Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma Drosophila Larva
7 Şubat 2014
Drosophila larvaları nedeniyle saydam manikür ve güçlü genetik canlı görüntüleme için çekici bir model sistem. Bu protokol 3 instar Drosophila larvaları nöronların içindeki hücresel süreçlerin canlı görüntüleme için 'larva çip' olarak adlandırılan bir tek katmanlı PDMS cihaz, nasıl kullanılacağını açıklar.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, modifiye edilmiş bir mikroakışkan oda kullanarak canlı görüntüleme için drosophila larvalarını non-invaziv olarak hareketsiz hale getirmektir. Yıldız larvalarının üçte biri, larvaları kapatmaya yardımcı olmak için bir miktar yağ ile çipe yerleştirilir. Daha sonra, çip, gövdesi hazneye sığacak şekilde larvaların üzerine yerleştirilir.
Çip, bir vakum uygulanabilmesi için bir şırıngaya bağlanır. Larvaların hareketliliği kısıtlanır ve hayvanın ventral kısmındaki yapılar örtü kızağına yakın itilir. Konfokal bir mikroskop kullanılarak, duyusal nöron akson terminallerinin ayrıntıları ve indüklenen sinir hasarından sonra segmental sinirlerin rejenerasyonu gibi yapılar kolayca görüntülenir.
Canlı görüntüleme, büyük kloroform eter veya ISO anestezikleri için josepha'yı hareketsiz hale getirmenin diğer yöntemleri. Bu tekniğin temel avantajı, hayvanın fizyolojisine müdahale eden bu tür toksinlerin büyük bir kısmını önlemesidir. Ve toksinlerin yokluğundan ek bir fayda, larva GB'nin güvenli olması ve sağlam immobilizasyon, daha hızlı aksonal taşıma ve hücre içi kalsiyumdaki değişiklikler gibi hızlı olayların görüntülenmesine izin verir.
Tek bir larva çip içinde birden çok kez hareketsiz hale getirilebilir ve görüntülenebilir. Bu, zaman yaşamlarına izin verir. 72 saate kadar süren süreçlerin görüntülenmesi Bu protokolü denemek için örnek bir PDMS çipi edinerek başlayın.
Bir SU sekiz kalıptan A-P-D-M-S çipinin nasıl yapılacağına ilişkin talimatlar, 21 gauge dağıtım iğnesi kullanılarak metin protokolünde okunabilir. Ters çevrilmiş bir mikroskop için PDMS çipinin vakum portunda bir delik açın. 23 gauge bir iğneyi tabanından, kilit göbeğinden birkaç büküm kullanarak çıkarın.
Ardından iğne ucunu küçük bir polietilen boru parçasına yerleştirin, böylece boru iğnenin en az bir milimetresini kaplar. Fazla boruyu kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Bu, sızdırmazlık sağlayabilen plastik bir halka bırakır.
23 gauge iğne ucunu vakum portunun deliğine sokun. Dik bir mikroskop için, 21 gauge dağıtım iğnesi ile PDMS çipinin yan tarafında ikinci bir delik açın. Bu delik, yandan ilk deliğe erişim sağlayacaktır.
Ardından 23 gauge iğne ucunu ve boru halkasını yan deliğe sokun. Üst deliği kapatmak için PDMS çipinin üstüne bir parça çift taraflı bant yerleştirin. Çipin vakum portuna yerleştirilen iğne ucu ile üç bir vananın portlarından biri arasına 20 santimetre uzunluğunda bir polietilen boru takın.
Ardından, 20 mililitrelik bir şırıngayı valfin kalan iki portundan birine takın ve son portu açık bırakın. PDMS çipini şeffaf yapışkan bantla temizleyin. Çipin altına bir parça bant yapıştırın.
Bandın tüm PDMS yüzeyine temas ettiğinden emin olun ve ardından bandı soyun. Bu temizleme yöntemini üç kez tekrarlayın. PDMS çipi tekrar kullanılabilir olduğundan, PDM'nin cam Transferine erken yiyecek aramaya yapışmasını etkileyebileceğinden yağ kalıntısının giderilmesi çok önemlidir.
Üçüncü instar larvaları yiyeceklerden su içeren bir Petri kabına götürür. Çipi doğru şekilde takmak için 3,5 ila dört milimetre uzunluğunda olmalıdır. Kültür ortamını çıkarmak için larvaları yıkayın.
Daha sonra, bir cam kapak kaymasının ortasında küçük bir damla halo karbon 700 yağı oynar, forseps kullanarak yıkanmış bir larvayı nazikçe alır. Havluyla temizlemek için kısa bir süre hafif bir mendil üzerine koyun ve ardından 10 saniye boyunca yağa doğru hareket ettirin. Damla, larvaların trakeasının kaplanmayacağı kadar küçük olmalıdır.
Daha sonra larvaları kısa bir süre temiz bir cam kapak kızağına yerleştirin ve başka bir kapak kızağına taşıyın. Böylece biraz daha fazla yağ çıkarır. Nöral kord ve segmental sinirleri görüntülemek için larva yönüne dikkat edin.
Ventral taraf aşağı doğru olmalıdır. Kolayca tanımlanan trakeal tüpler yukarı doğru olmalıdır. Şimdi PDMS çipini yavaşça larvaların üzerine yerleştirin.
Larvaları mikro odanın merkezine hizalayın. Arka tarafı vakum portuna doğru yönlendirilmiş durumdayken, larva odanın kenarlarına temas etmemelidir. Hizalandıktan sonra, iyi bir sızdırmazlık elde etmek için PDMS çipini cam kapak kızağına doğru itin.
Ardından larvaların tamamen mikro hazneye kapatıldığını iki kez kontrol edin. Şimdi üç vanayı şırıngaya geçirin. PDMS tertibatını sıkıca tutun ve direnç hissedilene kadar iki ila 2.5 milimetre hava çekmek için şırınga pistonunu çekin.
Böylece bir boşluk yaratır. Ardından valfi kapatın. Vakumu dikkatli bir şekilde korumak için larvaları iki kez kontrol edin.
Vücudu mikro hazne içinde hareketsiz hale getirilmeli ve trakea görünür olmalıdır. PDMS çipinin geri kalanı lamel ile temas halinde olmalıdır Bu gibi yönlendirmeler doğru değildir. Şimdi larvaları hayal edin.
Dik bir mikroskop kullanıyorsanız, çipin üst tarafını çift taraflı bantla sahneye sabitleyin. Görüntüleme tamamlandığında vakumu serbest bırakın. Ardından PDMS çipini kapak kızağından ayırın.
Larva forseps kullanılarak hemen hareketli olmalıdır. Larvaları geri kazanım için bir üzüm suyu agar tabağına geri koyun. Tek bir anestezi uygulanmış larvayı bir üzüm suyu agar tabağına yerleştirin.
Stereo mikroskop altında, hayvanın ventral tarafını yukarı çevirin. Ventral sinir kordonunu ve segmental sinirleri görselleştirmek için larvaların tamamen hareketsiz olduğundan emin olun. Sinir kordonunu ve tükürük bezlerini bulun.
Bu yapılara zarar vermemek önemlidir. Üçüncü karın segmentinin sonunu bulun. Buradaki yaralanma en çok sinire zarar verir ve hayvanı öldürmeden çoğaltılması en kolay olanıdır.
Yaralanma, beş numaralı ikili yıldız forseps kullanılarak daha arka segmentlerde de yapılabilir. Segmental sinirleri kütikülden beş ila 10 saniye boyunca sıkıca sıkıştırın. Doğru yapıldığında kütikül sağlam kalır ve vücut duvarı delinmez.
Ustalık, hayvanın ventral tarafını büyük tabağa yerleştiren yaralanmadan sonra pratik yapacaktır. Başını hareket ettirebilmeli ve yemek yiyebilmelidir. Yaralanma başarılı olursa, larvaların arka yarısı felç olur.
Larva çipi, bireysel periferik aksonlar içinde sinaptik veziküllerin kinesin aracılı taşınmasını görüntülemek için kullanıldı. Bu veziküllerin entero dereceli hareketi saniyede yaklaşık 1.0 mikron olarak ölçüldü. Retrograd hareket saniyede 0.8 mikron olarak ayarlandı.
İmmobilizasyon tekniği, darbeli UV boya lazeri kullanılarak lazer mikrocerrahisi için kullanıldı. Genetik olarak kodlanmış bir gösterge sayesinde belirli nöronlarda kalsiyum seviyeleri gözlendi. G kampı 3.0: Duyusal bir nörondan sonra bir kalsiyum artışı tespit edilir.
Dendrit kesilir. Hayvanın görüntüleme seansları arasında dinlenmesine izin vermek, hücresel olayların zaman içinde görüntülenmesini sağlar. Emerik motor nöronların aksonlarını ezdikten sonra, proksimal akson kütüğü yeni filizlenmeye uğradı.
Bu arada, distal aksonlar varisler oluşturdu ve wallerian dejenerasyonu süreci boyunca parçalandı. Larva çipi izleme fotoğrafını kullanarak, dönüştürülmüş floresan proteinleri in vivo olarak da mümkündür. Dördüncü sınıf duyusal nöronlarda eksprese edilen bir DRA iki alfa tübülin füzyon proteini, hücre gövdelerinde foto dönüştürüldü.
İki gün içinde, önemli miktarda foto-dönüştürülmüş protein, hücre gövdesindeki orijinal konumdan yaklaşık bir milimetre uzaktaki duyusal nöronların akson terminallerine taşındı. Bu videoyu izledikten sonra, drosophila larvalarının canlı görüntülenmesi için larva çipinin nasıl kullanılacağını ve sinir ezilme yaralanmasının nasıl yapılacağını iyi anlamalısınız. Bu tekniklere hakim olduktan sonra, larvalar sadece birkaç dakika içinde mikroskopta konumlandırılabilir.
Sinir krizi de bir o kadar hızlıdır. Bu nedenle, bu prosedürler genetik dereceler gibi büyük ölçekli deneyler için kullanılabilir. Çip, drosophila larvalarının ventral tarafındaki yapıları görüntülemek için kullanılabilir.
Bunlar kasları, nöromüsküler kavşak sinapslarını, duyusal nöronları, periferik sinirleri ve ventral sinir kordonunu içerir ancak bunlarla sınırlı değildir. Bu prosedür aynı zamanda larva kalbinin, tükürük bezlerinin ve trakeanın canlı görüntülemesini yapmak için de kullanılabilir. Bu videoda kullanılan larva çipi, uzunluğu 3,5 ila dört milimetre arasında olan hayvanlar için boyutlandırılmıştır.
Görüntüleme daha küçük veya daha büyük olduğu için, hayvanlar daha küçük veya daha büyük bir hazne ile kolayca çip yapılabilir. PDMS çipleri yapmak için ek tasarım dosyasına ve talimata bakın. PDMS çiplerini yapmak için talimatlar yazılı protokolde yer almaktadır.
Bizimle iletişime geçerseniz size örnek bir çip gönderebiliriz.
Genel Bakış
Bu protokol, modifiye edilmiş bir mikroakışkan oda kullanarak Drosophila larvalarının canlı görüntüleme için non-invaziv olarak hareketsizleştirilmesi yöntemini özetlemektedir. Bu teknik, özellikle aksonal taşıma ve sinir rejenerasyonu bağlamında, nöronlar içindeki hücresel süreçlerin gözlemlenmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Canlı Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Drosophila larvaları, şeffaflıkları ve genetik uygunlukları nedeniyle nöronal süreçlerin incelenmesi için değerli bir modeldir.
- Canlı görüntüleme, dinamik hücresel olayların gerçek zamanlı olarak incelenmesine izin verebilir.
- Geleneksel hareketsizleştirme yöntemleri genellikle fizyolojiyi etkileyebilecek zararlı anestezikler içerir.
- Bu protokol, toksik maddeler olmadan görüntüleme için daha güvenli bir alternatif sağlamayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Drosophila larvalarının görüntüleme için non-invaziv bir hareketsizleştirme yöntemi geliştirmek.
- Nöronal yapıların ve süreçlerin gözlemlenmesini kolaylaştırmak.
- Aynı larvanın uzun süreler boyunca tekrarlanan görüntülemesini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Larvaları hareketsizleştirmek için PDMS mikroakışkan cihazının kullanılması.
- Larval motiliteyiyi kısıtlamak için vakum uygulanması.
- Nöronal yapıları görselleştirmek için konfokal mikroskopla görüntüleme.
- Optimal görüntüleme için PDMS çipinin ve larvaların pozisyonlandırılmasının ayrıntılı hazırlanması.
Ana Sonuçlar
- Toksik anestezik kullanmadan larvaların başarılı bir şekilde hareketsizleştirilmesi.
- Sensitif nöron akson terminalleri ve segmental sinir rejenerasyonunun net görüntülemes.
- 72 saat boyunca zaman-serisi görüntüleme yapabilme.
- Kinesin aracılı sinaptik veziküllerin taşınmasının gösterimi.
Sonuçlar
- Modifiye edilmiş mikroakışkan oda, Drosophila larvalarının canlı görüntülemesinde güvenli ve etkili bir yöntem sağlamaktadır.
- Bu yaklaşım, hızlı nöronal olayların ve iyileşme süreçlerinin incelenmesine olanak tanımaktadır.
- Protokol, nörobilim araştırmalarında çeşitli görüntüleme uygulamaları için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Non-invasive immobilization of model organisms enables longitudinal imaging of dynamic cellular processes without pharmacological confounders, supporting mechanistic de-risking in target validation. The larva chip facilitates repeated imaging sessions over 72 hours, allowing assessment of axonal transport, injury responses, and regeneration in a physiologically relevant system. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by preserving native biology during observation of neuronal dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct visualization of axonal transport and calcium signaling in neurons.
- Operational Value: Supports functional target validation by allowing repeated imaging of the same larva to assess target engagement and pathway modulation over time.
- Predictive Value: Provides quantitative readouts of organelle trafficking and injury-induced responses, improving target confidence in neuroscience discovery.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by immobilizing larvae for consistent, high-resolution imaging of ventral structures.
- Reproducibility: Enables standardized preparation and sealing of larvae in PDMS microchambers, reducing variability in live imaging assays.
- Scalability: Facilitates rapid immobilization and imaging cycles, supporting medium-throughput evaluation of genetic or pharmacological perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models axonal injury and regeneration processes relevant to neurodegenerative disease mechanisms.
- Translational Continuity: Bridges discovery imaging with preclinical validation by enabling time-lapse studies of Wallerian degeneration and axonal sprouting.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying regenerative versus degenerative responses to nerve crush injury.
Pipeline & Workflow Integration
The larva chip integrates into early discovery workflows by enabling live imaging of neuronal processes prior to lead identification, supporting hypothesis testing and pathway clarification in Drosophila-based models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through direct imaging of kinesin-mediated vesicle transport and calcium fluxes in sensory neurons.
- Screening: Delivers assay readiness via reproducible immobilization and ventral-side proximity to coverslip for consistent imaging.
- Analytics: Enables quantitative measurement of axonal transport rates (1.0 µm/s anterograde, 0.8 µm/s retrograde) and calcium spike detection using genetically encoded indicators.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling axonal injury responses, including sprouting and fragmentation, over extended time courses.
- Enterprise Reuse: Positions the PDMS microfluidic chip as a reusable platform for longitudinal studies across multiple experimental sessions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by enabling observation of rapid neuronal events without anesthetic-induced physiological disruption.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized chip preparation, vacuum-based immobilization, and cleaning protocols to prevent oil residue interference.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by allowing repeated use of single larvae, reducing animal numbers needed for longitudinal studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through quantifiable imaging of degeneration and regeneration metrics post-injury.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, vacuum system operation, and confocal microscopy for optimal imaging.
- Depends on access to PDMS molding tools, syringe-based vacuum ports, and polyethylene tubing for sealing and fluidic connections.
- Necessitates cross-team standardization of larval preparation, oil application, and chamber alignment to ensure consistent immobilization.
- Involves adaptation considerations for different larval sizes, requiring chip dimension adjustments based on body length (3.5–4 mm for standard chip).
- Includes practical limitations such as the need to avoid tracheal oil coating and ensure proper ventral-side orientation for nerve cord visualization.
