E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

Merhaba, ben Krete Lab'den William Tis. Bugün, ben ve diğerleri size E 15 fare embriyolarının intrauterin enjeksiyonlarını göstereceğiz. Merhaba, benim adım Laura Elias.

Bugün size mikroenjeksiyon pipetlerini nasıl hazırlayacağınızı ve yapacağımız int ventriküler enjeksiyonlar ve elektroporasyon için pipetleri nasıl yükleyeceğinizi göstereceğim. Benim adım David Castaneda ve bugün fare embriyolarının in vivo in vivo utero enjeksiyonlarına yardımcı olacağım. Gelişmekte olan fare embriyolarının lateral ventrikülüne plazmit DNA'sı enjekte edeceğiz.

Bu embriyoların CE korteksini hedefliyoruz, böylece glial hücreler tarafından farklı moleküllerin ekspresyonunu elde ediyoruz ve bunlar daha sonra gelişimde Nöronlar haline gelecek. Bu rahim içi enjeksiyonları yaparken, kullanmanız gereken birkaç önemli araç var ve bunları size göstereceğim. Şimdi. Daha özgür, birkaç ek forseps kullanıyoruz.

Bir, tırtıklı bir çift ve ucunda küçük bir diş olan başka bir çift. Bir çift kanama durdurucu kullanıyoruz. Bu bir makas.

Ve sonra bu iki zımbayı kullanıyoruz. Bu, fareler için kullandığımız daha büyük olanlar. Bu, fareler için kullandığımız daha küçük olanı.

Yedi numara zımba kullanır ve bu dokuz numara zımba kullanır ve sadece yaylıdırlar. Burada ameliyatlara yardımcı olmak için kullandığımız bazı şeyler, üzerinde çift başlı basit bir fiber optik ışık kaynağı kullanıyoruz. Sıcak tutmak için oradan ısıtılmış suyu dolaştıran ısıtılmış bir ped kullanıyoruz.

Çalışma yüzeyi, BTX tarafından yapılan bu por elektroporasyon sistemini kullanıyoruz. Embriyoların ne kadar büyük, ne kadar büyük olduğuna bağlı olarak kullandığımız birkaç farklı boyutta küreğimiz var. Mavi taraf pozitif taraftır.

Tamam, fareler için bir iso flor buharlaştırıcı kullanıyoruz. Annenin ve embriyoların hayatta kalma oranımızı artırdığını bulduk. Aynı zamanda hayvanı çok hızlı ve çok kontrollü bir şekilde bilinç içine ve dışına çıkarmamızı sağlar.

Bu nedenle çok faydalı bulduk. Pekala, şimdi enjeksiyon pipetlerimize eğim vereceğiz. Ve bu çok önemlidir, böylece pipetiniz, DNA'nızı yükleyebilmeniz için yeterince büyük bir açıklığa sahiptir, ama aynı zamanda çok, çok keskindir, böylece enjekte ettiğinizde embriyoya zarar vermez.

Ve enjekte ettiğinizde embriyoya zarar verirseniz, çok daha yüksek bir ölüm oranına sahip olacaksınız. Ve bu, bu iyi değil. Yani bu aslında bu ameliyatta olduğu gibi çok önemli bir süreç.

Ve ilk olarak, burada dönen bu eğimli taşın üzerine biraz su koyacağız. Ve sonra, burada görelim, sadece bir, bir, bir çubuk alacağız. Ve az önce çektiğimiz pipetimizi bir bantla bu çubuğa yerleştireceğiz.

Ve bu mikro manipülatörlerden birini kullanarak pipeti eğim üzerinde tutacağız ve burada eğim vermesini sağlayacağız. Yani, sadece bunu yerleştirin ve pipetin ucunu görselleştirmek için mikroskop kullanıyoruz. Ve onu suyun tam altına, eğimin üzerine yerleştireceğiz, böylece biraz basınç olacak.

Ve burada taşın ucunun taşa baskı yaptığını görebilirsiniz. Ve en azından 15 dakika bir süre eğilmesine izin verin. Onları bir saatliğine bile olsa bırakmayı severim.

Bazen sadece, gerçekten çok keskin oluyorlar, ama pipetlerini ne kadar süre eğdiklerine kesinlikle kişiden kişiye değişiyor. Pekala, işte burada, üstte gördüğünüz gibi, henüz eğim verilmemiş çekilmiş bir pipetimiz var. Yani keskin olsa da, DNA'nızı yükleyebileceğiniz herhangi bir açıklığa sahip değil.

Şimdi alt pipet eğimlidir ve DNA'nızı yüklemenize izin verecek bu güzel açılı açıklığı görebilirsiniz, ancak yine de keskin bir ucu vardır, böylece herhangi bir hasar yaratmadan enjekte edebilirsiniz. Pekala, şimdi enjeksiyon pipetlerimizi DNA ile dolduracağız. Bu nedenle, DNA'nızı enjekte ederken lipopolisakkaritlerin hiçbirini enjekte etmemeniz için DNA'nızı endotoksin içermeyen bir şekilde hazırlamanız önemlidir.

Bu yüzden DNA'mızı alacağız ve aslında burada, paraformumuzu hazırlayacağız. Yani burada sadece paraformunuzu yapacaksınız ve DNA'nızı toplamak isteyeceksiniz ve bunu bu para filmine küçük bir nokta olarak yerleştirmek isteyeceksiniz. Ve sonra alacağız, bu yüzden genellikle DNA'mın her 10 mikrolitresini alırım, ki bunu genellikle bir mikrolitreden yaklaşık 1.5 ila 1.7 mikrogram olarak kullanırım.

Bu hızlı yeşil boyadan yaklaşık bir mikrolitre kullanacağım. Ve bu sadece enjeksiyonumuzu lokalize etmemize ve ventriküle başarılı bir şekilde enjekte ettiğimizden emin olmamıza yardımcı olmak için. Sonra bu hızlı yeşil boyayı DNA'mla karıştıracağım.

Sonra enjeksiyon elektrodunuzu alıyorsunuz ve biz sadece pistonu geri çekerek pipeti dolduruyor olacağız. Ve burada, pipetin doğru şekilde eğimli olup olmadığını ve yeterince büyük bir açıklığa sahip olup olmadığını, DNI'nin oldukça kolay bir şekilde yüklenmesi gerektiğini görebilirsiniz. Bazen, doğru şekilde yüklenmesine yardımcı olmak için pistonu ileri geri hareket ettirmeniz gerekir.

Ve böylece pipeti bu şekilde yükleyebilirsiniz. Ve böylece DNA'yı bu pipete tamamen yükledik ve enjeksiyona hazır. Tamam, şimdi hayvanı alkol ve iyotla yıkayacağım, ama tabii ki önce hayvanın tamamen altında olduğundan ve iyi göründüğünden emin olmak için bir ayak parmağını çimdiklemek istiyorum.

Böylece devam edebilir ve başlayabilirim. Ve ben tıpkı farelerde olduğu gibi başlıyorum, etanol ile başlayan üç tane seri yapıyoruz. Tamam, iyot.

Enfeksiyon riskini en aza indirmek için, William'ın mendilleri açtığında, hayvanı parmaklarının dokunmadığı kısımla temizlediğini lütfen unutmayın. Böylece alanın temiz olmasını en üst düzeye çıkarmak için. İkincisi, mikropların karın yüzeyine yayılmasını önlemek için sadece bir silme işlemi yapar.

Tamam, harika. Şimdi biraz temizlik yapacağım ve cerrahi eldiven giyeceğiz. Tamam.Tamam.Tamam. Şimdi fareyi açacağım ve rahim boynuzlarını çıkaracağım ve buna küçük bir deri tutamıyla başlayacağım.

Tamamen altında olduğundan emin olmak için burada bir ayak parmağını daha çimdiklememe izin verin ve bu iyi. Bu yüzden cildi çimdikleyeceğim ve orada yapışacak küçük bir dalgalanma yapacağım, bu da kesmemi kolaylaştırıyor. Ve yine, herhangi bir kan damarından kaçınmak için kesiyi hayvanın orta hattı boyunca yapmak istiyoruz.

Genelde cildi bu şekilde keser ve ayırırım ve kası ortaya çıkarırım. Ve bunu bir kez yaptıktan sonra, kasın içindeki orta çizgiyi kolayca görebilirsiniz. Çok tanımlı.

Orada biraz kas alacağım, keskin nişancı Ve bu iyi boyutta bir kesi. Bundan daha büyük bir şey yapmak istemezdim. Ve sonra bu serbestleştiriciyi sadece kası ve deriyi kaldırmak için kullanıyorum, yana doğru çekiyorum, ve sonra burada çok nazik bir sonda yapıyorum ve serbesti iki embriyonun arasına, iki embriyonun arasına yerleştirmeye çalışıyorum, böylece onları hiç zarar vermeden nazikçe çekip çıkarabiliyorum.

Bazen diğerlerinden daha kolaydır. İşte başlıyoruz. Bu yüzden sadece nazikçe çekin ve bir kez geçtiğimde, onları bir nevi dışarı itebilirim.

Embriyoları asla çimdiklememek önemlidir, ama sadece onlara rehberlik etmek istersiniz, sadece onları bir tür dürtmek istersiniz. Ve onları bir kez çıkardığınızda, onları her zaman çok ıslak tuttuğunuzdan emin olmak istiyorum. Kurumasına izin vermek istemezsiniz.

Ve bakalım, burada tekrar freer'ımı kullanıyorum, etrafı araştırıyorum. İşte başlıyoruz. Mükemmel.

Ve bu yüzden her zaman hepsini dışarıda bulundurduğumdan emin olmak isterim çünkü yumurtalıkları kontrol etmezseniz bir tanesini orada bırakmak kolaydır. Bu yüzden onları her zaman çok nazikçe tekrar çıkarırım, ama sonunda yumurtalıkları arar ve görürüm, ki bu tam oradadır. Ve bu hayvanda küçük bir kırmızı doku kütlesi gibi görünüyor.

Ve sonra onları ters çevirin, geri dönün ve diğer tarafı kontrol edin ve onları orada görebiliyorum. Bu yüzden onları nemli tuttuğunuzdan emin olun ve biz gitmeye hazırız. Belirtmek istediğim bir şey şu: Yapmıyorsunuz, embriyoları çok nazikçe tutmalısınız ve sadece embriyoları tutmalısınız.

Kan damarlarının olduğu yere tutmayın çünkü olacaklar, çok kolay zarar görebilirler ve olacaklar, hayvan kanama geçirecek ve hayatta kalma oranı önemli ölçüde düşecektir. Belirlemek istediğimiz ilk şey, DNA ile enjekte etmek istediğimiz embriyonun başının nerede olduğudur. Bunu, hayvanı nazikçe döndürerek ve ventral kısmına, her bir ventral parçaya bakarak yapıyoruz.

Bu özel örnekte, baş sağımda ve kuyruk soluma yakın. Orta hat bu pozisyonda ve William embriyoyu uygun şekilde konumlandırmaya devam edecek, böylece tıpkı sıçanlarda olduğu gibi enjekte edebilirim. Onları her zaman başı açık, annenin sağ tarafı bana bakacak şekilde konumlandırırım.

Ve şimdi buna başlayacağım. Tamam, orada sol zemin direğini görebilirsiniz, biraz hareket edin ve kesinlikle orta çizgiyi tam orada görebilirsiniz. David için iyi bir konumda olması için biraz döndürmeye çalışacağım.

Tamam, ve şimdi sol ventrikülü enjekte etmeye devam edeceğim. Burada sol ventrikülün tamamen, tamamen DNA ile dolu olduğunu görebiliriz. Burada bazı kalıpların sağ ventriküle ve ayrıca üçüncü ve dördüncü ventriküllere yayıldığını görebiliriz.

Bu, iyi enjeksiyonun iyi bir göstergesidir. Şimdi DNA'yı hücrelere elektro olarak aktarmaya devam edeceğiz. Burada önemli olan husus, hangi elektrotun pozitif taraf olduğunu bilmektir.

Buradaki mavi saplı olanın pozitif elektrot olduğunu ve bu tarafın DNA'nın elektroporasyonunu yapmak istediğimiz tarafa gitmesi gerektiğini biliyoruz. Yani, sahip olduğumuza göre, DNAI'nin çoğu ile sol ventriküle enjekte ettik, pozitif elektrodu sol tarafa bu şekilde konumlandıracağız ve sonra beş darbe uygulayacağız ve hepsi bu. Elektrotlar ile rahim arasındaki temasın iyi olması ve elektrik darbelerinin iletiminin uygun olması için PBS'de elektrotların tamamen ıslak olması önemlidir.

Tamam, şimdi keşif tamamlandığına göre, devam edeceğim ve boynuzları tekrar içeri koyacağım. Ve bunu nasıl yapacağım, boynuzları çok nazikçe bir tarafa hareket ettireceğim, buraya uzanacağım ve kasları ve cildi tutacağım ve nazikçe, nazikçe oraya geri döneceğim. Tamam, güzel.

Mesaneye dikkat edin. Diğer tarafı da yapabilirim. Ve sonra yaptığımız şey, onları oraya bir şekilde yerleştirmek için onu biraz sallamak.

Onları nazikçe düzleştirmek için biraz daha serbest kullanabilirsiniz. Ve sonra yapacağım şey üç mil antibiyotik antimikotik ile yıkamak. Dikiş atmaya başlamadan önce tamamen dışarıda olduğundan emin olmak için ayak parmağınızı çimdikleyelim.

Ve bu iyi görünüyor. Henry Shine'ı kullanacağım. Altı numara, cerrahi sütür.

Ben blok dikiş yapmayı tercih ediyorum. Bence daha iyi dayanıyorlar. Ve sadece iğneyi oradan geçirerek başlayacağız, çekeceğiz, üç kez saracağız, ucunu tutacağız, çekeceğiz.

1, 2, 3, fazlalığı kesin. Bu yüzden çizgiden aşağı inmeye devam etmek, eşit boşluk bırakmak ve sıkıca çekmek istiyorsunuz. Ve kesiğin durduğu yerin hemen ötesine geçmek ve tekrar bağlamak istiyorsunuz.

Ve şimdi buna yaklaşıyorum. Dokuyu geriye veya cildi biraz geriye çekin. Orada biraz kanama var.

İyi olmalı. Kanama ihtimaline karşı etrafta bir koterizatör bulunduruyoruz, bu ara sıra oluyor. Ve koterizatör bunu durdurmak için iyi çalışıyor.

Yani, tamam, kesiğin ötesindeyim. Orada duracağım. Çekin, bir halka yapın, üç kez döndürün, halkayı tutun ve aşağı çekin.

Üç kez döndürün, halkayı tutun, içinden çekin ve fazlalığı kapatın. İğneyi keskin uçlara sokun. Ve sonra bir zımba kullanacağız.

Bu hayvanda yedi numara zımba teli kullanacağız. Fareler için yedi kullanıyoruz. Sıçanlar için dokuz.

Sadece cildi tutun, biraz yukarı çekin ve kırpmaya başlayın. Klibi tekrar alın. Kesiğin biraz ötesine kadar eşit aralıklarla gitmek istiyoruz ve bu iyi bir şey.

Tüm alanı alkollü bir mendil ile takip edin. Ve sonra ona bir buprenorfin iğnesi yapacağız ki herhangi bir acı yaşamadığından emin olsun. Ve sağlıklı kaldığından ve herhangi bir acı çekmediğinden emin olmak için önümüzdeki birkaç gün boyunca onu izlemeye devam edeceğiz.

Tamam, şimdi ona bir buprenorfin enjeksiyonu yaptığımıza göre, uyandığında kendini rahat hissetmesi için onu orijinal kafesine geri koyacağız, kuvöze koyacağız ve tamamen uyanana ve kuruyana kadar 20 dakika kadar orada kalmasına izin vereceğiz. Size in vivo in utero, plazma elektroporasyonu, DNA'nın nasıl gerçekleştirileceğini gösterdik. Herhangi bir molekülü enjekte edebiliriz.

Ekose D olabilir veya uyuşturucu olabilir. Büyüme faktörleri ölür. Bu moleküllerin hücrelere iletilmesine ihtiyacınız varsa ve pasif difüzyondan geçmezlerse, elektroporasyona ihtiyacınız olacak ve bunun için moleküllerin yüklenmesi gerekecektir.

Ama temelde olasılıklar sınırsızdır. Genleri hücreye iletmek için alternatif bir vektör örneği. Virüslerimiz.

Ve geçmişte retrovirüsleri gls'yi DNA ile etiketlemek için kullandık ve nasıl bölündüklerini ve nöron haline geldiklerini gösterdik, hücreleri bir virüsle etiketledikten veya elektroporasyon kullandıktan sonra kortekse göç ettiler veya beynin gelişimini etkilemek için ilaçlar veya başka moleküller enjekte ettiniz. Bunu birkaç teknikle inceleyebilirsiniz. Bunlardan biri, organotipik dilim kültürleri yapacağınız TimeLapse yapmaktır.

Ve sonra bir mikroskop kullanarak hücrelerin kaderini takip edeceksiniz. Burada gördüğünüz gibi, zaman 0.0. Lateral ventriküle çok yakın olan bir hücre kümesi ile başlıyoruz.

Ve zaman geçtikçe, hücrelerin ventriküler bölgeden kortikal plakaya doğru göç etmeye başladığını görebiliriz. Ek olarak, embriyoları düzeltiyoruz ve immünohistokimya yapıyoruz, bilirsiniz, farklı moleküllerin dağılımını incelemek veya bu farklı hücrelerin kaderini belirlemek için. Başka bir olasılık da elektrofizyoloji yapmaktır.

Etiket hücrelerini tanımlıyoruz ve ardından elektriksel özelliklerini inceliyoruz. Bugün bizimle olduğunuz için teşekkür ederiz. Gösterilerimizden keyif alacağınızı ve deneylerinizi yapmakta başarılı olacağınızı umuyoruz.

Herhangi bir sorunuz varsa, hissedin, bizimle iletişime geçmekten çekinmeyin. Biliyorsun, iyi şanslar.