemden itibaren bir stabil izotopa uzun süreli maruz kalmanın ve ardından solucanların bakteri içermeyen NGM ağartma ortamında temizlenmesinin, genç yetişkin solucanlardaki serbest glutamatın izotopik zenginleşmesini artırdığı gözlemlenmiştir.Bu grafikte, L1, L1 larva evresinden 959 hücreli genç erişkin evresine kadar evrensel olarak işaretlenmiş karbon 13 glikoz ve OP 50 bakterileri ile beslenen solucanları temsil eder; YA ise yumurtlama evresinin ilk gününe ulaştıkları andan itibaren 48 saat boyunca karbon 13 glikoz ve OP 50 bakterileri ile beslenen solucanları temsil eder. X ekseni, her bir glutamat türündeki toplam işaretli karbon atomu sayısını, Y ekseni ise yüzde zenginleşmeyi göstermektedir. Tüm hayvanlar, sonraki numune hazırlama işlemleri öncesinde fazla izotopik etiketten arındırılmıştır.GCMS analizleri için yeşil çubuklar, PCA ekstraksiyonundan önce iki saat boyunca NGM plaklarında OP 50 E coli ile beslenerek izotopik maruziyete tabi tutulan ve ardından temizlenen solucanları göstermektedir. Mavi ve gri çubuklar ise izotopik maruziyet süresinden bağımsız olarak, PCA ekstraksiyonundan önce sırasıyla iki veya altı saat boyunca bakteri içermeyen NGM plaklarında izotopik maruziyete tabi tutulan ve ardından temizlenen solucanları göstermektedir. Hayvanlar plaklarda iki veya altı saat boyunca temizlendiğinde, ara metabolitlerdeki izotopik zenginleşmede anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir.Her iki izotopik maruziyet sürecinde, hayvanlar iki saat boyunca işaretlenmemiş bakterilerle beslenerek temizlendiğinde, ara metabolitlerde daha düşük izotopik zenginleşme gözlemlenmiştir. Bu nedenle, bakteriyel yayma yapılmış izotop içeren N GM plaklarında büyütülen solucanlar için ara metabolitlerdeki yüzde zenginleşmeyi optimize etmek adına, en uygun temizleme protokolünün yayma yapılmamış NGM plaklarında iki saatlik temizleme olduğu belirlenmiştir. Bakterisiz ortamda, sıvı kültürde yirmi dört saat boyunca tek bir altı karbon 13 glikoz ile tedavi uygulandıktan sonra.Bu şekilde gösterildiği üzere, yalnızca sonikasyonla veya sonikasyon artı öğütme ile parçalanan solucan örneklerinin bir karşılaştırması yapılmıştır. Sonikasyon artı öğütme ile parçalanan solucanlar, yalnızca sonikasyonla parçalanan örneklere göre daha yüksek izotopik zenginleşmeye sahipti; sonuç olarak canlı solucanlar, ya plakalar üzerinde L1 evresinden itibaren gelişim sırasında ya da genç yetişkinler olarak sıvı kültürde yumurtlama gününden itibaren 24 saat boyunca kararlı bir izotopik öncü ile beslenmiştir. Bu yöntem, glikoliz ve trikarboksilik asit Döngüsü'ndeki piruvat metabolizması üzerinden gerçekleşen akışı belirten metabolitler arasındaki izotopik zenginleşmenin hassas analizine olanak tanır.Bu teknik, C. elegans'ta ara metabolik akışın araştırılması için mitokondriyal hastalık araştırmalarına zemin hazırlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, nematodlar olan C. elegans'ta ara metabolizmanın ve metabolik akışın kararlı izotopik profillemesinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

stable-isotopic-profiling-intermediary-metabolic-flux-developing

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Biz eğitim için sağlam biyokimyasal ve mikroskobik yöntemler...

Fat Kütle Biyokimyasal ve Yüksek Verimli Mikroskobik Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

Protein homeostazı, stres ve yaşlanma arasındaki ilişkiyi incelemek için, genetik olarak izlenebilir metazoan Caenorhabditis elegans'ı model sistem olarak kullanarak, protein disfonksiyonunu, hücredeki protein lokalizasyonunu ve organizma, hücresel ve protein seviyelerinde protein stabilitesini takip ederek protein katlanmasındaki değişiklikleri izledik.

Caenorhabditis elegans'ın Çok Hücreli Bir Organizmada Protein Homeostazını İncelemek için Model Sistem Olarak Kullanılması

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ın embriyonik uzamasının erken ve geç aşamalarında meydana gelen morfojenik kusurları izlemek için özel olarak tasarlanmış protokolleri detaylandırıyoruz. Sonuç olarak, bu protokoller, bu fazları düzenleyen genleri tanımlamak ve embriyonun antero-arka ekseni boyunca diferansiyel gereksinimlerini karakterize etmek için tasarlanmıştır.

Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Değiştirilmiş küçük ölçekli çıkarma ve laktat ve Yuvarlak solucanlar pyruvate Renkölçer deneyleri tarif C. elegans. Ticari tahlil kitleri kullanarak, teknik geliştirme hassasiyet ve doğruluk önemlidir. Ayıklama protein yağış hücre içi metabolitleri kantitatif tayini için en önemli adımdır.

Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

Bu iletişim kuralı bir yöntem Caenorhabditis elegans büyük ölçekli ekimi için katı medyada açıklar. Sıvı kültür alternatif, bu protokol parametreleri farklı ölçeklerde plaka tabanlı ekilen almak sağlanır. Bu sonuçlar karşılaştırılabilir sıvı ve katı Medya kültürü arasındaki morfolojik ve metabolik farklar ihmal olarak artırır.

Large-scale tarımı plaka tabanlı Caenorhabditis elegans: diyabet metabolik değişiklikler çalışma için numune hazırlama

Mitokondrial solunum organizmalar hayatta kalmak için önemlidir; Bu nedenle, oksijen tüketim oranını mitokondrial sağlık mükemmel bir göstergesidir. Bu iletişim kuralı, Bazal ölçmek için piyasada bulunan bir respirometer nasıl kullanılacağını açıklar ve maksimal oksijen tüketimi oranlarında yaşa, sağlam ve serbestçe hareketli Caenorhabditis elegans.

Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü

Proteostatik düşüş, nörodejeneratif hastalıkların başlangıcını kolaylaştıran yaşlanmanın ayırt edici bir özelliğidir. İki farklı Caenorhabditis elegans dokularındaki proteostazları, floresan bir muhabire kaynaşmış poliglutamin tekrarlarının heterolog ifadesiyle ölçülebilir bir şekilde ölçmek için bir protokol özetliyoruz. Bu model proteostazın hızlı in vivo genetik analizine izin verir.

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

Bu çalışma, C. elegans complex I hastalığı gaz-1(fc21)solucanlarında, yani ZebraLab (orta verimli bir test) ve WormScan'da (yüksek verimli bir test) iki yarı otomatik lokomotor aktivite analizi yaklaşımı için protokoller sunar ve nematod davranışını ve entegre nöromüsküler işlevi ölçmek için çok çeşitli araştırma yöntemleri arasında karşılaştırmalı analiz sağlar.

Caenorhabditis elegans Mitokondriyal Hastalık Modellerinde Hayvan Aktivitesini Ölçmek için Deneysel Yöntemlerin Karşılaştırmalı Analizi

Caenorhabditis elegans , konakçı-mikrobiyom etkileşimlerini yönlendiren moleküler belirleyicileri incelemek için güçlü bir modeldir. C. elegans fizyolojisinin temel yönleriyle birlikte bağırsak mikrobiyom kolonizasyonunun tek hayvan seviyelerinin profilini çıkaran yüksek verimli bir boru hattı sunuyoruz.

Caenorhabditis elegans Bağırsak Mikrobiyomunun Miktar Tayini ve Analizi için Akış Vermimetrisinin Uygulanması

Bu protokol, sıvı kültürdeki bakterilerin klirensinin ölçülmesine dayalı olarak Caenorhabditis elegans besleme hızını ölçmek için bir testi tanımlar.

Bakteriyel Klerensi Ölçerek Caenorhabditis elegans'ta Gıda Alımının Ölçülmesi

Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta stabil izotopik profilleme ve metabolik akı analizi yöntemini. Bu teknik, genetik ve farmakolojik değişiklikleri nicelendirmek için canlı nematodlarda izotop zenginleştirmesini ölçer.

Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans

Daha fazla video keşfet