E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

Merhaba, ben Krete Laboratuvarı'ndan William Tis. Bugün, ben ve diğer arkadaşlarımla birlikte size E 15 fare embriyolarına yapılan intrauterin enjeksiyonları göstereceğiz. Merhaba, benim adım Laura Elias.

Bugün size, gerçekleştireceğimiz intraventriküler enjeksiyonlar ve elektroporasyon için mikroenjeksiyon pipetlerinin nasıl hazırlanacağını ve yükleneceğini göstereceğim. Benim adım David Castaneda ve bugün fare embriyolarına yapılacak in vivo in utero enjeksiyonlarda yardımcı olacağım. Gelişmekte olan fare embriyolarının lateral ventrikülüne plazmid DNA enjekte edeceğiz.

Gelişimin ilerleyen aşamalarında nöronlara dönüşecek olan glial hücreler tarafından farklı moleküllerin ekspresyonunu elde etmek amacıyla, bu embriyoların CE korteksini hedefliyoruz. Bu intrauterin enjeksiyonları yaparken kullanmanız gereken birkaç önemli araç bulunmaktadır ve bunları şimdi size göstereceğim. Bir freer ve bir çift ince uçlu pens kullanıyoruz.

Biri tırtıklı, diğeri ise ucunda küçük bir diş bulunan iki çift makas. Bir çift hemostat kullanıyoruz. Bu ise bir makas çiftidir.

Ardından bu iki zımbayı kullanıyoruz. Büyük olanı sıçanlar için, küçük olanı ise fareler için kullanmaktayız.

Yedi numara zımba kullanılır, burada ise dokuz numara zımba kullanılmaktadır ve bunlar yaylıdır. Cerrahi işlemlere yardımcı olmak için burada kullandığımız bazı araçlardan biri, çift başlıklı basit bir fiber optik ışık kaynağıdır. Isıyı korumak için içinden sıcak su sirkülasyonu yapan ısıtmalı bir ped kullanıyoruz.

Çalışma yüzeyi için BTX tarafından üretilen bu elektroporasyon sistemini kullanıyoruz. Embriyoların boyutuna bağlı olarak kullandığımız birkaç farklı boyutta elektrot paleti bulunmaktadır. Mavi taraf pozitif taraftır.

Fareler için izofluran vaporizerı kullanıyoruz. Bu yöntemin, anne ve embriyoların hayatta kalma oranını artırdığını tespit ettik. Ayrıca bu yöntem, hayvanı çok hızlı ve oldukça kontrollü bir şekilde bilinç kaybına uğratmamıza ve tekrar uyandırmamıza olanak tanır.

Bu nedenle, bunu oldukça kullanışlı bulduk. Pekala, şimdi enjeksiyon pipetlerimizin ucunu eğimlendireceğiz. Pipetinizin DNA yükleyebileceğiniz kadar geniş bir açıklığa sahip olması ve aynı zamanda enjeksiyon sırasında embriyoya zarar vermemesi için çok keskin olması açısından bu işlem oldukça önemlidir.

Enjeksiyon sırasında embriyoya zarar verirseniz, çok daha yüksek bir mortalite oranıyla karşılaşırsınız. Bu da istenmeyen bir durumdur. Dolayısıyla bu, söz konusu cerrahi işlemde aslında çok önemli bir süreçtir.

İlk olarak, burada dönmekte olan pah kırma taşına biraz su dökeceğiz. Ardından, şuna bakalım, sadece bir çubuk alacağız. Az önce çektiğimiz pipeti, biraz bant yardımıyla bu çubuğun üzerine yerleştireceğiz.

Pipeti eğim üzerinde tutmak ve burada eğilmesini sağlamak için bu mikro manipülatörlerden birini kullanacağız. Böylece, bunu yerleştirip pipetin ucunu görüntülemek için mikroskop kullanacağız. Biraz basınç oluşması için pipeti, eğimin üzerindeki suyun hemen içine yerleştireceğiz.

Burada ucun taşa baskı uyguladığını görebilirsiniz. En az 15 dakika boyunca eğim yapmasına izin verin. Ben genellikle bir saat kadar bırakmayı tercih ediyorum.

Bazen gerçekten çok keskin olabilirler, ancak pipetlerini ne kadar süre boyunca eğimledikleri kesinlikle kişiden kişiye değişir. Tamam, burada görebileceğiniz üzere üst kısımda çekilmiş ancak henüz eğimlenmemiş bir pipetimiz var. Dolayısıyla keskin olsa da, DNA'nızı yükleyebileceğiniz herhangi bir açıklığı yoktur.

Artık alt pipet eğimlendirilmiştir ve bu güzel açılı açıklığı görebilirsiniz. Bu yapı, DNA'yı yüklemenize olanak tanırken, herhangi bir hasar oluşturmadan enjeksiyon yapabilmeniz için uç kısmı hâlâ sivri kalmıştır. Tamam, şimdi enjeksiyon pipetlerimizi DNA ile dolduracağız. DNA'nızı enjekte ederken herhangi bir lipopolisakkarit enjekte etmemek için, DNA'nızı endotoksin içermeyen bir şekilde hazırlamanız önemlidir.

Şimdi DNA'mızı alacağız ve burada parafilmi hazırlayacağız. Parafilmi buraya serin, DNA'nızı toplayın ve parafilmin üzerine küçük bir nokta şeklinde yerleştirin. Ardından, genellikle kullandığım yaklaşık 1.5 ila 1.7 µg/µL konsantrasyondaki DNA'mın her 10 µL'si için...

Bu fast green boyasından yaklaşık 1 µL kullanacağım. Bu boya, sadece enjeksiyon yerini belirlememize ve ventriküle başarıyla enjekte ettiğimizden emin olmamıza yardımcı olacaktır. Ardından, bu fast green boyasını DNA'm ile karıştıracağım.

Ardından enjeksiyon elektrodunuzu alın ve pistonu geri çekerek pipeti dolduracağız. Buradan görebileceğiniz üzere, eğer pipetin ucu doğru şekilde eğimliyse ve yeterince geniş bir açıklığa sahipse, DNI oldukça kolay bir şekilde yüklenecektir. Bazen doğru şekilde yüklenmesine yardımcı olmak için pistonu ileri geri hareket ettirmeniz gerekebilir.

Ardından pipeti bu şekilde doldurabilirsiniz. Böylece DNA'yı pipete tamamen doldurmuş olduk ve enjeksiyon için hazır hale geldi. Tamam, şimdi hayvanı alkol ve iyotla temizleyeceğim ancak öncesinde, hayvanın tamamen anestezi altında olduğundan emin olmak için bir ayak parmağı sıkıştırma testi yapacağım ve her şey yolunda görünüyor.

Öyleyse başlayabilirim. Tıpkı sıçanlarda yaptığımız gibi, bunlardan üçlü bir seri ile başlıyorum; ilk olarak etanol ile başlıyorum. Tamam, iyot.

Enfeksiyon riskini en aza indirmek için, lütfen William'ın mendilleri açtığında hayvanı parmaklarının değmediği kısımla temizlediğine dikkat edin. Böylece alanın temizliği maksimum düzeyde tutulur. İkinci olarak, mikropların abdominal yüzeye yayılmasını önlemek için sadece tek bir silme işlemi gerçekleştirir.

Tamam, harika. Şimdi alanı biraz temizleyeceğim ve cerrahi eldivenleri giyeceğiz.Tamam.Tamam.Tamam. Şimdi fareyi açıp uterus kornularını çıkaracağım ve buna küçük bir cilt sıkıştırmasıyla başlayacağım.

Tam olarak anestezi altında olduğundan emin olmak için burada bir ayak parmağı sıkıştırma testi daha yapayım, tamamdır. Şimdi deriyi sıkıştırıp hafif bir kıvrım oluşturacağım, böylece kesmek benim için daha kolay olacak. Ve tekrar belirtmeliyim ki, herhangi bir kan damarına denk gelmemek için insizyonu hayvanın tam orta hattı boyunca yapmalıyız.

Genellikle deriyi bu şekilde keserim, ardından ayırarak kası açığa çıkarırım. Bunu yaptıktan sonra, kastaki orta hattı kolayca görebilirsiniz. Oldukça belirgindir.

Oradan biraz kas dokusu alacağım, kesiyorum. Bu büyüklükteki bir insizyon yeterlidir; daha fazlasını yapmak istemem. Ardından, kası ve cildi kaldırmak ve kenara çekmek için bu freer'ı kullanıyorum; daha sonra içeriye çok nazikçe bir prob yerleştirerek, freer'ı iki embriyonun arasına konumlandırmaya çalışıyorum, böylece onlara hiçbir zarar vermeden nazikçe dışarı çekebiliyorum.

Bazen diğerlerinden daha kolay olur. İşte oldu. Bu yüzden nazikçe çekip çıkarın ve bir kez geçirdiğimde, onları hafifçe dışarı itebilirim.

Embriyoları asla sıkmamak önemlidir; onları sadece yönlendirmek, hafifçe itmek istersiniz. Embriyoları çıkardıktan sonra, her zaman çok ıslak kaldıklarından emin olmak istiyorum. Kurumalarına izin vermemelisiniz.

Ve bakalım, burada tekrar freer'ımı kullanıyorum, etrafı yokluyorum. İşte oldu. Bu harika.

Bu nedenle, yumurtalıkları kontrol etmezseniz birini içeride bırakmak kolay olduğu için hepsini dışarı çıkardığımdan her zaman emin olmak isterim. Bu yüzden, yine çok nazikçe çekerim ancak bu sırada uç kısımdaki yumurtalıkları ararım ve onları görmeye çalışırım, işte tam buradalar. Ve bu hayvanda sadece küçük bir kırmızı doku kitlesi gibi görünüyor.

Ardından onları ters çevirin, geri gelip diğer tarafı kontrol edin; onları orada görebiliyorum. Bu yüzden nemli kalmalarını sağladığınızdan emin olun; artık hazırız. Belirtmek istediğim bir nokta şu ki, embriyoları çok nazikçe tutmalısınız ve sadece embriyoları tutmalısınız.

Kan damarlarının olduğu bölgeleri tutmayın; çünkü bu damarlar çok kolay zarar görebilir, bu da hayvanın kanamasına ve sağkalım oranının ciddi şekilde düşmesine neden olur. Bu nedenle, öncelikle DNA enjekte etmek istediğimiz embriyonun baş kısmının nerede olduğunu belirlemek isteriz. Bunu, hayvanı nazikçe döndürerek ventral kısımları inceleyerek yaparız.

Bu özel örnekte baş sağ tarafımda, kuyruk ise sol tarafıma yakın konumdadır. Orta hat bu pozisyondadır ve William, embriyoyu enjekte edebilmem için uygun bir şekilde konumlandırmaya devam edecek. Tıpkı sıçanlarda olduğu gibi, onları her zaman başı annenin sağ tarafında ve bana bakacak şekilde konumlandırırım.

Şimdi buna başlayacağım. Tamam, şurada sol taban direğini görebilirsiniz, birazcık hareket ettirirseniz orta hattı kesinlikle görebilirsiniz. David için uygun bir konumda olması adına bunu biraz döndürmeye çalışacağım.

Tamam, şimdi sol ventriküle enjeksiyon işlemine geçiyorum. Burada sol ventrikülün tamamen DNA ile dolduğunu görebiliyoruz. Bazı boyanın sağ ventriküle ve ayrıca buradaki üçüncü ve dördüncü ventriküllere yayıldığını görebiliriz.

Bu, başarılı bir enjeksiyonun iyi bir göstergesidir. Şimdi DNA'yı hücrelere elektroporasyon ile aktarma işlemine geçeceğiz. Buradaki önemli husus, hangi elektrodun pozitif kutup olduğunu bilmektir.

Buradaki mavi saplı olanın pozitif elektrot olduğunu ve bu tarafın, DNA'nın elektroporasyonla aktarılmasını istediğimiz tarafa yerleştirilmesi gerektiğini biliyoruz. Sol ventriküle DNA'nın çoğunu enjekte ettiğimiz için pozitif elektrodu bu şekilde sol tarafa yerleştireceğim ve ardından beş puls uygulayacağız; işlem bu kadar. Elektrotlar ile uterus arasındaki temasın iyi olması ve elektriksel pulsların iletiminin uygun gerçekleşmesi için elektrotların PBS ile tamamen ıslatılmış olması önemlidir.

Tamam, inceleme tamamlandığına göre artık boynuzları geri yerleştireceğim. Bunu yapmak için boynuzları çok nazikçe bir kenara kaydıracağım, aşağıya uzanıp kası ve deriyi kavrayacak ve yavaşça, nazikçe tekrar içeri iteceğim. Tamam, güzel.

Mesaneye dikkat edin. Diğer tarafı ben yapabilirim. Sonra yaptığımız şey, onları oraya yerleştirmek için hafifçe sallamaktır.

Onları nazikçe düzeltmek için fırçayı biraz kullanabilirim. Ardından 3 ml antibiyotik antimikotik ile yıkama yapacağım. Sütüre başlamadan önce tamamen uyuduğundan emin olmak için ayak parmağı sıkıştırma testi yapalım.

Ve bu iyi görünüyor. Henry Shine kullanacağım. Altı numara, cerrahi sütür.

Blok dikişleri yapmayı tercih ediyorum. Bunların daha dayanıklı olduğunu düşünüyorum. İğneyi oradan geçirerek, çekerek, üç kez sararak, ucu yakalayıp çekerek başlayacağız.

1, 2, 3, fazlalıkları kesin. Hat boyunca eşit aralıklarla ilerlemeye devam etmek ve sıkıca çekmek istersiniz. Kesi bittiği noktanın biraz ötesine geçip tekrar düğümlemeniz gerekir.

Ve şu an oraya yaklaşıyorum. Dokuyu veya deriyi biraz geriye çekin. Orada hafif bir kanama var.

Sorun olmayacaktır. Kanama olması durumunda -ki bu ara sıra gerçekleşir- yanımızda bir koter cihazı bulunduruyoruz ve bu cihaz kanamayı durdurmak için oldukça etkili çalışıyor.

Tamam, kesinin ötesine geçtim. Orada duracağım. İpi çekip çıkarın, bir halka oluşturun, üç kez döndürün, halkayı kavrayın ve aşağı doğru çekin.

Üç kez döndürün, halkayı kavrayın, içinden çekin ve fazlalığı kesin. İğneyi kesici-delici alet kutusuna atın. Ardından bir zımba kullanacağız.

Bu hayvan üzerinde yedi numara zımba kullanacağız. Fareler için yedi, sıçanlar için dokuz numara kullanırız.

Sadece deriyi kavrayın, biraz yukarı çekin ve klipslemeye başlayın. Klipsi tekrar kavrayın. İnsizyonun biraz ötesine kadar eşit aralıklarla ilerlemek istiyoruz ve bu şekilde uygun olur.

Tüm bölgeyi alkollü bir mendille silin. Ardından, herhangi bir ağrı hissetmediğinden emin olmak için ona buprenorfin enjeksiyonu yapacağız. Sağlıklı kaldığından ve herhangi bir ağrı çekmediğinden emin olmak için önümüzdeki birkaç gün boyunca onu izlemeye devam edeceğiz.

Tamam, şimdi buprenorfin enjeksiyonunu yaptığımıza göre, uyandığında kendini rahat hissetmesi için onu orijinal kafesine geri koyacağız, kafesi inkübatöre yerleştireceğiz ve tamamen uyanıp kuruması için yaklaşık 20 dakika orada kalmasını sağlayacağız. Sizlere plazmid DNA'nın in vivo in utero elektroporasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini gösterdik. Herhangi bir molekülü enjekte edebiliriz.

Bu DNA veya ilaçlar olabilir. Büyüme faktörleri de olabilir. Eğer bu moleküllerin hücrelere iletilmesi gerekiyorsa ve pasif difüzyon yoluyla geçmiyorlarsa, elektroporasyon gerekecektir ve bunun için moleküllerin yüklü olması gerekecektir.

Ancak temel olarak olasılıklar sınırsızdır. Hücrelere gen iletmek için kullanılan alternatif bir vektör örneği virüslerimizdir.

Geçmişte, glia hücrelerini DNA ile işaretlemek ve bunların nasıl bölünüp nöronlara dönüştüklerini, ardından kortekse nasıl göç ettiklerini göstermek için retrovirüsler kullandık; bu işlem hücrelerin bir virüsle işaretlenmesi, elektroporasyon uygulanması veya beyin gelişimini etkilemek için ilaçların veya diğer moleküllerin enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Bunu birkaç farklı teknikle inceleyebilirsiniz. Bunlardan biri, organotipik kesit kültürleri uygulayacağınız TimeLapse görüntülemedir.

Ardından, hücrelerin akıbetini bir mikroskop kullanarak takip edeceksiniz. Burada görebileceğiniz üzere, zaman 0.0. Lateral ventriküle çok yakın olan bir hücre kümesiyle başlıyoruz.

Zaman geçtikçe, hücrelerin ventriküler bölgeden dışarıya ve kortikal plakaya doğru göç etmeye başladığını görebiliriz. Ek olarak, farklı moleküllerin dağılımını incelemek veya bu farklı hücrelerin kaderini belirlemek için embriyoları fikse eder ve immünohistokimya uygularız. Bir diğer olasılık ise elektrofizyoloji yapmaktır.

Önce etiketli hücreleri belirleriz ve ardından bunların elektriksel özelliklerini inceleriz. Bugün bizlerle olduğunuz için teşekkürler. Uygulamalarımızdan keyif almanızı ve deneylerinizde başarılı olmanızı dileriz.

Herhangi bir sorunuz olursa bizimle iletişime geçmekten çekinmeyin. İyi şanslar dileriz.