Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

Bu protokolün genel amacı, fare preimplantasyon embriyolarında protein seviyelerini in situ olarak ölçmektir. Dolayısıyla bu yöntem, tek hücre çözünürlüğüne sahip konfokal mikroskopi görüntülerinin yarı otomatik bir şekilde yüksek verimli analizini yapmamızı sağlar. Bu yöntem, yüksek nükleer yoğunluğun olduğu konfokal görüntülerde ve hücre popülasyonları içindeki heterojenlikleri incelemek istediğinde protein konsantrasyonlarını ölçmek için kullanılabilir.

Başlamak için, uçta bir kılcal uç çizmek için bir cam pastör pipeti üzerinde açık alev kullanın. Kör bir uç oluştururken kırmak için pipetin uzak ucunu kılcal damara nazikçe sürtün. İstenen embriyonik gelişim gününde hamile bir dişi fareyi kurban ettikten sonra, karın iç organlarını metin protokolüne göre ortaya çıkarın ve uterusu bulun.

Servikal ucu tutun, rahim ağzını kesin ve her iki rahim boynuzunu germek için yavaşça yukarı çekin. Rahim duvarını delmemeye dikkat ederek yağı ondan kesin. Tüm uterusu serbest bırakmak için yumurta kanallarının üstünü, yumurtalıkların altını kesin ve bir petri kabına yerleştirin.

Daha sonra, uterusu PBS ile örtün ve serviksin her iki tarafındaki proksimal ucu keserek her iki uterus boynuzunu ayırın. Daha sonra her bir yumurta kanalını, onları birbirine bağlayan kıstağın altından keserek uterustan ayırın. Diseksiyon mikroskobu altında, servikal açıklıktan her boynuzdan 0.5-1 mL ortamı zorlayarak blastosistleri uterustan ve manipülasyon ortamına atmak için hipodermik iğneli bir mL şırınga kullanın.

Yıkamadan sonra blastokistlerin tabağın dibine çökmesi için bir ila iki dakika kadar bekleyin. Daha sonra blastosistleri bulun ve kılcal uçlu ağız kontrollü cam pastör pipetini kullanarak blastosistleri toplayın ve taze bir besiyerine aktarın. Blastokistleri duruladıktan sonra, embriyoları kısaca yıkamak için Asidik Tyrode Solüsyonu kullanarak zona pellucida'yı çıkarın.

Zon artık görünmez hale gelir gelmez, blastosistleri manipülasyon ortamına geri aktarın. Blastokistleri oda sıcaklığında PBS'de yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de% 4 PFA'ya aktararak sabitleyin. Fiksasyondan sonra, blastokistleri dört santigrat derecede saklamak için PBS'ye geri aktarın.

Metin protokolüne göre imunofloresan işlemi gerçekleştirdikten sonra, 35 mm'lik cam tabanlı bir tabağın cam yüzeyine mikro damlalar PBS veya nükleer leke solüsyonu yapmak için ince ağızlı bir pipet kullanın ve üzerlerini mineral yağ ile kaplayın. Embriyoları mikro damlalara yerleştirin ve tercihen ICM boşluğu erişimi cam yüzeye paralel olacak şekilde tutarlı bir şekilde düzenleyin, ardından tabağı mikroskop tutucusuna yerleştirin. Konfokal görüntülemeyi gerçekleştirmek için, floroforları ağartmadan güçlü bir sinyal-gürültü oranı sağlayan en düşük lazer gücünü kullanın.

Örneği aşırı pozlamadan en geniş dinamik aralığı elde etmek için kazanç ve ofset ayarını yapın. Gri tonlama aralığının çoğunu veya tamamını yakalamak, görüntüler arasındaki küçük yoğunluk farklarının algılanmasını kolaylaştıracaktır. Tüm Z ekseni boyunca embriyoları görüntülemek için metin protokolünde belirtilen ek ayrıntıları izleyin.

Mikroskop tarafından oluşturulan konfokal bir görüntüyü veya tüm Z ham veri yığınını yüklemek için MATLAB tabanlı segmentasyon aracı Modüler Etkileşimli Nükleer Segmentasyonun veya MINS'in grafik kullanıcı arayüzünü takip edin. Her adımın sonucunu görüntülemek için ilgili Görünüm" düğmesini tıklayın. Düğmenin üzerindeki sarı etiket, işlemin devam ettiğini gösterir.

Yeşil bir etiket, işlemin tamamlandığını gösterir. Segmentasyona devam etmeden önce algılama adımının sonucunu değerlendirin. Tatmin edici değilse, algılama parametrelerini değiştirin ve yeniden çalıştırın.

Toplu Modu"çalıştır menüsünden, Dosya Ekle'ye tıklayın ve işlenecek tüm dosyaları bir kerede yükleyin. Toplu Modu Çalıştırmayı Başlat'ı tıklayın" ve yazılımın dosyaları işlemesi için zaman tanıyın. Segmentasyon çıktısı, orijinal dosyalarla aynı dizine kaydedilecektir.

Apoptotik veziküller veya sağlam çekirdek olmayan ancak MINS tarafından bu şekilde tanımlanmış olabilecek diğer elementler gibi yanlış pozitifleri tanımlayın. Yıldız istatistiklerinden yanlış pozitifler için ilgili kayıtları silin. CSV dosyası.

Orijinal starstatistics. csv dosyasını ileride başvurmak üzere saklayın ve yalnızca bir kopyasını düzenleyin. Bir çekirdek aşırı bölümlere ayrılmışsa ve iki veya daha fazla çekirdek olarak sunulmuşsa, ya yoğunluk seviyelerinin ortalamasını alarak kayıtları birleştirin ya da o hücre için kayıtlardan birini saklayın ve geri kalanını atın.

Segmentasyon altında çözmek için, MINS'in iki veya daha fazla çekirdek arasındaki sınırı tespit edemediği ve bunları tek bir çekirdek olarak segmentlere ayırdığı veya bir çekirdeği tamamen tespit edemediği olayları belirleyin. Bölümlere ayrılmış veya bölümlere ayrılmamış hücrelerdeki her kanal için ortalama gri seviyesini ölçmek için ImageJ'yi kullanın. Daha sonra, serbest seçim aracını kullanarak DNA kanalındaki alt veya segmentsiz çekirdeğin medial bir bölümünü bulun, alt veya segmentsiz çekirdeğin çevresini ana hatlarıyla belirtin.

Ardından, Control M'ye basın"veya Analiz Et" menüsüne gidin ve Ölç'ü seçin"Bu, belirtilen alan için ortalama gri değeri kaydedecek ve yeni bir pencerede gösterecektir. DNA kanalında az önce seçilen aynı ana hatları çizilen alanı kullanarak, ilgilenilen floresan kanallarının her birinin ölçümünü tekrarlayın. Sonuçlar, ölçüm sonuçları penceresinde bir öncekine yükseltilecektir.

Ardından, starstatistics. csv dosyasındaki hatalı kayıtları değiştirmek için elde edilen ölçümleri kullanın. Çekirdek alt bölümlere ayrılmışsa, satırını çoğaltın, her yeni hücreye farklı hücre kimlikleri atayın ve ImageJ'de elde edilen değerleri ilgili sütunun altına girin.

Bu durumda, her iki hücre de uzaysal koordinatları paylaşacaktır. Mitotik çekirdekler analizde ayrı ayrı ele alınacaksa, bunları manuel olarak puanlayın ve bilgileri veri dosyasına ekleyin. Ek görüntü işleme talimatları için metin protokolüne bakın.

Bu şekil, genişlemiş bir boşluğa sahip farklı aşamalarda sağlam blastosistlerin örneklerini göstermektedir. Burada, CDX2, GATA4, GATA6, NANOG ve OCT4 dahil olmak üzere bir dizi nükleer protein için iyi antikor örnekleri gösterilmiştir. Bu örnek, yüksek bir sinyal-gürültü oranı veren sitoplazmik protein DAB2 ile etiketlendi.

Bu panelde, numunelerin yalnızca 10 dakika boyunca sabitlendiği, düşük sinyal-gürültü oranına sahip GATA4 için kötü bir boyama örnekleri gösterilmektedir. Bu özel anti-GATA4 antikoru, güçlü bir sinyal sağlamak için gece boyunca fiksasyon gerektirir. Bu embriyolar, 1.30 NA ve 0.21 mm çalışma mesafesi ile 40x yağa daldırma objektifi ile görüntülendi Orta paneller, ICM'lerin veya tek tek çekirdeklerin büyütmelerini gösterir ve aralarındaki sınır ayırt edilebilir.

Alt paneller, embriyo ne kadar gelişmiş olursa, nükleer yoğunluğun o kadar yüksek olduğunu ve dolayısıyla segmentasyon hataları olasılığının ne kadar yüksek olduğunu gösterir. Bu görüntüler, apoptotik çekirdeklerin canlı hücreler olarak algılanması, aşırı segmentasyon veya segmentasyon altında olması gibi MINS'in işleyebileceği hataları gösterir. Bu Z dilimleri dizisi, iki hücrenin tek olarak tanımlandığı bir segmentasyon altı olayını ortaya çıkarır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol günde iki ila dört saatlik bir zaman yükü ile baştan sona üç ila dört gün içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, deney koşullarıyla, yani immünofloresan protokolleri ve görüntüleme parametreleriyle çok tutarlı olmayı unutmamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, fare gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların, tek hücrelerde gen ve protein ekspresyonunun yerinde kantitatif analizini yapmalarının yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, kantitatif yerinde ifade analizi için uygun görüntü verilerinin nasıl elde edileceğini iyi anlayacaksınız.