Name: Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma Drosophila Larva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Öğrenin, Drosophila larvalarını canlı görüntüleme için mikroakışkan cihazla invaziv olmayan şekilde sabitleme yöntemini. Bu teknik, toksik anestezikler kullanmadan sinir rejenerasyonu ve aksonal taşıma süreçlerini gözlemlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma (CAC BY R00MH080599, NC R21 NS062313 ve NS069844) Ulusal Bilim Vakfı (hibe sayısı CAC IOS-0842701) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Biz teknik destek için James Schutt, Emily Han ve Leni Truong kabul etmek istiyorum, ve sinek hatları için Bloomington Stok merkezi olacaktır. Tüm cips Michigan Üniversitesi&#39;nde Lurie nanofabrication Tesisleri&#39;nde imal edildi.

1.. PDMS Chip yapma SU-8 kalıp bir PDMS çip yapmak için adımları 1.1-1.7 izleyin. Bir çip üzerinde-el olduğunu, ancak kullanımı için monte gerekiyorsa, 1.8 adıma atlayın. <ol><li> PDMS baz 45 g ve küçük tek kullanımlık plastik kap içinde bir PDMS kiti maddesi (10:1 oranı) kür 4.5 g karıştırın ve iyice bir plastik karıştırma sopa kullanarak karıştırın. </li><li> Herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için 10 dakika boyunca bir vakum kabı (örneğin bir kurutucu) &#39;de kap yerleştirin. </li><li> Çapında plastik bir kaba 150 mm altındaki SU-8 kalıp koyun ve yavaş yavaş, kalıp üzerindeki PDMS dökün. PDMS dökerken kabarcıkları üretmek için değil dikkat edin. </li><li> 4 saat boyunca 650 ° C&#39;de bir fırında (veya inkübatör) &#39;de PDMS Cure. </li><li> Fırından tedavi PDMS/SU-8 kalıp çıkarın ve birkaç dakika boyunca soğumaya bırakın. </li><li> Bir jilet kullanarak, SU-8 kalıp kenarı boyunca tedavi PDMS kesilmiş ve SU-8 kalıp ayırmak. </li><li> PDMS levha BölBir jilet kullanarak bireysel PDMS cips içine. </li><li> Bir 21 G iğne kullanılarak dağıtma, PDMS çipin (şekil 1A&#39;da gösterilen) vakum portu bir delik sokmak. </li><li> 23 G dağıtma iğne alın ve iğne kilit göbeğinden tüyo kırmak için kendi tabanından birkaç kez iğne ucu bükün. </li><li> Boru iğnenin en azından bir milimetre kapsar, böylece polietilen boru küçük bir parça halinde 23 G iğne ucu yerleştirin. Sonra uzakta iğne aşırı boru kesmek için jilet kullanın. Bu vakum giriş noktasına yerleştirildiğinde bir yalıtım oluşturur iğnenin bir ucunun etrafına plastik bir halka oluşturur. </li><li> Bir ters mikroskop (Şekil 1 B ve 2A-B) ile birlikte kullanım için: vakumlu port deliğine 23 G iğne ucu yerleştirin. Dik bir mikroskop (Şekil 1C ve 2C-D) ile kullanmak için: bir 21 G dağılma ile PDMS çipin yanı üzerindeki bir ikinci delik açmakİğneyi nsing, bu delik taraftan ilk delik erişim sağlayacaktır. Daha sonra, yan deliğe boru halka ile 23 G iğne ucu yerleştirin. En iyi delik (Şekil 1C) mühürlemek için PDMS çipin üst üzerinde çift taraflı bant bir parça yerleştirin. </li><li> Uzunluk olarak yaklaşık 20 cm olan polietilen bir boru parça al. Vakum portuna sokulur iğne ucu için boru bir tarafı bağlayın. </li><li> (Malzeme listede &#39;&#39;3-yollu valf bakınız), 3-yollu vana bağlantı noktalarından birine borunun diğer tarafında geç </li><li> Kalan iki girişlerinden birine bir 20 ml şırınga takın. Son liman çevreye açıktır. </li></ol> 2. Canlı Görüntüleme Larva Chip kullanma <ol><li> Şeffaf yapışkan bant ile PDMS çip temizleyin. Çipin altına bir parça bant takın. Emin bant tüm PDMS yüzeye temas olun ve sonra şeridi sıyırın. </li><li> Olmadığından emin olmak için yukarıdaki adımı 2-3x tekrarlayınPDMS çip yüzeyinde (önceki deneylerden elde tutulan) partiküller ya da herhangi bir yağ vardır. PDMS çip yeniden olduğu için, bu cam PDMS yapışma etkileyen ve yeterli bir sızdırmazlık neden gibi yağlı bir tortu çıkarmak çok önemlidir. </li><li> Su içeren bir Petri 3. larva evresindeki erken (yani yağmalama) aktarın. (Toplayıcı 3 instar evre larva ziyade kültür flakon tarafı daha, gıda vardır). Kültür ortamının kaldırmak için su içinde larvaları batırın. </li><li> Temiz bir cam lamel alın ve onun merkezinde Halokarbon 700 yağ küçük bir damla koyun. </li><li> Forseps kullanarak, hafifçe pick up temiz, (larva uzunluğu ~ 3,5-4 mm olmalıdır) sudan 3 instar larva erken düzenledi. Aşırı su çıkarmak ve ardından petrol damla yerleştirmek için hafif bir mendil veya kağıt havlu üzerine kısaca hayvan yerleştirin. Damla kadar küçük larvaların trakea kaplı olmayan şekilde olmalıdır. Larva sta izin10 saniye boyunca petrol damla y. </li><li> Petrol açılan larva çıkarın ve sonra temiz bir cam lamel üzerine yerleştirin. </li><li> Başka temiz bir cam lamel larva transferi. Bu adım, aşırı yağı temizler. </li><li> Larva yönüne dikkat edin. Nöral kord ve segmental sinirler görüntüleme için, larva ventral yüzü lamel oturmak gerekir. Iki boyuna trakeal tüpler ile karakterize olan dorsal yüzü, yukarı doğru bakmalıdır. Not: Bu larva doğal tercih yönlendirmedir. </li><li> Yavaşça larva üstüne PDMS çip yerleştirin. Larva vakum noktasına yönelik kuyruğu, microchamber merkezi ortasına aynı hizada olmalıdır. Larva odasının kenarlarına değmeyecek dikkatli olun. Bu ön ve arka trakeal terminalleri için özellikle önemlidir. Not: Bu adım en iyi bir stereo mikroskop altında yapılır. </li><li> Iyi bir sızdırmazlık elde etmek için cam lamel karşı PDMS çipi itin. Larva tamamen emin olunPDMS çip cam lamel dokunuyor microchamber tarafından eklenmiştir. </li><li> Şırınga bir vakum oluşturmak için (tüp yoluyla) PDMS microchamber hava çekmek için böyle üzerinde 3-yollu vanayı kapatın. </li><li> Tek bir el ile sıkıca PDMS çip / cam lamel tutun. Şırınga pistonu çekmek için diğer elinizi kullanın. Direnç vakum oluşturmak için, şırınga kolu hissedilir kadar, hava 2-2.5 ml çekin. Vakum PDMS çip, yağ ve lamel arayüzler arasında sıkı bir sızdırmazlık oluşturur ve larva hareketliliğini kısıtlar. </li><li> PDMS çip şırıngadan ve çevreden izole edilir, öyle ki kapatma vanasını açın. Sonuç olarak, nispeten kararlı bir vakum seviyesi, şırınga pistonu tutulması için gerek kalmadan microchamber korunur. </li><li> Tüm hayvan vücut microchamber içine yerleştirilir, ve hayvan hareketsiz olduğundan emin olmak için Stereoskop altında larva kontrol edin. Trakea görünür olmalıdır. Geri kalanıPDMS çip lamel ile temas halinde olmalıdır. Not: doğru çip hareketsiz hayvanların örnekleri için Şekil 2E ve 2F bakınız. Bazı yanlış yönelimleri Şekiller 2G ve 2H gösterilmiştir. </li><li> Mikroskop larva çip (yonga PDMS + cam lamel) yerleştirin. Larva çip, boru ve şırınga lamel PDMS çipin ayrılmasını önlemek için dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Dik bir mikroskop için, çift taraflı bant (Şekil 1C) ile mikroskop aşamasında çip &#39;üst&#39; tarafını düzeltmek. </li><li> Ilgi hayvanın yapısı (ler) bulmak ve görüntüleme gerçekleştirmek için yüksek büyütme hedefi (yağ daldırma, 40-63X tavsiye edilir) kullanın. Bazı durumlarda, daha düşük bir büyütme daha yüksek bir büyütmede geçmeden önce görüntüleme için arzu edilen bölgesini tespit etmek gerekli olabilir. </li><li> Görüntüleme işlemi tamamlandığında, pozisyonuna geçiş valfı tarafından yapılan vakum uygulaması durdurulurbu ortama açıktır. </li><li> Lamel PDMS çipi ayırın. Larva derhal hareketli olmalıdır. </li><li> Microchamber gelen larva kaldırmak ve yavaşça toparlanma için bir üzüm suyu agar plaka üzerinde larva yerleştirmek için forseps kullanın. </li></ol> 3. Larvaların segmental sinirler bir Sinir Crush Yaralanma Inducing <ol><li> Izole etmek için yukarıdaki adımı 2.3 izleyin erken istenen genotip 3. larva evresindeki düzenledi. Adım 2.3 &#39;de açıklandığı gibi gıda kaldırmak için suda larva yıkanmak. </li><li> CO ile, standart bir sinek CO 2 Anesthetization istasyonu kullanın 2 ped larvaları bastırmak için, bir diseksiyon stereomicroscope altında tuttu. Larva 1-2 dakika için CO 2 pad üzerinde yerleştirildikten sonra immotil haline gelmelidir. </li><li> Şimdi stereomicroscope altında bir üzüm suyu agar plaka üzerine tek bir anestezi larva yerleştirin. Ventral sinir kablosu görselleştirmek ve (manikür sinirler segmental kadar hayvan ventral tarafını çevirin <strong&gt; Şekil 3). Larva tamamen immotil olduğundan emin olun. </li><li> Dumostar sayı-5 forseps kullanarak, sıkı 5-10 saniye için manikür segmental sinirler çimdik. Bu doğru yapıldığında, manikür bozulmadan kalır ve vücut duvarı deldi değildir. Not: yaralanması, ön-arka gövde ekseni boyunca farklı pozisyonlarda yapılabilir sürece ventral sinir kablosu, tükürük bezleri, bağırsakların zarar değildir. Şekil 3B &#39;de gösterildiği gibi en etkili yaralanma konumu, 3. karın segment sonuna doğru yer alır. Bu konum zararların en sinirler de yaralanma ve hayvan öldürmeden çoğaltmak kolay değildir. </li><li> Yaralanma sonrası, hayvan çevirmek aşağı üzüm plaka üzerindeki ventral yüzü o kadar. Onun kafasını taşımak ve yemek gerekir. Yaralanma başarılı olursa, o zaman larva posterior yarısı felç olacak. </li><li> 25 de üzüm suyu agar plaka üzerinde yaralı hayvanları tutmak ve# 176; C deneysel amaca göre istenilen zaman için. Motonöronlar için, proksimal güdük yaralanma 14 8-10 saat içinde filiz başlar ve distal güdük 6-8 saat 15 içinde dejenere başlar. Sınıf IV da duyusal nöronlar için, proksimal güdük yaralanma sonrası 3-4 saat içinde dejenere için 4-6 saat, ve distal güdük başlangıç ​​içinde filiz başlar. Not: Uygun Gal4 sürücüleri ve floresan gazetecilere, filizlenme ve dejenerasyon (örneğin, bakınız Şekil 6) larva çip görülebilir. </li></ol>

<ol><li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li>
<li>Gunawardena, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li>
<li>Miller, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+demonstrates+that+Liprin-alpha+is+required+for+trafficking+of+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles.</a> Curr. Biol. 15, 684-689 (2005).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
<li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li>
<li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+site-specific+changes+of+glutamate+receptor+composition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo.</a> Nat. Neurosci. 11, 659-666 (2008).</li>
<li>Fuentes-Medel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+and+muscle+sculpt+neuromuscular+arbors+by+engulfing+destabilized+synaptic+boutons+and+shed+presynaptic+debris%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Glia and muscle sculpt neuromuscular arbors by engulfing destabilized synaptic boutons and shed presynaptic debris.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndlauer%2C+TF+%22Building+an+imaging+chamber+for+in+vivo+imaging+of+Drosophila+larvae%22">Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae</a>. , Cold Spring Harb. Protoc. 476-480 (2012).</li>
<li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+reduces+excitability+of+Drosophila+larval+motoneurons+by+activating+a+hyperpolarizing+leak+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance.</a> Anesthesiology. 108, 434-446 (2008).</li>
<li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+depresses+glutamate+release+by+reducing+neuronal+excitability+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction.</a> J. Physiol. 558, 489-502 (2004).</li>
<li>Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+vivo+neuronal+transport+in+genetic+model+organisms+using+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices.</a> Traffic. 12, 372-385 (2011).</li>
<li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chips+for+in+vivo+imaging+of+cellular+responses+to+neural+injury+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chips for in vivo imaging of cellular responses to neural injury in Drosophila larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li>
<li>Schmid, A., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuromuscular+junctions%3A+histology+and+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuromuscular junctions: histology and in vivo imaging.</a> Methods Mol. Biol. 420, 239-251 (2008).</li>
<li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+turnover+of+the+Wallenda%2FDLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).</li>
<li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda%2FDLK+MAP+kinase+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J. Neurosci. 32, 610-615 (2012).</li>
<li>Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Laser+Axotomy+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo Laser Axotomy in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li>
<li>Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+a+Low-budget+Laser+Axotomy+System+to+Study+Axon+Regeneration+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (57), (2011).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2.</a> 2, 2024-2032 (2007).</li>
<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).</li>
<li>Rao, S., Lang, C., Levitan, E. S., Deitcher, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+neuropeptide+expression%2C+transport%2C+and+exocytosis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Visualization of neuropeptide expression, transport, and exocytosis in Drosophila melanogaster.</a> J. Neurobiol. 49, 159-172 (2001).</li>
<li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even-skipped%2C+acting+as+a+repressor%2C+regulates+axonal+projections+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130, 5385-5400 (2003).</li>
<li>Rietdorf, J., Steitz, A., Heidelberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+unmixing+macro+for+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22European+Advanced+Light+Microscopy+Network%22%5BJournal%5D)">Linear unmixing macro for ImageJ.</a> European Advanced Light Microscopy Network. , (2004).</li>
<li>Koon, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulatory+and+paracrine+control+of+synaptic+and+behavioral+plasticity+by+octopaminergic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Autoregulatory and paracrine control of synaptic and behavioral plasticity by octopaminergic signaling.</a> Nat. Neurosci. 14, 190-199 (2011).</li>
<li>Yarali, A., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Neurogenetic+Dissociation+between+Punishment-%2C+Reward-%2C+and+Relief-Learning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Neurogenetic Dissociation between Punishment-, Reward-, and Relief-Learning in Drosophila.</a> Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).</li>
<li>Kuo, C. T., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrite-specific+remodeling+of+Drosophila+sensory+neurons+requires+matrix+metalloproteases%2C+ubiquitin-proteasome%2C+and+ecdysone+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dendrite-specific remodeling of Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteases, ubiquitin-proteasome, and ecdysone signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15230-15235 (2005).</li>
<li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Microfluidic+Devices+for+in+vivo+Imaging+of+C.+elegans%2C+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li>
<li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highwire+ubiquitin+ligase+promotes+axonal+degeneration+by+tuning+levels+of+nmnat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein.</a> PLoS Biol. 10, (2012).</li>
<li>Shin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74, 1015-1022 (2012).</li>
<li>Watkins, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLK+initiates+a+transcriptional+program+that+couples+apoptotic+and+regenerative+responses+to+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 4039-4044 (2013).</li>
<li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li>
<li>Guo, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), (2009).</li>
<li>Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+up-regulation+of+microtubule+dynamics+and+polarity+reversal+during+regeneration+of+an+axon+from+a+dendrite%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 767-777 (2010).</li>
<li>Miller, D. L., Ballard, S. L., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+synaptic+growth+and+function+in+Drosophila+with+an+extended+larval+stage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Analysis of synaptic growth and function in Drosophila with an extended larval stage.</a> J. Neurosci. 32, 13776-13786 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Yapma veya larva çip elde: Larva yonga, cam lamel bağlı bir PDMS bloğu (&#39;PDMS çip&#39; olarak adlandırılır) oluşur. 1. adımda protokol yapma ve larva çipleri kullanarak, bir SU-8 kalıp kullanılabilir olduğunu varsayarak için prosedür açıklanmaktadır. SU-8 kalıp photolithographically (ayrıntılar Ghannad-Rezaie vd. 12 bakınız) bir silikon yonga üzerinde bir 140 mikron kalınlığında SU-8 fotorezist tabaka desenlendirme tarafından mikrofabrike edilir. SU-8 kalıp mikroimalat özel ekipman erişimi gerektirir, biz bir mikroimalat tesisinden sipariş öneririz (örn.. Michigan 14 Üniversitesi LNF tesis), ya da onlara sağlanan yonga tasarımı göndererek dökümhaneden ek bir dosya olarak. On (farklı boyutlarda larvaları ile kullanım için, örneğin) PDMS yonga tasarımı, DXF dosya (örn. Autocad) kolları CAD yazılımı değiştirmek isterse de kullanılabilir. Bir SU-8 kalıp da Fernandes talimatı izleyerek içi yapılabilir vd. 27. Pek çok okuyucu bu elverişli sadece kendi cips imalatı önce tekniğini denemek için bir örnek PDMS çip elde etmek için bulabilirsiniz. Bu istek üzerine serbestçe sunulacaktır. Canlı görüntüleme için mikroakışkan &#39;larva çip&#39; Kullanımı: Larva chip bir hareketsizleştirme yöntemi, anestezik kullanımı önler, ve bunun yerine, hayvanın hareketi kısıtlamak için, bir vakumun uygulanması yoluyla, basınç içerir. Hayvanlar birkaç saat 12, daha kısa bir immobilizasyon bir süre (5-15 dakika) için çip immobilizasyon yaşayabilir da tavsiye edilir. Bu hücre içi kalsiyum değişikliklere veya hızlı aksonal taşıma gibi çok sayıda hücresel olayları, görüntüleme için yeterli zamanı. Bu, aynı zamanda lazer tabanlı mikrocerrahi, ağartmanın ve photoconver gibi canlı hayvan istenilen manipülasyonları için yeterli zamanısion. Uzunlamasına tek bir hayvanda daha uzun bir süre boyunca etkinliklerini inceleme için, hayvanlar dinlenme süreleri ile ayrılmış, bir kaç kez çip yerleştirilir ve görüntülenebilir. Bunlar kolay bir besin kaynağı ve nem sağlamak gibi üzüm suyu agar plakaları, görüntüleme oturumları arasında dinlenmek için idealdir. Her oturum (aşağıda, sorun giderme bölüm 2 bakınız) hayvan zarar için bazı risk taşır bu yana çoklu görüntüleme oturumları, bir dereceye kadar larva hayatta etkiler. Hayvanlar rutin olarak% 50&#39;den daha fazla hayatta kalma oranı, iki gün boyunca&gt; 5 kez görüntülenebilir. Hayvanlara anestezi olmadığı için, hemen çip vakumun serbest bırakılması sonrasında sağlıklı ve hareketli bulunmaktadır. Orada görüntüleme oturumları arasındaki geri kazanım süresine gerek bu nedenle, bu nedenle oturumları arasındaki zaman aralığı esnektir ve deney amaçları için ayarlanabilir. Sorun Giderme: En yaygın tekniklarva çip ve önerilen çözümler şunlardır ile mahkemeye verdi: (1) hayvan çok fazla hareket ediyor. Çok fazla hareketlilik görüntüleme hedefleri engelleyebilir. Larva chip bu için en yaygın nedeni a) Hayvan çip için yeterli değildir, veya b) hareketsiz hale getirme adımı sırasında uygulanan vakum basıncı tehlikeye bulunmaktadır. Erken 3. larva evresindeki sahnelenen için bu protokolü açıklanan larva çip tasarlanmıştır. Hayvan için en uygun boyutu (ön-arka ekseni boyunca) uzunluğunda 3.5-4 mm&#39;dir. Direnç kolu hissedilir kadar vakum basıncı yeterli olduğundan emin olmak için, şırınga 2-2.5 ml çekin, ya da. Vakum çalıştığından emin bir göstergesi çevre kanal küçük kabarcıklar vakum kaynağına doğru yavaşça hareket görülebilir olmasıdır. Başka bir göstergesi yonga (üstten kaldırıldığında lamel her çip ile seyahat gerektiğidir ve bu bölmeyi taşınması için önerilen bir yöntemdirlarva konumlandırılmış ve vakum) hakkında bir kez. Boru içinde çatlak varsa vakum tehlikeye olabilir veya yağ boru içinde ise. Bu kolayca (adımlarla 1,6-1,14 itibaren) iğne ucu ve polietilen-50 tüp dağıtım 23 G değiştirerek ele alınabilir. (2) Hayvan chip görüntüleme sonra ölür. Prosedür hayvana göre en az strese neden amaçlanmıştır ve vahşi tip genotip hayvanlar da çip 12 hareketsizleştirme bir saat sonra, bir&gt;% 90 hayatta kalma oranına sahip edilir. Bazı genotipleri çipin strese daha az esnek olabilir için, ilk olarak vahşi tip hayvanların (örneğin, Canton S) hareketsizleştirici teknik hayatta kontrol edin. a) öldürücülüğü için en yaygın nedeni larva yanlış konumlandırma (Şekil 2G-H bakınız). Kütikül, baş ya da trakea parça bölmenin içinde tamamen değil ise, o zaman hareketsizleştirilmesi sırasında hasar ve edebilirçip (&gt; 4 mm) için çok büyük larva hayatta kalmak için daha az olasıdır. b) öldürücülüğü için daha az yaygın nedeni çok fazla basınç veya vakum çip yükleme kullanılmasıdır. Düzgün bir chip yerleştirildikten sonra, vakum ile oluşturulan basınç iyi tolere edilir. Bununla beraber, vakum ya da hayvan konumlandırılması ilk aşamada ya da aşırı basınç, bir sorun olabilir. Bu, doğru boyutta vahşi tip larvası ile deneyler ile ampirik olarak gerekli basınç derecesini öğrenmek için en iyisidir. çok Halokarbon petrol hayvanın trakea kapakları c) Eğer hayvan potansiyel olarak uzun süreli sağkalım ile ilgili sorunlar olabilir. Bu vakumun oluşturulması, görüntüleme sırasında optik için önemlidir ve bu çip içinde kurumaya karşı koyar: Yağ çipin çeşitli önemli rol oynar. Ancak aşırı yağ kaçınılmalıdır. (Bu ayrıca vakum ödün, boru ve şırınga içinde bir yağ yol açabilir). Yağ ile larva sadece ventral yüzü önerilen protokol mont, ardından rgörüntüleme için son lamel aktarmadan önce temiz bir lamel larva yerleştirme aşırı yağı emoves. d) fototoksisitenin görüntüleme oturumu deneyimli olabilir. Herhangi bir canlı görüntüleme uygulaması olduğu gibi, iyi bir derece hassas bir kamera veya dedektör kullanılarak elde edilir, düşük yoğunluklu lazer ışığı, kısa pozlama süreleri kullanmak için idealdir. Hg ışık kaynakları tarafından oluşturulan geniş spektrumlu ışık dahil, UV ışığı ile aydınlatma en aza indirmek için deneyin. Diğer konular ve geleceğe yönelik: Bu yöntem anestezikler kullanmak olmadığından, hayvanın kalbi atmaya devam ediyor. Bu diğerlerinden daha bazı yerlerde görüntüleme etkileyen bazı kaçınılmaz hareketlilik yaratır. Burada örnekler ventral sinir kablosu, segmental sinirler ve vücut duvarı kolayca kalp atışı müdahalesi olmaksızın görüntülü olabilir göstermektedir. Kalp görüntüleme etkiler durumda, normal hareketleri bazen ile düzeltilebiliranaliz yazılımı (örneğin, ImageJ için Görüntü Sabitleyici eklentisi). Tek tek nesneler (saat dakika) hızlı bir zaman ölçeği (hızlı aksonal taşıma örneğin ~ 1 mm / sn) ya da çok yavaş bir zaman ölçeğinde hareket olduğunda bu iyi çalışıyor. Ancak, nesne (ler) hızları ve yönleri bir dizi faiz hareket, bu kalp kaynaklı hareketler düzeltmek için zor olabilir. Başka bir sorun, hayvandan hayvana ya da çip aynı hayvanın çoklu görüntüleme oturumları arasındaki optik olarak hafif bir değişkenlik. Derin ilgi konusu nesne hayvan içinde olan, daha fazla bu değişim olacaktır. Segmental sinirler ve ventral sinir kablosu çok derin düzenli bir mikroskop üzerinde görüntülü sonra hayvan içinde normal olarak. Ancak larva çip yaşanan hafif basınç çok yakın manikür ve lamel bu yapıları iter. Lamel bu yapıların kesin mesafe tr küçük varyasyonları olacakmahkemeye Ial. Nesneleri için bir varyasyonunun bu gibi duyu nöronlarının hücre gövdeleri olarak, kütikül yakın, daha azdır. Bu optik olarak değişkenlik hesaba hayvan ve bağımsız çalışmalarda çok sayıda kullanmak için, özellikle yoğunluk ölçümleri yapmak için, önemlidir. Burada gösterilen örnek nöronlar içinde işlemleri üzerine odaklanmış olsa da, bu yaklaşım mikroskop amacın odaklama derinliğinde getirilebilir hayvanda herhangi bir yapı görüntüleme için uygun olmalıdır. Bu manikür, vücut duvarı kasları ve onların NMJs içerir. Hayvanın ventral tarafında nefes borusu ve potansiyel olarak sindirim sisteminin parçaları da görüntülenebilir olabilir. Hayvan da dorsal yüzeyine yakın yapıların kısa süreli görüntüleme için lamel yönelik sırt tarafı ile konumlandırılabilir. Derin hayvan içinde görüntü yapılara yeteneği kullanılan mikroskop amacın çalışma mesafesi ile sınırlıdır. Gibi im YapılarıVajina topu diskler yüksek büyütmede (örneğin 40X) amaçları için erişilemez. Bu protokol açıklanan larva yongaları (3.5-4 mm arasında değişen büyüklüklerde) erken 3 instar aşamasında larvaları için tasarlanmıştır. Ancak birçok ilginç sorular farklı larva aşamasında görüntüleme gerektirir. Geç 3. Instars karşılamak için 2. larva evresindeki, ya da daha büyük cips karşılamak için küçük cips kolayca aynı prensibi kullanarak dizayn edilebilir. (Ek Şekil 1 değişmiş odası boyutları ile silikon kalıplar yapmak için kolayca değiştirilebilir DXF dosyasını içerir). Tersinir contanın basit prensip da C gibi diğer organizmalara uygulanabilir ana varyant odası boyutu olmak elegans veya zebra balığı. Bir yararlı gelecekteki yönü tarama amaçlı kullanmak için, aynı anda birçok hayvanların hareketsiz bir çip tasarlamaktır. Ancak, bunun için, tasarım önemli ölçüde farklı olması gerekirçip hayvan konumlandırma konuları bağımsız olarak her hayvan için ele alınması gereken mevcut cihazdan. Larva periferik sinirlerde yaralanma yanıtları incelemek için sinir ezilme deneyi: Larva segmental sinirler için burada açıklanan sinir ezilme tahlil Drosophila periferik akson bir yaralanma tanıtmak için basit bir yöntemdir. Bu yöntemin avantajları şunlardır: a) bir Drosophila laboratuvarında (stereomikroskopta CO 2 kaynak ve forseps) bulunan standart araçları ile yapmak basittir, b) yaralanma sonrası sinir tellerinin biyokimyasal analiz yapma, pek çok hayvan için hızlı bir şekilde yapılabilir 14 uygulanabilir, c) bu yaralanma için moleküler ve hücresel cevaplar 14,15,28 yüksek oranda tekrarlanabilir ve omurgalı nöron 29,30 de önemlidir işlemler keşfedilmesi için kullanılabilir. Nöronların zarar için alternatif yöntemler focu etmektirsa yüksek güç lazer, örneğin lazer mikrocerrahi 17,31-33 üzerinden bir akson sever bir darbeli-UV veya femtosecond lazer. Larva çip gibi mikrocerrahi için hayvan konumlandırma için ideal bir yöntemdir. Ancak, yukarıda tartışılan çalışmalar arasındaki optik, minör farklılıklar, lazer tabanlı yöntem özellikle larva segmental sinirler, larva çoğaltmak için daha zor olabilir. Ayrıca, lazer bazlı aksonal yaralanma, her bir hayvan konumlandırmak için daha fazla zaman gerektirir, dolayısıyla hayvanlar (çok sayıda) ile büyük ölçüde yapmak çok daha zordur. Sorun Giderme: Sinir ezmek en sık karşılaşılan teknik sorun, iç organlara hasar ölümdür. Ezmek takibi yaparken, ventral sinir kablosu, tükürük bezleri, ya da bağırsakları çimdik için önemli değildir. Bu manikür delmek için değil de önemlidir. Bu sorunlar en manikür Surfac 45 ° açıyla forseps getirerek kaçınılıre (bkz. Şekil 3). Forseps kalitesi sonradan ezmek ve hayatta kalma etkinliği üzerinde büyük bir etkisi vardır. Biz Dumostar numara 5 forseps öneririz. Onların keskinliğini korumak için, forseps, dikkatle diğer amaçlar için kullanılan değil, onlar künt ya da katlanmasını hale kez değiştirilmesi gerekir. Hayvanın boyutu da ezmek etkinliğini etkileyebilir. Küçük hayvan (uzunluğu 3 mm&#39;den az) çok daha az muhtemel yaralanma hayatta kalmak için vardır. Büyük hayvanlar ile, (3 rd Instars dolaşıp), bu sinirleri bulmak ve büyük tükürük bezleri ve bağırsakların zarar görmesini önlemek için daha zordur, ve pupa öncesi yaralanma yanıtları incelemek için daha az zaman vardır. Sinir ezilme en etkili erken 3. evre larvaları yapılır (ki ~ ön-arka eksen boyunca uzunluğu 3-4,5 mm). Hayvan üzerine yükseltilmiş gıda kaynağı etkileyebilirezmek sonra manikür ve hayatta kalma gücü. Bu standart maya-glikoz tarifi yapılan gıda hayvanları yükseltmek için tavsiye edilir. Etkili ezmek yapmak için öğrenmek için en iyi yöntem ilk birincil yaşam ulaşma hedefi (ve pupa devresi) ezmek sonra 24 saat ile, birçok hayvan üzerinde uygulama olduğunu. Yeni Başlayanlar normalde düşük bir hayatta kalma oranı (örneğin% 10) var, ama teknik öğrenilen bir kez, sağkalım oranları ~ 90% ulaşabilirsiniz. Diğer konular ve geleceğe yönelik: Ezilme tahlil yaralanma site ve akson ve yaralanma siteye uzak sinapsların dejenerasyonu akson proksimali filizlenmesini incelemek için güçlü bir yöntem sağlar. Dejenerasyon oranları farklı nöron türleri arasında farklılık olsa da, onlar yaralanma testin tekrarlanabilirliği için vasiyet sağlayan, belirli bir nöron tipi içinde son derece tekrarlanabilir. Bunun tersine, &#39;rejeneratif&#39; filizlenmeproksimal akson gözlenen yanıt çalışmasında daha zordur. Segmental sinirin tüm aksonlar (örneğin, Şekil 6 ve Şekil 3) yaralanma siteye yakın çimlenme geniş başlatabilir. Ancak filizlenme ölçüde nöron nöron değişir, ve ölçmek zordur edebilirsiniz. Küba&#39;da benzer bir derecesi ve değişkenliği bir UV pulse-dye lazer kullanılarak tanıtılan segmental sinirler tek motonöronlann daha fokal lezyonlardan sonra görülebilir. Biz filizlenme nondiscriminate yön segmental sinirler rehberlik ipuçlarının yokluğu nedeniyle olduğunu yorumlamak. Buna karşılık, yakın hücre gövdeleri için lazer tarafından yaralı duyusal nöron akson kayıp akson 34 olarak aynı yönde yeni aksonal büyüme geçmesi. Hayvanın bu bölgede Aksonlar olasılıkla yenileyici akson rehberlik daha spesifik konumsal bilgi maruz kalmaktadır. Segmental sinirler içindeki ortamı çok resemblan olması olası değildiraslında embriyo onların rehberliği sırasında navigasyon aksonlar, dolayısıyla yenileyici aksonlar rehberlik bilgi sahibi olması beklenmektedir olmadığını çevreye ce. Segmental sinir ezilme deneyi kullanılarak rejenerasyon eğitim için başka bir sınırlama yaralı duyusal ve motor nöron akson hala hayvan uğrar önce kendi hedefine ulaşmak için (0.25-1 mm) ve sınırlı bir zaman çerçevesi (&lt;3 gün) kapsayacak şekilde önemli bir mesafe olması pupa devresi. Yeni yapılan bir çalışmada 3 instar larva aşamasında 35 süresini üçe prothoraciotropic hormon reseptörünün genetik manipülasyon tespit etti. Bu manipülasyon 9 yerine 3 gün, önemli ölçüde yaralanma sonrası nöronların kurtarma ve dejenerasyon eğitim için zaman çerçevesini genişletmek olacaktır. Bu yaralanma sinaptik biten yakın neden, özellikle böyle kendi postsinaptik hedefi ile bir yaralı akson yeniden bağlanma gibi yeni olaylar, gözlemlemek için yeterince uzun olabilir.

Meyve sineği, Drosophila melanogaster, 100 yılı aşkın bir model organizma olarak kullanılmıştır, ve temel sinyalizasyon ve omurgasız insana korunmuş gelişimsel yolları tanımlayan vesile kanıtlamıştır. Spesifik hücre tiplerinde floresan etiketli proteinlerin ifade için pek çok genetik araçlar vardır, özellikle bu yana, canlı görüntüleme hücresel mekanizmaları çalışmak için önemli bir yaklaşım olduğunu ve basit vücut planı ve Drosophila larva saydam manikür canlı görüntüleme için cazip bir sistem yapar. Canlı görüntüleme teknikleri için önemli bir zorluk noninvaziv hareketsiz ve mikroskopi için bir hayvan pozisyon etmektir. Geleneksel hareketsiz yaklaşımlar hayvan öldürmek her ikisi de, diseksiyon 1,2 ya da kloroform kullanımını içerir. Anestezik eter ve 4 izofloran 5-8 de kullanılmıştır. Anestetikler birçok avantaj sağlar iken, Onlar da bu nedenle okudu sürecini etkileyen ve hayvan üzerinde stres yaratabilir, nöral aktiviteyi ve (kalp atışı dahil) önemli fizyolojisini 9-11 inhibe. Eter ve izofluoran çalışmak için insan güvenlik kaygıları da vardır. Biz &#39;larva çipi&#39; 12 dediğimiz bir tek katmanlı PDMS mikroakışkan cihaz, Drosophila larvaları kılınması için bir ilaç içermeyen bir yöntem geliştirdik. Bu protokol almak veya larva çip yapmak nasıl anlatacağım ve erken sahnelenen 3. evre larvaları canlı görüntüleme için bunu kullanmak için nasıl. Yonga, bir şırınga ile bir vakumun uygulanması üzerine, hafif bir mekanik kuvvet ile hayvan hareketsiz, bir tatlı sıkı oturan microchamber, oluşur. Immobilizasyon yöntemi, böyle bir cam lamel yakın olan sinir kablosu, segmental sinirler ve vücut duvarı kasları gibi ventral yapıları getiriyor. Bu yüksek sayısal aper böyle yapıların yüksek çözünürlüklü görüntüleme için izin verirTure (yüksek büyütme) hedefler. (I) yonga larva kullanılması anestezi yapılmamış hayvanlarda in vivo görüntüleme için izin veren, kimyasalların kullanımını yerine geçer: diğer geleneksel tekniklere göre larva çip avantajları şunlardır. (Ii) Larva hemen (izofluoran 8,13 için 2 saat iyileşme dönemi aksine) çip yayımlanmasından sonra iyileşir. Bu saat ve gün, milisaniye dakika arasında değişen geniş bir zaman ölçekleri üzerinde görüntüleme için izin verir. (Iii) bir gaz geçirgen bir madde olan PDMS, kullanılması larva vücuda çevre oksijen / hava sürekli difüzyonu olanak vermektedir. (Iv) yonga kullanımı kolay ve güvenli, ve (v) yeniden kullanılabilir, ve en az bir maliyetle imal edilebilir. Larva çipi kullanarak talimatlara ek olarak, bu protokol 3 instar larvaları nöronal olayları incelemek için kullanımı çeşitli örnekler sağlayacaktır. Bu Axona canlı görüntüleme dahill ulaşım, yaralanma kalsiyum yanıtları, ve uzun mesafeler ve zaman ölçekleri üzerinde fotoğraf-Cabrio proteinlerin kaçakçılığı time-lapse çalışmaları. Çipin diğer bir uygulaması, aksonal yaralanma nöronal yanıtları incelemektir. Bunun için ek bir prosedür bir segmental sinir izdihama periferik sinirler içinde ons yaralamaktan için (bölüm 3) tarif edilir. Bu basit deney aynı zamanda işlenecek bir çok hayvan sağlayan standart bir diseksiyon stereomikroskop altında, hem de hızlı bir şekilde ve yeniden üretilebilir yapılabilir. Yaralanma hücresel yanıtları larva çip canlı görüntüleme ile ele alınabilir.

<table><tbody><tr><td>0,5 mm Polietilen boru</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-11B</td><td>Polietilen boru, ID = 0,023 inç OD = 0,038 inç</td></tr><tr><td>1 mm Poliüretan boru</td><td>Fisher Scientific</td><td>BB521-63</td><td>Poliüretan boru, ID = 0,063 inç&nbsp; OD = 0,125 inç</td></tr><tr><td>Dikenli - dikenli konektör</td><td>Bio Rad</td><td>732-8300</td><td>0,8 mm dikenli - dikenli konektör</td></tr><tr><td>3 Musluk vanası</td><td>Bio Rad</td><td>732-8104</td><td>Şırınga</td></tr><tr><td>Şırıngası için vidalı valf Şırınga (20 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-33</td><td>Vakum üreten 20 ml şırıngayı</td></tr><tr><td>vidalayın Dağıtım iğneleri, 23 G (0,4 mm İç Çap, 0,6 mm Dış Çap)</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td><td>Çıkış bağlantısı için iğne</td></tr><tr><td>Dağıtım iğneleri, 21 G, (0,6 mm İç Çap,&nbsp; 0,8 mm Dış Çap)</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A679</td><td>Çıkış bağlantısı için iğne</td></tr><tr><td>Halokarbon yağı</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td>Halokarbon yağı 700</td></tr><tr><td>Dumostar Numara 5 Forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-498</td><td>Sinir ezilme için</td></tr><tr><td>PDMS Kiti (Baz ve kürleme maddesi)</td><td>Ellsworth</td><td>184 SIL ELAST KİTİ 0.5KG</td><td>Dow Corning Sylgard 184 Silikon Kapsülleyici 0.5 kg Kit</td></tr><tr><td>Şeffaf Cam Lameller</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-C</td><td>24 mm x 40 mm (mikroskop objektifinizin tavsiyesine göre kalınlık)</td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Plastik Bardak (9 oz)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik kahve karıştırma çubuğu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jiletli Üzüm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>suyu agar plakaları</td><td></td><td></td><td>Tarif için <a href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925">http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925</a> sayfasına bakın</td></tr></tbody></table>

canlı görüntüleme ve yaralanma yanıtları Çalışması için mikroakiskan chips kullanma<em&gt; drosophila</em&gt; larva

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Canlı görüntüleme, ancak bu canlı hayvanlarda zor olabilir, hücre biyolojik süreçleri incelemek için önemli bir tekniktir. Drosophila larva saydam manikür canlı görüntüleme çalışmaları için çekici bir model organizma yapar. Ancak, canlı görüntüleme teknikleri için önemli bir zorluk noninvaziv hareketsiz ve mikroskop bir hayvan pozisyon etmektir. Bu protokol bir polidimetilsiloksanın biz &#39;larva çipi&#39; diyoruz (PDMS) mikroakışkan cihaz üzerinde Drosophila larvaları hareketsizleştirerek ve görüntüleme için basit ve kullanımı kolay bir yöntem sunar. Larva çip bir şırınga aracılığıyla bir vakumun uygulanması üzerine, hayvan hareketsiz ve bu sinir kablosu, segmental sinirler ve gövde olarak ventral getiren yapıları, ince bir cam lamel, eklenmiş bir rahat oturan PDMS microchamber oluşmaktadır lamel yakın mesafede duvar kasları. Bu yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar, ve daha da önemlisi, ane kullanımını önlerfizyolojik süreçleri geniş bir aralığının çalışma kolaylaştırır sthetics ve kimyasallar,. Larvalar hareketsizleştirme kolayca geri olduğundan, bunlar kolaylıkla çoklu görüntüleme oturumları tabi tutulabilir. Bu saatler gün arasında değişen bir süre boyunca uzunlamasına ders çalışmalar için izin verir. Bu protokol adım adım çip ve nasıl 3 instar larvaları nöronal olayların canlı görüntüleme için çip kullanmak için nasıl hazırlanacağını anlatır. Bu olaylar aksonlar, yaralanma kalsiyum yanıtları, ve uzun mesafeler ve zaman ölçekleri üzerinde fotoğraf-Cabrio proteinlerin kaçakçılığı time-lapse çalışmalarda organellerin hızlı taşınmasını içerir. Çipin diğer bir uygulaması, rejeneratif ve aksonal yaralanma dejeneratif yanıtları incelemek, bu nedenle bu protokolün ikinci bölümü bir segmental sinir izdihama periferik sinirler içinde ons yaralamaktan için yeni ve basit bir prosedür açıklanmaktadır.

Drosophila larvaları nedeniyle saydam manikür ve güçlü genetik canlı görüntüleme için çekici bir model sistem. Bu protokol 3 instar Drosophila larvaları nöronların içindeki hücresel süreçlerin canlı görüntüleme için &#39;larva çip&#39; olarak adlandırılan bir tek katmanlı PDMS cihaz, nasıl kullanılacağını açıklar.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, modifiye edilmiş bir mikroakışkan oda kullanarak canlı görüntüleme için drosophila larvalarını invaziv olmayan bir yöntemle sabitlemektir. Larvaların sızdırmazlığını sağlamaya yardımcı olması için bir miktar yağ ile birlikte, üçüncü instarda olan larvalar çipe yerleştirilir. Ardından çip, larvaların gövdesi odanın içine gelecek şekilde larvaların üzerine yerleştirilir.Vakum uygulanabilmesi için çip bir şırıngaya bağlanır. Larvaların hareketliliği kısıtlanır ve hayvanın ventral kısmındaki yapılar lam üzerine doğru itilir. Konfokal mikroskop kullanılarak, duyusal nöron akson terminallerinin detayları ve indüklenen sinir hasarı sonrası segmental sinirlerin rejenerasyonu gibi yapılar kolayca görüntülenir.Canlı görüntüleme için josepha'yı immobilize etmenin diğer yöntemleri arasında kloroform, eter veya ISO anestezikleri yer alır. Bu tekniğin temel avantajı, hayvanın fizyolojisini bozan bu tür toksinlerin kullanımından kaçınılmasıdır. Toksinlerin yokluğundan kaynaklanan ek bir fayda ise larvanın çalışmak için güvenli olmasıdır. Güçlü immobilizasyon, hızlı aksonal transport ve hücre içi kalsiyum değişiklikleri gibi hızlı olayların görüntülenmesine olanak tanır.Tek bir larva, çip içerisinde immobilize edilebilir ve defalarca görüntüleyebilir. Bu durum, 72 saate kadar süren süreçlerin zaman serili görüntülenmesine olanak tanır. Bu protokolü denemek için önce örnek bir PDMS çip temin ederek başlayın.21 gauge bir dağıtım iğnesi kullanılarak SU-8 kalıptan A-P-D-M-S çipinin nasıl hazırlanacağına dair talimatlar, metin protokolünde okunabilir. Ters mikroskop için PDMS çipinin vakum portuna bir delik açın. 23 gauge bir iğneyi, kilit göbeğinden birkaç döndürme hareketiyle çıkarın.Ardından, iğne ucunu, tüpün iğnenin en az bir milimetresini kaplayacağı şekilde küçük bir polietilen tüp parçasına yerleştirin. Fazla tüp kısmını kesmek için bir jilet kullanın. Bu işlem, sızdırmazlık sağlayabilecek plastik bir halka bırakacaktır.23 gauge iğne ucunu vakum portundaki deliğe yerleştirin. Dik bir mikroskop kullanılıyorsa, PDMS çipin yan tarafına 21 gauge dozajlama iğnesi ile ikinci bir delik açın. Bu delik, ilk deliğe yandan erişim sağlayacaktır.Ardından, 23 gauge iğne ucunu ve tüp halkasını yan deliğe yerleştirin. Üst deliği kapatmak için PDMS çipin üst kısmına bir parça çift taraflı bant yapıştırın. Çipin vakum portuna yerleştirilen iğne ucu ile üç yollu bir valfin portlarından biri arasına 20 centimeter uzunluğunda polietilen tüp takın.Ardından, valfin kalan iki portundan birine 20 milliliter şırınga takın ve son portu açık bırakın. PDMS çipi şeffaf yapışkan bantla temizleyin. Çipin altına bir parça bant yapıştırın.Bandın tüm PDMS yüzeyine temas ettiğinden emin olun ve ardından bandı kaldırın. Bu temizleme yöntemini üç kez tekrarlayın. PDMS çip yeniden kullanılabilir olduğundan, PDMS'in cama yapışmasını etkileyebilecek yağ kalıntılarını temizlemek çok önemlidir. Erken arama davranışını aktarın.Besiyerinden alınan üçüncü instar larvalar, su içeren bir Petri kabına aktarılır. Çipe doğru şekilde yerleşebilmeleri için larvaların boyunun 3,5 ile 4 mm arasında olması gerekir. Kültür ortamını uzaklaştırmak için larvalar yıkanır.Ardından, bir cam lamelin merkezine bir damla halo carbon 700 yağı damlatılır; bir pens yardımıyla yıkanmış bir larva nazikçe alınır. Larva, üzerindeki fazla sıvıyı kurulamak için kısa süreliğine hafif bir silgiye yerleştirilir ve ardından 10 saniye boyunca yağın içine aktarılır. Damla, larvanın trakealarının kaplanmayacağı kadar küçük olmalıdır.Ardından larvaları kısa bir süreliğine temiz bir cam lamelle yerleştirin ve başka bir lamelle taşıyın. Böylece biraz daha fazla yağı uzaklaştırmış olursunuz. Neural kordonu ve segmental sinirleri görüntülemek için larvaların yönelimine dikkat edin.Ventral taraf aşağıya bakmalıdır. Kolayca tanımlanabilen trake tüpleri yukarıya bakmalıdır. Şimdi PDMS çipi nazikçe larvaların üzerine yerleştirin.Larvaları mikro odağın merkezine hizalayın. Arka ucu vakum portuna dönük olan larva, odağın kenarlarına temas etmemelidir. Hizalama tamamlandıktan sonra, iyi bir sızdırmazlık sağlamak için PDMS çipi cam lamelin üzerine bastırın.Ardından, larvanın mikro hazne içine tamamen hapsolduğunu iki kez kontrol edin. Şimdi üç yollu vanayı şırıngaya çevirin. PDMS düzeneğini sıkıca tutun ve direnç hissedilene kadar şırınga pistonunu çekerek 2 ila 2,5 milimetre hava çekin.Böylece vakum oluşturulur. Ardından vanayı kapatın. Vakumu dikkatlice korumak için larvaları tekrar kontrol edin.Vücudu mikro oda içinde sabitlenmiş olmalı ve trake görünür olmalıdır. PDMS çipin geri kalanı lamelya ile temas halinde olmalıdır. Bu gibi yönlendirmeler doğru değildir. Şimdi larvaların görüntüsünü alın.Dik bir mikroskop kullanılıyorsa, çipin üst tarafı çift taraflı bant ile sahneye sabitlenir. Görüntüleme tamamlandığında vakum serbest bırakılır. Ardından PDMS çip lamine camdan ayrılır.Larva, penset kullanılarak hemen hareketli hale getirilmelidir. Larvaları toparlanmaları için üzüm suyu agar plağına geri aktarın. Anestezi uygulanmış tek bir larvayı üzüm suyu agar plağına yerleştirin.Stereo mikroskop altında, hayvanı ventral tarafı yukarı gelecek şekilde çevirin. Ventral sinir kordonunu ve segmental sinirleri görüntülemek için larvanın tamamen hareketsiz olduğundan emin olun. Sinir kordonunu ve tükürük bezlerini tespit edin.Bu yapıların zarar görmemesi önemlidir. Üçüncü abdominal segmentin son kısmını belirleyin. Buradaki yaralanma, hayvanı öldürmeden en fazla sinire zarar vermeyi sağlayan ve tekrarlanması en kolay yöntemdir.Yaralama işlemi, beş numara duo star pens kullanılarak daha posterior segmentlerde de gerçekleştirilebilir. Segmental sinirleri kütikül üzerinden beş ila 10 saniye boyunca sıkıca sıkıştırın. İşlem doğru yapıldığında, kütikül bozulmaz ve vücut duvarı delinmez.Hayvan, yaralama işlemi sonrası büyük plaka üzerine ventral tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirildikten sonra uzmanlık kazanmak için pratik gerekecektir. Hayvan kafasını hareket ettirebilmeli ve beslenebilmelidir. Yaralama başarılı olduysa, larvaların posterior yarısı felç olacaktır.Larva çipi, tekil periferik aksonlar içindeki sinaptik veziküllerin kinezin aracılı taşınımını görüntülemek için kullanılmıştır. Bu veziküllerin anterograd hareketi saniyede yaklaşık 1.0 mikron olarak ölçülmüştür. Retrograd hareket ise saniyede 0.8 mikron olarak kaydedilmiştir.Darbeli bir UV boya lazeri kullanılarak gerçekleştirilen lazer mikrocerrahisi için immobilizasyon tekniği uygulanmıştır. Genetik olarak kodlanmış bir indikatör sayesinde belirli nöronlardaki kalsiyum seviyeleri gözlemlenmiştir. G camp 3.0 ile bir duyusal nörondan sonra kalsiyum piki tespit edilmiştir.Dendrit kesilmiştir. Hayvanın görüntüleme oturumları arasında dinlenmesine izin verilmesi, hücresel olayların zaman içinde izlenmesini sağlar. Emerik motor nöronların aksonları ezildikten sonra, proksimal akson güdüğünde yeni filizlenme meydana gelmiştir.Bu sırada, distal aksonlar varikositeler oluşturmuş ve wallerian dejenerasyonu süreciyle fragmente olmuştur. Larva çipi takip fotoğrafı kullanılarak floresan proteinlerin in vivo olarak fotokonversiyonu da mümkündür. Sınıf dört duyusal nöronlarda eksprese edilen bir DRA iki alfa tubulin füzyon proteini, hücre gövdelerinde fotokonverte edilmiştir.İki gün içinde, fotokonverte edilmiş proteinin önemli bir miktarı, hücre gövdesindeki orijinal konumundan yaklaşık bir milimetre uzaklıktaki duyusal nöronların akson terminallerine taşınmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, drosophila larvalarının canlı görüntülemesi için larva çipinin nasıl kullanılacağı ve sinir ezilme yaralanmasının nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknikler ustalıkla uygulandığında, larvalar mikroskop üzerine sadece birkaç dakika içinde yerleştirilebilir.Sinir ezme işlemi de aynı derecede hızlıdır. Bu nedenle, bu prosedürler genetik dereceler gibi büyük ölçekli deneyler için kullanılabilir. Çip, drosophila larvalarının ventral tarafındaki yapıların görüntülenmesi için kullanılabilir.Bunlar arasında kaslar, nöromüsküler kavşak sinapsları, duyusal nöronlar, periferik sinirler ve ventral sinir kordonu yer alır ancak bunlarla sınırlı değildir. Bu prosedür ayrıca larva kalbinin, tükürük bezlerinin ve trakeanın canlı görüntülemesini yapmak için de kullanılabilir. Bu videoda kullanılan larva çipi, uzunluğu 3.5 ve dört milimetre arasındaki hayvanlar için boyutlandırılmıştır.Görüntüleme alanı daha küçük veya daha büyük olması durumunda, daha küçük veya daha büyük bir hazneye sahip hayvan chipleri kolayca hazırlanabilir. PDMS chiplerinin yapımı için ek tasarım dosyasına ve talimatlara bakınız. PDMS chiplerini hazırlama talimatları yazılı protokolde yer almaktadır.Bizimle iletişime geçerseniz size örnek bir çip gönderebiliriz.

using-microfluidics-chips-for-live-imaging-study-injury-responses

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz sinek larvaları konfokal mikroskobu ile floresan boyalar kullanarak canlı bir roman Tersyüz doku hazırlanması Glia nöromüsküler sinapsların yapısal özellikleri nitelendirdi. Biz HRP için flüoresan primer antikor ile canlı nöron terminalleri etiketli ve floresan Dextrans perisynaptic alan görüntülendi.

Canlı görselleştirme Drosophila</emFloresan Boyalar> Glial nöromüsküler Kavşağı

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

Basit bir mikroakışkan cihaz anestezik ücretsiz gerçekleştirmek için...

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Bu videoda, canlı Drosophila embriyolarına reaktifler veren mikroenjeksiyonların nasıl gerçekleştirileceği açıklanmaktadır. Araştırmacılar bu yöntemi, embriyo gelişiminin erken aşamalarında nükleik asitler ve proteinler gibi eksojen bileşikleri tanıtmak için kullanabilirler. Öne çıkan protokol, herhangi bir çözünür reaktifin enjeksiyonu için prosedürün nasıl kurulacağını ve gerçekleştirileceğini gösterir - burada, canlı görüntüleme deneyleri için bir floresan protein.

Canlı Drosophila Embriyolarının Mikroenjeksiyonu: Reaktiflerin Gelişmekte Olan Embriyoya Erken Verilmesi

Çok geç evre Drosophila embriyoların embriyonik epidermis hızlı lastik yara cevap analizi için bir in vivo sistemi sağlar ve memeli modelleri tercüme için, yara iyileşmesi çalışmalar ilerlemek için genetik manipülasyon ya da mikro-enjeksiyon kimyasal tedaviler ile kombine edilebilir.

Mikroenjeksiyon Yara Deneyi ve<em&gt; In vivo</em&gt; Epidermal lokalizasyonu Tepki Gazeteciler Yara<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar.

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Bu protokol, drosophila larvalarının sağlam canlı hayvanlarda 10 saatten daha uzun süre kesintisiz zaman atlamalı görüntüleme elde etmek için bir yöntem inşama yöntemini açıklamaktadır. Bu yöntem larva gövde duvarına yakın birçok biyolojik süreci görüntülemek için kullanılabilir.

LarvaSPA, Uzun Süreli Hızlandırılmış Görüntüleme için Drosophila Larva Montajı Için Bir Yöntem

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Bu protokol, aksonal yaralanma sonrası nöronal metabolik dinamikleri modelleyen, görüntüleme, çoklu omik analiz ve içsel metabolik yeniden şekillenmenin mekanik çalışmalarını mümkün kılan bir mikroakışkan sistemi tanımlar.

Aksonal Yaralanma Modelleri Yapımı ve Çoklu Omik Analizin Etkinleştirilmesi için Mikroakışkan Çip

Öğrenin, Drosophila larvalarını canlı görüntüleme için mikroakışkan cihazla invaziv olmayan şekilde sabitleme yöntemini. Bu teknik, toksik anestezikler kullanmadan sinir rejenerasyonu ve aksonal taşıma süreçlerini gözlemlemeyi sağlar.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma

Daha fazla video keşfet