Embriyoid Kuruluşlar Cryosections kullanarak Pluripotent Kök Hücre Analizi

Birinci Bölüm, Giriş. Merhaba, benim adım Rafael. Brezilya'daki Rio de Janeiro Federal Üniversitesi'nde Profesör Stevens Hans Laboratuvarı'nda doktora sonrası araştırmacıyım.

Merhaba, benim adım İsmail. Araştırma görevlisiyim, aynı zamanda profesörüm. Bu videoda, Android gövdelerinin net bölümlerinin nasıl hazırlanacağını göstereceğiz.

Öyleyse başlayalım. İkinci bölüm, malzeme ve ekipman. Bu prosedür için, donmuş numuneler için bir gömme ortamına ihtiyacımız olacak.

Hücrelerin sabitlenmesi için% 4 paraform aldehit çözeltisi, kriyo koruması için sükroz çözeltileri. Hafifçe bükülmüş uçlu bir iğne, EBS'nin daha iyi görselleştirilmesi için bir stereo mikroskop ve bir çalkalayıcı. Üçüncü bölüm.

Burada insan embriyo cisimleri, yapışık olmayan kültür plakalarında kültürlenmektedir. Bir pipet kullanarak, tüm embriyo cisimlerini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için mümkün olduğunca birbirine yakın gruplandırıyoruz. EBS dikkatlice toplanır ve tüpe aktarılır.

Çok miktarda materyal olmadığı için tüm ebs'lerin toplanması önemlidir EBS boşaltıldıktan sonra, kültür ortamı dikkatli bir şekilde atılır. Tüpün altındaki peleti görebilmelisiniz. Şimdi sabitleme prosedürüne geçebiliriz.

EBS, PBS veya fosfat tamponlu salin içinde% 4 Paraform aldehit çözeltisi içinde sabitlenecektir. Peletin PFA çözeltisi ile yeniden süspanse edilmesi önemlidir. EBS daha sonra 30 dakika boyunca fiksasyon çözeltisinde sabitlenir.

Fiksasyonun ardından, PFA çözeltisi dikkatlice çıkarılır. Resus'un EBS'yi askıya almasını ve ebs'nin kriyo korumasını başlatmak için PBS'de% 10'luk bir sükroz çözeltisi ile değiştirilmesini önlemeye özen göstererek, malzeme bu çözeltide 30 dakika tutulur. Daha sonra,% 10 sükroz çözeltisini dikkatlice çıkarırız ve EBS'yi% 20'lik bir sükroz çözeltisi içinde yeniden süspanse ederiz.

Bir kez daha, EBS bu çözümde 30 dakika boyunca tutulur. Son olarak,% 20 sükroz çözeltisi çıkarılır ve PBS'de% 30'luk bir sükroz çözeltisi ile değiştirilir ve burada 30 dakika daha tutulur. Şimdi ebs'nin yönlendirilmesine ve engellenmesine geçebiliriz.

Laboratuvarımızda kalıp olarak boş kapsül kabukları kullanıyoruz. Ebs'in bloke edilmesi için, ebs'leri toplamadan önce ucun iç duvarlarını sükroz çözeltisi ile kaplamak önemlidir. Artık EBS'yi dikkatlice toplayabilir ve ucun dibine kadar düşene kadar bekleyebiliriz.

Ardından, EBS bloğun ortasına yerleştirilir. Bu, EBS'nin blok içindeki son konumu olmalıdır. Stereo mikroskop ve ince bir uç yardımıyla, mümkün olduğu kadar çok sakaroz çözeltisi toplar ve boşaltırız.

Her zaman ebs'i toplamamaya özen gösterin. Hafifçe bükülmüş uçlu bir iğne kullanılarak, tüm EBS bloğun ortasına yerleştirilir. Son olarak, kalan sükroz çözeltisi filtre kağıdı parçaları ile toplanır.

EBS'nin blok içindeki özel konumu, kaliteli dilimler elde etmek için çok önemlidir. İşte kabuğun içindeki zayıf EB konumlandırmasına bir örnek. EBS'nin yerleştirilmesini ve sükroz çözeltisinin uzaklaştırılmasını takiben, kabuk kenarlardan başlayarak OCT ile doldurulur ve her zaman Resus'un ebs'yi askıya almasını önlemeye özen gösterilir.

Kalan kabarcıklar bir pipet kullanılarak çıkarılır ve kabuklar 15 dakika çalkalanır. Ajitasyonun ardından. OCT bloğu kuru buzda dondurulur.

Bu noktada, daha fazla analiz için alüminyum folyoya sarılmış bloğu eksi 80 santigrat derecede saklayabilir veya kriyostat Dördüncü Bölüm olan Kesme'ye geçebilirsiniz. Kriyo bölümlerini yapmak için tek kullanımlık veya kalıcı bir bıçağa, OCT ve poli L lizin ön işleme tabi tutulmuş cam slaytlara ihtiyacınız olacaktır. OCT bloğu dondurucudan çıkarılır ve eksi 20 santigrat dereceye ulaşana kadar kriyostatın içinde tutulur.

Blok daha sonra stand üzerine yerleştirilir ve Bıçağın kenarına paralel olarak hizalanır. EB numuneleri diğer doku numunelerinin çoğundan çok daha küçüktür, bu nedenle bloğun tüm yüzeyinin aynı anda bıçağa temas ettiğinden emin olmak ve böylece malzeme kaybını en aza indirmek çok önemlidir. Yerleştirildikten sonra, blok 10 mikrometrelik dilimler halinde kesilir ve bunlar doğrudan cam slaytlar üzerinde toplanır.

Slaytlar, tercihen eksi 70 santigrat derecede saklanabilir veya aynı gün içinde de kullanılabilir. Materyal immünohistokimya veya immünofloresan için boyanabilir. Son. Burada tarif edilen yöntem, hem insan H dokuz hem de fare US P one kök hücre soylarından geliştirilen embriyo cisimlerinin ince kriyostat kesitlerini elde etmek için oldukça ucuz ve takip etmesi kolay bir protokol sağlar.

Elde edilen kriyo kesitleri, protein ekspresyonunu veya EB morfolojisini analiz etmek için çok çeşitli prosedürlerde kullanılabilir.