Embriyoid Kuruluşlar Cryosections kullanarak Pluripotent Kök Hücre Analizi
8 Aralık 2010
Pluripotent kök hücreleri süspansiyon büyüyen embriyoid organları (EBS) farklılaşırlar. Agrega olarak organizasyon korurken, embriyogenez hücresel ve moleküler yönlerini çalışmak için yararlıdır, yüksek kaliteli EB cryosections elde etmek için nasıl göstermek.
Birinci Bölüm, Giriş. Merhaba, benim adım Rafael. Brezilya'daki Rio de Janeiro Federal Üniversitesi'nde Profesör Stevens Hans Laboratuvarı'nda doktora sonrası araştırmacıyım.
Merhaba, benim adım İsmail. Araştırma görevlisiyim, aynı zamanda profesörüm. Bu videoda, Android gövdelerinin net bölümlerinin nasıl hazırlanacağını göstereceğiz.
Öyleyse başlayalım. İkinci bölüm, malzeme ve ekipman. Bu prosedür için, donmuş numuneler için bir gömme ortamına ihtiyacımız olacak.
Hücrelerin sabitlenmesi için% 4 paraform aldehit çözeltisi, kriyo koruması için sükroz çözeltileri. Hafifçe bükülmüş uçlu bir iğne, EBS'nin daha iyi görselleştirilmesi için bir stereo mikroskop ve bir çalkalayıcı. Üçüncü bölüm.
Burada insan embriyo cisimleri, yapışık olmayan kültür plakalarında kültürlenmektedir. Bir pipet kullanarak, tüm embriyo cisimlerini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için mümkün olduğunca birbirine yakın gruplandırıyoruz. EBS dikkatlice toplanır ve tüpe aktarılır.
Çok miktarda materyal olmadığı için tüm ebs'lerin toplanması önemlidir EBS boşaltıldıktan sonra, kültür ortamı dikkatli bir şekilde atılır. Tüpün altındaki peleti görebilmelisiniz. Şimdi sabitleme prosedürüne geçebiliriz.
EBS, PBS veya fosfat tamponlu salin içinde% 4 Paraform aldehit çözeltisi içinde sabitlenecektir. Peletin PFA çözeltisi ile yeniden süspanse edilmesi önemlidir. EBS daha sonra 30 dakika boyunca fiksasyon çözeltisinde sabitlenir.
Fiksasyonun ardından, PFA çözeltisi dikkatlice çıkarılır. Resus'un EBS'yi askıya almasını ve ebs'nin kriyo korumasını başlatmak için PBS'de% 10'luk bir sükroz çözeltisi ile değiştirilmesini önlemeye özen göstererek, malzeme bu çözeltide 30 dakika tutulur. Daha sonra,% 10 sükroz çözeltisini dikkatlice çıkarırız ve EBS'yi% 20'lik bir sükroz çözeltisi içinde yeniden süspanse ederiz.
Bir kez daha, EBS bu çözümde 30 dakika boyunca tutulur. Son olarak,% 20 sükroz çözeltisi çıkarılır ve PBS'de% 30'luk bir sükroz çözeltisi ile değiştirilir ve burada 30 dakika daha tutulur. Şimdi ebs'nin yönlendirilmesine ve engellenmesine geçebiliriz.
Laboratuvarımızda kalıp olarak boş kapsül kabukları kullanıyoruz. Ebs'in bloke edilmesi için, ebs'leri toplamadan önce ucun iç duvarlarını sükroz çözeltisi ile kaplamak önemlidir. Artık EBS'yi dikkatlice toplayabilir ve ucun dibine kadar düşene kadar bekleyebiliriz.
Ardından, EBS bloğun ortasına yerleştirilir. Bu, EBS'nin blok içindeki son konumu olmalıdır. Stereo mikroskop ve ince bir uç yardımıyla, mümkün olduğu kadar çok sakaroz çözeltisi toplar ve boşaltırız.
Her zaman ebs'i toplamamaya özen gösterin. Hafifçe bükülmüş uçlu bir iğne kullanılarak, tüm EBS bloğun ortasına yerleştirilir. Son olarak, kalan sükroz çözeltisi filtre kağıdı parçaları ile toplanır.
EBS'nin blok içindeki özel konumu, kaliteli dilimler elde etmek için çok önemlidir. İşte kabuğun içindeki zayıf EB konumlandırmasına bir örnek. EBS'nin yerleştirilmesini ve sükroz çözeltisinin uzaklaştırılmasını takiben, kabuk kenarlardan başlayarak OCT ile doldurulur ve her zaman Resus'un ebs'yi askıya almasını önlemeye özen gösterilir.
Kalan kabarcıklar bir pipet kullanılarak çıkarılır ve kabuklar 15 dakika çalkalanır. Ajitasyonun ardından. OCT bloğu kuru buzda dondurulur.
Bu noktada, daha fazla analiz için alüminyum folyoya sarılmış bloğu eksi 80 santigrat derecede saklayabilir veya kriyostat Dördüncü Bölüm olan Kesme'ye geçebilirsiniz. Kriyo bölümlerini yapmak için tek kullanımlık veya kalıcı bir bıçağa, OCT ve poli L lizin ön işleme tabi tutulmuş cam slaytlara ihtiyacınız olacaktır. OCT bloğu dondurucudan çıkarılır ve eksi 20 santigrat dereceye ulaşana kadar kriyostatın içinde tutulur.
Blok daha sonra stand üzerine yerleştirilir ve Bıçağın kenarına paralel olarak hizalanır. EB numuneleri diğer doku numunelerinin çoğundan çok daha küçüktür, bu nedenle bloğun tüm yüzeyinin aynı anda bıçağa temas ettiğinden emin olmak ve böylece malzeme kaybını en aza indirmek çok önemlidir. Yerleştirildikten sonra, blok 10 mikrometrelik dilimler halinde kesilir ve bunlar doğrudan cam slaytlar üzerinde toplanır.
Slaytlar, tercihen eksi 70 santigrat derecede saklanabilir veya aynı gün içinde de kullanılabilir. Materyal immünohistokimya veya immünofloresan için boyanabilir. Son. Burada tarif edilen yöntem, hem insan H dokuz hem de fare US P one kök hücre soylarından geliştirilen embriyo cisimlerinin ince kriyostat kesitlerini elde etmek için oldukça ucuz ve takip etmesi kolay bir protokol sağlar.
Elde edilen kriyo kesitleri, protein ekspresyonunu veya EB morfolojisini analiz etmek için çok çeşitli prosedürlerde kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, süspansiyon kültüründe yetiştirilen pluripotent kök hücrelerden elde edilen embriyoid bedenlerin (EB) yüksek kaliteli kriyoseksiyonu alma sürecini gösterir. Bu kriyoseksiyonlarla, embriyogenezin hücresel ve moleküler yönlerini incelerken, EB'lerin organizasyonunu korumak mümkündür.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kök Hücre Biyolojisi
- Embriyogenez
- Hücresel Farklılaşma
Arka Plan
- Pluripotent kök hücreler çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilir.
- Embriyoid bedenler erken embriyonik gelişimi taklit eden agregatlardır.
- EB'leri incelemek, embriyogenez mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.
- Yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarla detaylı analiz yapmak mümkündür.
Çalışmanın Amacı
- EB'lerden kriyoseksiyonu hazırlamak için bir yöntem sunmak.
- Farklılaşma sırasındaki hücresel ve moleküler süreçleri incelemeyi kolaylaştırmak.
- Analizde EB'lerin yapısal organizasyonunu korumak.
Kullanılan Yöntemler
- Süspansiyon kültüründe pluripotent kök hücrelerin hazırlanması.
- Embriyoid bedenlere farklılaştırma indüksiyonu.
- Yüksek kaliteli örnekler elde etmek için kriyoseksiyonlaştırma teknikleri.
- EB'lerin hücresel ve moleküler özelliklerinin analizi.
Ana Sonuçlar
- EB'lerden kriyoseksiyonlarla başarılı bir şekilde hazırlanma.
- Kriyoseksiyonlarda EB organizasyonunun korunması.
- Hücresel düzeyde embriyogenez çalışmalarında gelişmiş yetenekler.
- Gösterilen yöntemin çeşitli araştırma bağlamlarına uygulanabilirliği.
Sonuçlar
- Yöntem, EB'lerin detaylı analizini mümkün kılar.
- Yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarla embriyonik çalışmalar için değerlidir.
- Bu yaklaşım, kök hücre farklılaşmasının anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
High-quality cryosectioning of embryoid bodies (EBs) derived from pluripotent stem cells enables precise spatial analysis of differentiation markers and tissue organization, supporting early discovery and target validation in regenerative medicine and developmental biology. This capability enhances predictive confidence in stem cell-based models and informs risk-adjusted decisions at key inflection points in the discovery pipeline. Reliable EB cryosections facilitate cross-functional data integration for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of pluripotency and lineage-specific marker expression within three-dimensional EB structures.
- Supports biological de-risking by clarifying differentiation pathways and cellular heterogeneity.
- Provides spatial context for functional target validation in stem cell-derived systems.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized EB cryosections for reproducible immunofluorescence and in situ hybridization assays.
- Enables quantitative assessment of protein and RNA distribution across EB sections.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound screening in stem cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro differentiation with in vivo developmental processes for disease-relevant modeling.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by preserving EB architecture and marker localization.
- Provides mechanistic insights that inform translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This cryosectioning method integrates into the discovery continuum from early stem cell differentiation studies through assay development and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pluripotency and lineage commitment within EBs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for marker expression and tissue organization.
- Analytics: Enables spatially resolved measurements for comparative analysis of differentiation conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo developmental relevance when supported by marker expression patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for EB analysis applicable across multiple stem cell lines and differentiation protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell differentiation and target validation.
- Operational Value: Standardizes EB sectioning for reproducible downstream analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust spatial and molecular data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning and handling of delicate three-dimensional cell aggregates.
- Needs access to cryostats, embedding media, and imaging infrastructure for downstream analysis.
- Demands cross-team standardization of EB preparation and sectioning protocols.
- Adaptable to various pluripotent stem cell lines and differentiation models with attention to EB size and morphology.
- Dependent on careful orientation and embedding to ensure high-quality, interpretable sections.
