Ezilme yaralanmasını takiben bir farenin siyatik sinirinde aksonal rejenerasyon

Bir fareden izole edilen siyatik sinir ile başlayın.

Sinir içindeki nöronlar, floresan sitoplazmik proteinleri eksprese etmek için transfekte edildi.

Sinir, bir dikişle işaretlenmiş bir yaralanmaya neden olmak için ezildi.

Bölgedeki yaralı akson segmentleri dejenere olur ve işe alınan makrofajlar kalıntıları temizler.

Schwann hücreleri, yol gösterici izler oluşturmak ve aksonların yeniden büyümesini teşvik eden nörotrofik faktörleri salgılamak için çoğalır. Aksonlar bu yollar boyunca uzanır ve siniri yeniler.

Hücresel yapıları korumak için siniri sabitleyin, ardından bağlı nöronal olmayan dokuları çıkarın.

Artık fiksatifleri ortadan kaldırmak için bir tamponla yıkayın.

Siniri bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin, bir montaj ortamı uygulayın ve bir lamel yerleştirin.

Aksonları görüntüleme için aynı odak düzlemi içinde konumlandırmak için siniri düzleştirin.

Bir epifloresan mikroskobu kullanarak, rejenerasyon uzunluğunu ölçmek için aksonları ezilme bölgesinden distal uçlarına kadar izleyin

.

DRG'leri sinir kökleri ve siyatik sinir ile birlikte diseksiyon mikroskobu altında mikro makas ve mikro forseps ile dikkatlice ayırın.

Daha sonra siyatik siniri gece boyunca dört santigrat derecede doğrudan% 4 PFA'ya aktarın. Floresan işaretli duyusal aksonları diseksiyon mikroskobu altında görüntülemek ve ölçmek için, sabit siyatik sinir üzerindeki yapışık doku ve zarı mikro makas ve mikro forseps ile dikkatlice sıyırın. Ardından, siniri PBS ile üç kez yıkayın.

Ardından, siyatik siniri bir slayta yerleştirin ve düz tutun. Sinirin etrafına 80 mikrolitre anti-solma solüsyonu ekleyin, ardından üzerine bir örtü astarı koyun. Monte edilmiş tüm dokuyu basınçla düzleştirin.

Daha sonra, düzleştirilmiş dokuyu mozaik alımı ve görüntü işleme için bir aksesuarla donatılmış ters çevrilmiş epifloresan mikroskobun altına yerleştirin. Rejenere aksonların uzunluğunu ölçerken, siyatik sinirdeki tüm tanımlanabilir floresan etiketli aksonları ezilme bölgesinden distal akson uçlarına kadar izleyin.